转录因子X盒结合蛋白1参与视网膜色素上皮抗氧化防御机制

【目的】视网膜色素上皮(RPE)的氧化损伤在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的发病机制中起着核心作用。本研究旨在探讨内质网应激及其重要的转录因子X盒结合蛋白1(XBP1)在丙烯醛引起的RPE氧化损伤中起到的作用,从而为阐明ARMD的发病机制提供思路。【方法】用75μmol/L丙烯醛分别处理人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)2~24 h,观察内质网应激蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)及XBP1的表达。用XBP1 si RNA转染细胞,下调XBP1蛋白水平,用Western blot检测抗氧化基因Nrf2、SOD2在蛋白水平的表达;用DCF染色观察细胞活性氧产物(ROS)的产生;用TUNEL染色观察细胞凋亡改变。细胞用XBP1 si RNA或对照si RNA预处理后,加入丙烯醛,检测RPE细胞的凋亡情况。7只XBP1^(flox/flox)小鼠,一眼视网膜下注射Cre腺病毒,对侧眼视网膜下注射GFP腺病毒作对照。1周后取眼球。其中3只小鼠用TRIzol提取RPE的RNA,用实时RT-PCR法,检测XBP1的下游基因ERdj4和p58IPK在RNA水平的表达。另4只小鼠眼球作视网膜冰冻切片,观察腺病毒在视网膜下腔的表达,用免疫荧光染色法检测XBP1以及抗氧化基因Nrf2和SOD2在RPE的表达。【结果】丙烯醛分别处理RPE细胞2 h和4 h,GRP78的表达明显增加。处理6 h XBP1蛋白激活。XBP1表达的下调伴有抗氧化基因Nrf2和SOD2表达的减少,细胞内ROS的增加,并诱发细胞的凋亡。敲低XBP1以后丙烯醛对细胞的毒性作用明显增加。通过视网膜下注射Cre腺病毒成功转染XBP1^(flox/flox)小鼠RPE。与对照组相比,转染Cre腺病毒的小鼠RPE内的XBP1蛋白表达明显减少,RPE内的ERdj4和p58IPK RNA水平显著下调;抗氧化基因Nrf2和SOD2表达明显减少。【结论】丙烯醛作用于RPE细胞,激活内质网应激以及转录因子XBP1。抑制XBP1引起RPE内抗氧化基因表达的减少,ROS的产生增加,并且增加丙烯醛的细胞毒性。XBP1参与RPE细胞内抗氧化应激防御机制。

转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞在缺氧环境下grp78、EDEM表达及抗凋亡能力的影响

目的将X盒结合蛋白1基因以重组腺病毒为载体转染胚鼠海马神经干细胞,观察其在缺氧环境下是否可以使移植后干细胞内grp78、EDEM表达增加以及对干细胞抗凋亡能力的影响。方法取孕16d SD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增。将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞。选取未转染的神经干细胞标记为对照组、未转染组;选取转染后的神经干细胞标记为转染组。未转染组和转染组用CoCl2诱导缺氧,24h后WesternBlot检测3组神经干细胞中xbp-1,grp78,EDEM,bcl-2及bax表达,流式细胞术检测NSCs和XBP1-NSCs的凋亡情况。结果在缺氧条件下,与未转染组相比,转染组的grp78表达增加,EDEM表达水平上升,bcl-2水平上升,而bax水平下降(P<0.05);转染组神经干细胞凋亡程度较未转染组减轻(P<0.05)。结论可以利用重组腺病毒作为载体成功将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞在缺血缺氧条件下grp78、EDEM水平上升,抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。

腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞增殖及在缺氧环境下凋亡的影响

目的:以重组腺病毒为载体,将X盒结合蛋白1基因转染胚鼠海马神经干细胞,观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下的抗凋亡能力。方法:取孕16dSD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增;将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞,选取普通神经干细胞标记为对照组,转染后的神经干细胞标记为转染组。通过细胞计数和MTT比色法检测对照组和转染组的增殖情况,连续检测7d,绘制生长曲线;取两组神经干细胞用CoCl2诱导缺氧,流式细胞术检测对照组和转染组的凋亡情况。结果:转染组的胚鼠海马神经干细胞增殖能力明显增强(P<0.05);在缺氧条件下,转染组神经干细胞凋亡程度较缺氧对照组减轻(P<0.05)。结论:利用重组腺病毒作为载体成功可以将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞增殖能力和在缺血、缺氧条件下抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。

