猪转录因子YY1基因克隆、序列特征及真核表达载体构建

YY1(Yin-Yang1,YY1)作为重要的转录因子对基因表达调控起到重要的作用。本研究旨在克隆猪YY1基因CDS区序列,利用生物信息学软件分析猪YY1基因编码蛋白的特性和功能。利用免疫荧光检测YY1在猪卵泡颗粒细胞中的定位;利用同源重组构建YY1真核表达载体,通过qRT-PCR及Western Blot(WB)检测YY1过表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中的表达效率。本研究成功克隆了猪YY1基因全长CDS区,生物信息学分析结果表明猪YY1蛋白由411个氨基酸组成,相对分子质量为44.3 kDa,为亲水性与酸性蛋白,无跨膜结构域与信号肽,二级结构主要含有α-螺旋(16.06%)、延伸链(19.71%)、β-转角(7.54%)和无规则卷曲(56.69%),YY1主要定位于细胞核,共含39个潜在的磷酸化位点,互作蛋白有EP300、E2H2、HDAC1、HDAC2等。免疫荧光检测发现YY1主要在猪原代卵泡颗粒细胞的细胞核中表达,qPCR和Western Blot检测结果显示该真核表达载体在猪原代卵泡颗粒细胞中成功表达。本研究为进一步探究猪转录因子YY1的生物学功能及提高母猪的繁殖率提供了理论依据。

转录因子YY1与肿瘤研究进展

转录因子YIN—YANG1（YY1），又称为δ、NF—E1、UCRBP、CF1，是锌指类转录因子GLl-Kruppel家族中一员。YY1是多功能蛋白，参与调控正常的生理过程，如发育、分化、复制和细胞增殖。YY1具有抑制和激活转录的双重功能，由于其在转录中的双重作用，YY1被称为阴阳因子1。

转录因子YY1对口腔鳞癌细胞ITGB6基因表达的影响

目的:研究肿瘤相关转录因子YY1对口腔鳞癌细胞整合素β6(integrinβ6,ITGB6)基因表达调控的影响。方法:用生物信息学方法预测分布在ITGB6启动子区域的转录因子YY1潜在的结合位点,构建萤光素酶报告基因质粒,利用双萤光素酶报告基因系统检测ITGB6启动子片段的转录活性;利用染色质免疫沉淀技术检测在天然染色质条件下转录因子YY1与ITGB6启动子的结合情况;采用定点突变方法检测YY1结合位点对ITGB6启动子活性的影响;利用RT-PCR方法检测过表达转录因子YY1对口腔鳞癌细胞ITGB6 mRNA表达水平的影响。结果:ITGB6启动子-421^-150 nt区域存在多个转录因子YY1潜在的结合位点。在口腔鳞癌细胞的天然染色质中,转录因子YY1结合于ITGB6启动子-421^-150 nt区域;定点突变YY1潜在结合位点对口腔鳞癌细胞中ITGB6启动子活性无显著影响。另外,过表达的YY1对口腔鳞癌细胞ITGB6 mRNA的表达水平也无影响。结论:转录因子YY1在口腔鳞癌细胞中结合于ITGB6基因启动子-421^-150 nt区域,但对ITGB6基因的基础转录水平无影响。

转录因子YY1与肿瘤的研究进展

Yin-Yang1(YY1)最初是作为病毒相关病毒P5启动子的阻抑因子被发现,随后发现其呵被腺病毒E1A癌蛋白逆转,表现为转录激活因子,因其具有抑制和激活的双重转录活性,故将其命名为“阴阳(YY)”。

外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平对妊娠期糖尿病不良妊娠结局的预测价值

目的 探究外周血单个核细胞YY1转录因子(YY1)、微小RNA(miR)-181a-5p表达水平对妊娠期糖尿病(GDM)不良妊娠结局的预测价值。方法 纳入2020年6月至2022年6月该院收治的GDM患者200例作为GDM组,选取同期产检健康孕妇100例作为对照组。采用荧光定量PCR检测外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平。绘制受试者工作特征(ROC)曲线,分析YY1、miR-181a-5p表达水平对GDM患者不良妊娠结局的预测价值。结果 与对照组比较,GDM组外周血单个核细胞中YY1、miR-181a-5p表达水平均下降(P<0.05),GDM组产后出血、巨大儿、新生儿低血糖的发生率均上升(P<0.05)。多因素Logistic回归分析显示,年龄、血糖控制不良是GDM患者妊娠不良结局的独立危险因素(P<0.05),外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平均是GDM患者妊娠不良结局的独立保护因素(P<0.05)。ROC曲线分析结果显示,外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平单独及二者联合预测GDM患者不良妊娠结局的曲线下面积(AUC)分别为0.717、0.751、0.832,其中联合预测的AUC明显高于二者单独预测(P<0.05)。结论 GDM患者外周血单个核细胞YY1、miR-181a-5p表达水平降低可增加不良妊娠结局的风险,YY1、miR-181a-5p与GDM患者不良妊娠结局的关系密切,二者均可作为GDM患者不良妊娠结局的预测因子。