狼疮肾炎患者外周血B细胞中X-盒结合蛋白1的表达和临床意义

目的检测狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)患者和健康者外周血CD19+B细胞中未剪接型X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1 unspliced,XBP1u)和剪接型X盒结合蛋白1转录因子(X-box binding protein 1spliced,XBP1s)mRNA的表达,并探讨XBP 1在LN患者的临床意义。方法应用实时荧光定量PCR技术检测65例LN患者和30名健康对照组外周血CD19+B细胞中XBP1u、XBP1s的表达水平,用流式细胞术检测外周血中CD19−CD138+浆细胞/CD19+B细胞比例,分析LN患者XBP1表达与B细胞亚群及临床相关指标的相关性。结果(1)LN组CD19+B细胞活动期组中XBP1u mRNA的表达水平为(0.078±0.034),高于健康对照组的(0.035±0.011)(P<0.05)、高于稳定期组的(0.049±0.016)(P<0.05);LN组CD19+B细胞活动期组中XBP1s mRNA(0.076±0.037),高于健康对照组的(0.022±0.010)(P<0.05)、高于稳定期组的(0.043±0.017)(P<0.05);(2)LN组中CD19−CD138+浆细胞/CD19+B细胞比例活动期组为(0.059±0.024),显著高于健康对照组的(0.034±0.011)(P<0.01)、活动组(0.059±0.024)高于稳定组的(0.073±0.036)(P<0.05);(3)LN患者XBP1u、XBP1s表达与CD19−CD138+浆细胞/CD19+B细胞比例呈正相关(r值分别为0.138、0.036),与抗双链DNA抗体、系统性红斑狼疮疾病活动性指数评分值呈正相关(r值分别为0.417、0.058),与血红蛋白、补体C3呈负相关(r值分别为−0.559、−0.219)。结论(1)LN患者外周血单个核细胞中XBP1u、XBP1s mRNA在活动组中表达量较健康组增加,且与系统性红斑狼疮疾病活动性指数评分值及抗双链DNA抗体呈正相关;(2)XBP 1在LN患者B细胞中表达升高,与浆细胞明显相关,提示XBP 1可能通过促进B细胞分化而参与LN的发病。

电针对帕金森病大鼠中脑黑质转录活化因子6和转录因子X盒结合蛋白1 mRNA表达的影响

目的:观察电针"风府""太冲"穴对鱼藤酮诱导的帕金森病(PD)大鼠中脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)、α-突触核蛋白(α-syn)、转录活化因子6(ATF6)和转录因子X盒结合蛋白1(XBP-1)表达的影响,探讨电针改善PD运动迟缓的机制。方法:SD大鼠随机分为对照组、模型组、电针组,每组12只。颈背部皮下注射鱼藤酮制备PD模型。电针组电针"风府"和双侧"太冲"穴,20 min/次,每日1次,连续治疗14 d。采用敞箱实验检测各组大鼠行为学改变,免疫组织化学法检测各组大鼠中脑黑质TH和α-syn的表达水平,实时荧光定量PCR法检测各组大鼠中脑黑质ATF6和XBP-1 mRNA的表达水平。结果:与对照组比较,模型组大鼠自主运动的总路程、平均速度、运动总时间显著降低,休息总时间显著升高,中脑黑质TH阳性表达水平显著降低,α-syn阳性表达水平显著升高,ATF6和XBP-1 mRNA表达水平显著升高(均P<0. 01);与模型组比较,电针组大鼠自主运动的总路程、平均速度、运动总时间显著升高,休息总时间显著降低,中脑黑质TH阳性表达水平显著升高,α-syn阳性表达水平显著降低,ATF6和XBP-1 mRNA表达水平显著降低(均P<0. 01)。结论:电针能有效改善PD大鼠的运动迟缓,提高中脑黑质TH的阳性表达水平,该效应可能与电针降低中脑黑质异常聚集的α-syn,下调未折叠蛋白反应信号通路中ATF6、XBP-1的转录活性有关。

泥蚶转录因子c-Myc与下游ATP结合盒转运蛋白基因ABCA3启动子的结合鉴定

为了确定泥蚶转录因子c-Myc(Tgc-Myc)与下游ATP结合盒转运蛋白ABCA3(TgABCA3)基因启动子的结合关系。利用在线生物信息学网站预测以及凝胶电泳迁移(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)技术,对Tgc-Myc与TgABCA3启动子的结合位点进行分析。结果显示,TgABCA3启动子上的E-box顺式作用元件位于-40~-35 bp,Tgc-Myc能够与该序列特异性结合。转录因子Tgc-Myc通过调控TgABCA3基因转录,从而参与泥蚶应对重金属Cd胁迫的响应机制。

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定(英文)

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.