YY1对胶质瘤细胞迁移能力的影响及其分子机制

目的探讨转录因子阴阳1(YY1)对胶质瘤细胞迁移的影响及其分子机制。方法体外培养人胶质瘤细胞U251和U87,对细胞过表达或敲低YY1后,通过Transwell实验、细胞划痕实验、克隆形成实验检测过表达或敲低YY1对胶质瘤细胞U251和U87迁移的影响;通过基因转录调控数据库(GTRD)预测YY1下游靶基因,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹实验检测YY1下游靶基因基质金属蛋白酶15(MMP15)mRNA及其蛋白的表达情况;利用双荧光素酶报告实验检测YY1与MMP15启动子的结合区域。通过Transwell实验、细胞划痕实验、克隆形成实验检测过表达HA-YY1的同时敲低MMP15对胶质瘤细胞U251和U87迁移的影响。结果Transwell实验结果表明,与未过表达HA-YY1的对照组相比,过表达HA-YY1组U251和U87细胞的迁移能力显著提高(t=13.300、5.847,P<0.05);划痕实验结果显示,过表达HA-YY1组U251和U87细胞的划痕间距较对照组明显变小(t=9.698、7.215,P<0.05);克隆形成实验结果显示,过表达HA-YY1组U251和U87细胞的克隆形成能力较对照组显著提高(t=5.871、5.095,P<0.05);双荧光素酶报告实验显示,YY1能够直接结合到MMP15的启动子区域,并促进MMP15的表达;而敲低MMP15可以抑制由于YY1过表达而促进的细胞迁移。结论YY1通过转录激活MMP15促进胶质瘤细胞迁移。

微小RNA-34a在紫草素抑制肺癌H1299细胞增殖和侵袭中的作用及其机制

目的探讨微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)在紫草素抑制肺癌H1299细胞增殖和侵袭中的作用及其机制。方法2019年9月至2020年3月,采用1、2.5和5 mg/L紫草素处理体外培养的肺癌H1299细胞后,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的存活率;平板克隆实验和Transwell实验分别检测细胞克隆形成能力和侵袭能力;RT-PCR检测细胞中miR-34a的表达情况。采用生物信息软件预测、双萤光素酶报告基因实验检测miR-34a与Yin Yang-1(YY1)的靶向关系。采用脂质体法转染miR-34a抑制剂和pcDNA3.1-YY1-GFP过表达质粒后,RT-PCR检测细胞中miR-34a的表达情况,蛋白质印迹法(western blotting)检测细胞YY1蛋白的表达,MTT法、平板克隆实验和Transwell小室实验观察下调miR-34a和上调YY1表达对紫草素处理的H1299细胞增殖和侵袭的影响。结果与0 mg/L紫草素相比,1、2.5和5 mg/L紫草素能够呈浓度依赖性抑制H1299细胞存活率、克隆细胞数[(127.63±7.38)、(108.85±6.34)、(91.72±6.15)比(156.55±9.06)]和侵袭细胞数[(93.12±5.56)、(75.25±4.68)、(59.85±3.20)比(116.00±7.85)],并促进miR-34a表达。生物信息软件预测到miR-34a与YY1存在互补的结合位点,双萤光素酶报告基因实验证实YY1是miR-34a的靶基因。下调miR-34a可逆转紫草素对H1299细胞增殖和侵袭的抑制作用,并促进YY1蛋白的表达,同时上调YY1表达可逆转紫草素对H1299细胞增殖和侵袭的抑制作用。结论miR-34a在紫草素抑制肺癌H1299细胞增殖和侵袭过程中发挥着积极作用,其作用机制可能与靶向调控YY1表达有关。

YY1转录因子诱导低氧乳腺癌外泌体中的circ_000543促进乳腺癌细胞增殖、侵袭

目的探讨低氧外泌体circ_000543对乳腺癌(breast cancer,BC)细胞增殖与侵袭的作用。方法借助生物信息学网站预测circ_000543在BC组织中的异常表达及可能对其进行调控的转录因子。使用双荧光素酶报告实验与ChIP实验验证YY1转录因子与circ_000543的调控关系。对BC细胞进行缺氧诱导,分离常氧BC细胞及缺氧BC细胞的外泌体,qRT-PCR检测circ_000543在外泌体中的表达。干预外泌体中circ_000543与YY1的表达,并与常氧条件下的BC细胞进行共培养。CCK8与Transwell分别检测细胞的增殖与侵袭能力。结果qRT-PCR实验发现,与MCF-10A细胞(1±0.11)和常氧细胞分离的外泌体(1±0.10)比较,circ_000543在BC细胞(1.59±0.13)及低氧细胞分泌的外泌体(1.63±0.12)中均表达上调(t=6.001,P=0.004;t=6.986,P=0.002)。缺氧细胞外泌体能促进常氧BC细胞的增殖与侵袭,敲减circ_000543后部分抵消外泌体的作用。YY1能作为转录因子促进circ_000543在BC细胞中的表达。敲减YY1后circ_000543的表达被抑制,同时也能抑制外泌体对BC细胞增殖与侵袭的作用。结论转录因子YY1诱导低氧细胞外泌体中的circ_000543进而促进BC细胞的增殖与侵袭。