X盒结合蛋白1对脂多糖处理的Kupffer细胞炎性因子表达的影响

目的探讨X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理的Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)TNF-α表达的影响。方法将BALB/c小鼠KCs随机区组法分为质粒组、阴性组和空白组。分别给予XBP1-shRNA、空白质粒转染和空白处理,并给予LPS。免疫细胞化学(SABC法)、Real-time PCR和Westernblot法检测各组KCs中XBP1基因及蛋白表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)检测核因子NF-κB活性及培养上清液中TNF-α含量。结果与阴性组、空白组相比,质粒组XBP1及下游因子TNF-α表达明显降低(P<0.05);而阴性组、空白组间比较比较无明显差异(P>0.05)。3组间NF-κB活性比较无明显差异(P>0.05)。结论 XBP1-shRNA质粒能明显抑制KCs XBP1基因的表达,并通过非NF-κB通路减少其下游因子TNF-α的释放。

GA结合蛋白转录因子亚基β1的反义RNA对过氧化氢诱导的大鼠脑微血管内皮细胞损伤的影响

目的探讨GA结合蛋白转录因子亚基β1的反义RNA(GABPB1-AS1)对过氧化氢(H2O2)诱导的大鼠脑微血管内皮细胞损伤的影响及可能机制。方法体外培养大鼠脑微血管内皮细胞,分为对照(Con)组、模型(Model)组、A组(Model加用si-NC)、B组(Model加用si-GABPB1-AS1)、C组(Model加用si-GABPB1-AS1及anti-miR-NC)和D组(Model加用si-GABPB1-AS1及anti-miR-101-3p)。RT-qPCR检测细胞中GABPB1-AS1和miR-101-3p表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)、活化的半胱天冬酶3(Cleaved-caspase 3)和活化的半胱天冬酶9(Cleaved-caspase 9)蛋白表达,试剂盒检测上清液中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平及细胞中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平。采用双荧光素酶报告基因实验验证GABPB1-AS1和miR-101-3p靶向调控关系。结果Con组、Model组、A组及B组GABPB1-AS1、miR-101-3p、细胞凋亡率、Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase 3、Cleaved-caspase 9、MDA、SOD、IL-1β和TNF-α水平差异均有统计学意义(F=724.541、450.866、368.481、154.595、107.850、103.824、62.514、371.871、210.219、1726.871、488.217,P<0.05)。与Con组比较,Model组细胞中GABPB1-AS1表达升高,miR-101-3p表达降低,细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9蛋白水平、MDA含量及IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平和SOD活性降低(P<0.05)。与A组和Model组比较,B组GABPB1-AS1表达、细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9蛋白水平、MDA含量及IL-1β和TNF-α水平降低,miR-101-3p表达、Bcl-2蛋白水平和SOD活性升高(P<0.05)。GABPB1-AS1靶向负调控miR-101-3p表达。与C组比较,D组细胞凋亡率、Bax、Cleaved-caspase 3和Cleaved-caspase 9蛋白水平、MDA含量及IL-1β和TNF-α水平升高(t=13.360、9.779、5.644、5.156、13.545、37.810、25.132,P<0.05),Bcl-2蛋白水平和SOD活性降低(t=9.311、12.752,P<0.05)。结论干扰GABPB1-AS1可能通过上调miR-101-3p表达抑制H2O2诱导的大鼠脑微血管内皮细胞凋亡、氧化应激反应及炎症因子表达。

川西獐牙菜醇提物上调HepG2细胞膜转运蛋白MRP3、核转录因子SP1及核受体CPF、PXR表达

目的体外培养HepG2细胞观察川西獐牙菜醇提物(Swertia mussitii Franch)对多药耐药相关蛋白3(multidrug resistance protein 3,MRP3)、核转录因子SP1(specificity protein 1 transcription factor,SP1)及核受体孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)、CYP7A启动子结合因子(CYP7A promoter-binding factor,CPF)表达的影响。方法用MTT比色法检测川西獐牙菜醇提物的最佳作用浓度,再分别于0、12、24、48、72h刺激HepG2细胞,抽提细胞的RNA、总蛋白和核蛋白,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测膜转运蛋白MRP3、转录因子SP1及核受体PXR、CPF在转录与蛋白水平的表达变化。每个时间点设立阴性对照DMSO组和阳性对照熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)组。结果川西獐牙菜醇提物可显著诱导HepG2细胞膜转运蛋白MRP3的mRNA和蛋白水平的高表达,其作用强于UDCA(P<0.05)。川西獐牙菜醇提物也可明显上调核转录因子SP1及核受体PXR的mRNA和蛋白表达水平,作用强于UDCA。对CPF表达的上调作用与UDCA相当(P<0.05)。结论川西獐牙菜醇提物可刺激HepG2细胞膜转运蛋白MRP3上调,且有可能是通过核转录因子SP1及核受体PXR、CPF上调其表达。

核心结合因子α1对人牙本质基质蛋白1基因转录活性的作用

目的:观察核心结合因子α1(core binding factorα1,Cbfα1)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,HDPSCs)牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)基因转录活性的影响。方法:将pCMV-Osf2瞬时转染至体外矿化诱导的HDPSCs中,检测转染后不同时间Cbfα1蛋白的表达变化。将不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体与pCMV-Osf2分别共转染至细胞中,报告基因检测系统检测荧光素酶活性。结果:诱导后的HDPSCs中少量表达Cbfα1,在瞬时转染Cbfα1后,蛋白主要表达于细胞胞质中,并且在转染48 h后表达量达到最高值;Cbfα1可明显增强6个不同长度的DMP1基因启动子片段重组报告基因载体的荧光素酶活性,以pGL3-P-505～+86启动子活性增强最为明显(P<0.05)。计算机分析结果发现,DMP1基因启动子-505～+86 bp区存在Cbfα1的结合位点。结论:Cbfα1可上调人DMP1基因转录活性,是HDPSCs向成牙本质细胞方向分化重要的调节因子之一,DMP1基因启动子序列-199～-185 bp区可能是Cbfα1结合位点。

人类X盒结合蛋白1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的:将以构建的未剪接型X盒结合蛋白1(XBP1u)的原核表达,纯化及人XBP1多克隆抗体的制备.方法:重组质粒pET32a-XBP1u转化入宿主菌E.coliBL2l(DE3),在IPTG诱导下表达,经SDS-PAGE鉴定正确后,用Ni2+-NTA柱式亲和层析法纯化蛋白,将纯化后的目的蛋白经透析袋复性后进行蛋白质定量,再以此蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,末次免疫后心脏取血,采用ELISA法检测抗血清效价;免疫印迹和免疫组化法检测兔抗XBP1u血清的特异性.结果:XBP1u蛋白为包涵体表达,包涵体裂解后经过纯化、复性进行免疫,得到抗血清的效价大于1∶64000,免疫印迹结果出现特异Mr33×103XBP1u条带,免疫组化法在兔肝细胞中成功检测到XBP1u的表达.结论:成功表达和纯化人XBP1u蛋白,并得到高特异性、高效价兔抗XBP1u多克隆抗体.

X-盒结合蛋白1的生理及病理生理学作用

X-盒结合蛋白1(XBP-1)是未折叠蛋白反应的重要组分,有剪接型XBP-1(XBP-1S)和非剪接型XBP-1(XBP-1U)两种形式。当细胞处于内质网应激状态时,XBP-1由活化转录因子6(ATF6)诱导,经IRE1α非传统剪接,转录有功能的XBP-1S,活化未折叠蛋白反应。XBP-1是一种重要的转录因子,对细胞生长和分化具有重要调控作用,并与人类多种疾病的发生和发展相关。