鲍曼不动杆菌感染HeLa细胞与YY1互作的差异蛋白鉴定

[目的]鉴定鲍曼不动杆菌感染HeLa细胞前后与YY1互作的差异蛋白。[方法]用脂质体转染法在HeLa细胞中过表达YY1;之后用Co-IP技术捕获与YY1相互作用的蛋白质;最后利用高效液相色谱质谱联用技术鉴定互作差异蛋白。用GO注释和KEGG分析预测蛋白质的功能。[结果]经Co-IP和蛋白银染发现鲍曼不动杆菌感染组和YY1捕获组与IgG组比较在45~55 kDa和70~100 kDa处有明显的差异条带;质谱结果显示YY1捕获组的特有蛋白有81个,GO注释和KEGG分析表明这些差异蛋白定位于细胞核及核膜,具有RNA结合功能,主要参与了RNA剪切的生物学过程;与IgG组和YY1捕获组比较在鲍曼不动杆菌感染组中获得了SFRS4、CPSF2、LUC7L2和U2AF65这些差异蛋白。GO注释和KEGG分析表明这些差异蛋白定位于细胞核散斑,具有RNA结合功能,主要参与了mRNA剪切和核输出的生物学过程。[结论]鲍曼不动杆菌感染的HeLa细胞中与YY1作用的蛋白均参与了RNA剪切过程,提示鲍曼不动杆菌很可能利用这些蛋白来调节YY1,为进一步研究鲍曼不动杆菌与YY1的相互作用机制奠定了基础。

转录因子Yin—Yang1与肿瘤

Yin-Yang1（YY1）是一种具有双重转录活性的核转录因子，广泛分布于真核细胞中，调节多种基因的转录活性，在细胞生物学进程中发挥重要作用。近年来研究发现，YY1在多种肿瘤组织中有高表达，可能通过调控癌基因、抑癌基因、血管生成相关因子和抑制肿瘤细胞凋亡等途径促进肿瘤发生发展。提示YY1可能成为一种新的肿瘤标志物，将有助于判断肿瘤患者的预后及在肿瘤靶向治疗中取得新的突破。

慢病毒高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞的分化状态

背景:研究证实YY1主要在小鼠基底层未分化表皮细胞中表达,且随着表皮细胞向基底上层分化其表达逐渐下降,这种差异性表达方式说明YY1可能是表皮细胞分化过程中重要的调节因子之一。目的:采用慢病毒-YY1感染HaCaT细胞观察YY1过表达对细胞分化的影响。方法:将慢病毒-YY1感染至HaCaT细胞,经puromycin筛选,建立单克隆稳定细胞株,设对照组为慢病毒感染的HaCaT细胞和未感染的HaCaT细胞,Western blot检测分析YY1蛋白的表达水平;将慢病毒-YY1-HaCaT组和HaCaT-YY1组细胞各分成2组,一组在低钙(0.12 mmol/L)培养基条件下培养48 h,另一组在低钙(0.12 mmol/L)培养基条件下培养24 h后在高钙(0.35 mmol/L)培养基条件下再培养24 h,用Western blot法检测YY1过表达对HaCaT细胞分化中的表皮细胞特异性分化角蛋白K1、K10、K14和晚期分化产物外皮蛋白、中间丝相关蛋白、兜甲蛋白的影响。结果与结论:慢病毒-YY1成功感染HaCaT细胞,高钙条件下获得的单克隆细胞株过表达YY1蛋白,可抑制K1、外皮蛋白和兜甲蛋白的合成,从而阻止表皮细胞角质化进程并使细胞处于未分化状态。结果说明慢病毒可高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞,YY1可能是抑制基底表皮细胞分化并维持其未分化增殖状态的重要因子之一。

脂滴与PRRSV之间对抗与利用并存

猪肺泡巨噬细胞(PAMs)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)主要感染的天然宿主靶细胞,具有重要的免疫学功能。PRRSV感染PAMs后,通常劫持细胞内的各种生命系统为己所用并逃避宿主免疫系统的监管。而宿主细胞也会做出相应的对抗策略以抑制PRRSV复制进而主动清除病毒。近期,m Bio期刊在线发表了题目为“Host cells reprogram lipid droplet synthesis through YY1 to resist PRRSV infection”的研究论文,作者发现宿主细胞通过转录因子阴阳1(YY1)重编程脂滴(LD)抑制PRRSV复制的分子机制,有助于理解正常生理条件下LD与PRRSV之间对抗与利用并存的动态互作关系。