X盒结合蛋白1在高迁移率族蛋白B1诱导内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨活化的X盒结合蛋白1(XBP1)在高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导人脐静脉血管内皮细胞凋亡中的作用及机制。方法体外培养人脐静脉血管内皮细胞,将其分为正常对照组、HMGB1刺激组和慢病毒干扰+HMGB1刺激组(即XBP1基因被沉默后加入HMGB1)。采用RT-PCR检测剪切型XBP1(s XBP1)的基因表达水平,Western blot检测Caspase-3的蛋白表达水平,细胞荧光染色检测内皮细胞凋亡。结果与正常对照组比较,HMGB1刺激组s XBP1的基因表达水平增加,Caspase-3的蛋白表达水平明显升高,细胞凋亡率明显增加(P均<0.05);与正常对照组比较,慢病毒干扰+HMGB1刺激组s XBP1的基因表达水平无明显改变,Caspase-3的蛋白表达水平、细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。与HMGB1刺激组比较,慢病毒干扰+HMGB1刺激组s XBP1的基因表达水平降低,Caspase-3的蛋白表达水平降低,细胞凋亡率降低(P均<0.05)。结论 XBP1对HMGB1诱导内皮细胞凋亡至关重要。

内质网应激通路需肌醇酶1α/X盒结合蛋白1在中性粒细胞弹力蛋白酶诱导的气道黏液分泌中的作用

目的·探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应在中性粒细胞弹力蛋白酶(neutrophil elastase,NE)诱导人气道上皮细胞黏蛋白5AC(mucin 5AC,MUC5AC)分泌中的作用及机制。方法·培养人气道上皮细胞HBE16,分别给予活性氧(reactive oxygen species,ROS)抑制剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)、ERS抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyrate,4-PBA)预处理,或分别转染需肌醇酶1α(inositol-requiring kinase 1α,IRE-1α)小干扰RNA(siRNA)、X盒结合蛋白1(X-boxbinding protein 1,XBP-1)siRNA,再予以NE刺激;同时设单纯NE组和空白对照组。试剂盒检测ROS的生成水平;Westernblotting检测干预后ERS相关信号分子葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)、磷酸化蛋白激酶R样内质网激酶(phosphorylated protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,pPERK)、活化转录因子6(activating transcription factor 6,ATF6)、磷酸化IRE-1α(pIRE-1α)及XBP-1蛋白表达量的变化;实时荧光定量PCR检测剪切的XBP-1(XBP-1s)mRNA水平;ELISA和免疫荧光检测MUC5AC在各组细胞中的蛋白表达情况。结果·与空白对照组相比,NE刺激24 h后细胞ROS含量增加,GRP78、ATF6、pPERK及pIRE-1α蛋白水平均显著升高(均P<0.05),XBP-1s mRNA及蛋白表达也明显增加(均P<0.05),同时MUC5AC蛋白表达增加(均P<0.05);NAC及4-PBA预处理后均使上述ERS相关蛋白表达较单纯NE组降低(均P<0.05),MUC5AC蛋白水平降低(均P<0.05);转染IRE-1αsiRNA或XBP-1 siRNA,细胞中MUC5AC蛋白表达也较单纯NE组明显降低,同时XBP-1s mRNA及蛋白表达也有明显下降(均P<0.05)。结论·NE通过产生ROS引起ERS反应,诱导MUC5AC蛋白表达及分泌增加,ERS通路IRE-1α/XBP-1在其中发挥着一定的作用。

肿瘤坏死因子-α对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ATP结合盒转运蛋白A1表达的影响

目的:观察肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)表达的影响,同时探讨核因子-κB(NF-κB)在TNF-α调控ABC A1表达中的作用。方法:THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞随机分为4组:对照组、TNF-α组、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮(TPCK,NF-κB的抑制剂)组、TPCK+TNF-α组。运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和W estern b lot检测各组不同的时间点(0、6、12、24和48 h)ABCA1 mRNA和ABCA1蛋白的表达。结果:对照组和TPCK组ABCA1mRNA和蛋白表达均无明显变化;TNF-α组ABCA1mRNA和蛋白表达呈时间依赖性降低(P<0.05);TPCK+TNF-α组ABCA1mRNA和蛋白表达也呈时间依赖性降低,但同TNF-α组比较,其下降程度有明显减轻(P<0.05)。结论:TNF-α可以通过活化NF-κB抑制THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1的表达。

信号转导和转录激活因子3及小凹蛋白1在X射线诱导肺腺癌A549细胞早衰中的调控关系研究

目的:探讨信号转导和转录激活因子3(STAT3)和小凹蛋白1(Cav-1)在X射线诱导A549细胞早衰过程中的调控关系,完善X射线诱导A549细胞早衰的分子机制。方法:利用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测不同肿瘤细胞A875、BGC-823、A549细胞和正常细胞株Hacat细胞中STAT3和Cav-1蛋白表达水平,并检测X射线照射和STAT3过表达及抑制剂处理后A549细胞中p53蛋白、Cav-1蛋白表达水平。结果:肿瘤细胞A875、BGC-823、A549细胞及正常细胞Hacat细胞中STAT3、Cav-1蛋白呈现阳性表达;X射线照射A549细胞后p53蛋白表达增加,STAT3过表达及活化可引起p53蛋白表达水平升高,同时抑制Cav-1蛋白的表达。结论:X射线诱导的A549细胞p53蛋白早衰通路部分依赖于STAT3激活,STAT3负向调控Cav-1蛋白表达。

胰岛素样生长因子-1通过细胞外信号调节激酶1/2通路下调转录因子基本转录元件结合蛋白表达抗心肌细胞凋亡

目的探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠心肌细胞凋亡保护作用的基因调控机制。方法体外培养新生大鼠心肌细胞,10nmol/L IGF-1刺激的同时,分别加入磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和Raf-1 3条通路抑制剂(20μmol/L),通过RT-PCR及Western blotting方法观察IGF-1调节基本转录元件结合蛋白(BTEB)的基因表达及其通路调控。100μmol/L H2O2处理诱导心肌细胞凋亡,通过DNA梯度分析、Annexin V-FITC/PI双染色法、Caspase-3活性测定、Hoechest33258染色法观察用BTEB特异性siRNA人为下调BTEB基因表达后对心肌细胞凋亡的影响。结果大鼠心肌细胞经IGF-1刺激60min后,BTEB mRNA和蛋白表达均明显下降;与对照组相比,加入ERK1/2通路抑制剂PD98059组BTEB的mRNA和蛋白表达均明显增高(P<0.01);H2O2诱导的大鼠心肌细胞于下调BTEB表达后,DNA片段化改善,心肌细胞凋亡率下降(P<0.05),Caspase-3活性降低(P<0.05),凋亡小体减少,与IGF-1的抗心肌细胞凋亡效果相似。结论 IGF-1可以通过ERK1/2通路下调转录因子BTEB基因表达而发挥抗心肌细胞凋亡的作用。

在成骨细胞分化过程中调节Osterix转录因子表达和肿瘤坏死因子活性的同源异形盒蛋白Prx1的表达

肿瘤坏死因子（TNF-α）具有促使骨质疏松发生和抑制骨形成的作用,是骨节炎症中导致骨骼损伤的重要因子。成骨细胞（osteoblast,OB）来源于多能间充质细胞系,是骨形成的主要功能细胞,其按一定的路径分化为成熟骨细胞。Osterix（Osx,SP7）是一种OB分化所必需的转录因子。有实验证明如果机体缺乏该转录因子会导致骨骼软骨化。美国科学家的研究曾经报道过一种位于0sx启动子内的TNF抑制元件，这种抑制元件可以用于分离核蛋白，从而介导TNF-α发挥抑制OB分化的作用。

苦瓜蛋白通过肝X受体α上调三磷酸腺苷结合盒转运体A1表达

目的观察苦瓜蛋白对THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ABCA1)及肝X受体α(LXRα)表达的变化和细胞内胆固醇流出的影响,探讨苦瓜蛋白抗动脉粥样硬化的机制。方法加入50 mg/L的ox-LDL共同孵育细胞24 h,诱导THP-1单核巨噬细胞成泡沫细胞。分别加入0、0.5、1.5、4.5 mg/ml苦瓜蛋白或4.5 mg/ml苦瓜蛋白处理THP-1细胞0、3、6、12、24 h,以检测其浓度效用和时间效用。MTT法检测苦瓜蛋白的细胞毒性,液体闪烁计数法测胆固醇流出。实时荧光定量PCR和Western blot分别检测ABCA1、LXRα的mRNA和蛋白水平,设计合成LXRα-siRNA序列,并转染THP-1细胞,Western blot法评估沉默效果。结果苦瓜蛋白浓度低于4.5 mg/ml对THP-1细胞无毒性,并浓度和时间依赖性地促进胆固醇流出和上调ABCA1及LXRα表达水平,以4.5 mg/ml苦瓜蛋白作用效果最强;使用LXRα-siRNA沉默LXRα后,ABCA1的mRNA和蛋白表达水平均显著下降(P<0.05),胆固醇流出显著减少。结论苦瓜蛋白可通过LXRα途径上调ABCA1的表达促使THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出。