转录因子ZBTB20对垂体瘤侵袭发展的影响

目的研究转录因子ZBTB20在垂体瘤侵袭发展中的作用。方法首先通过免疫组织化学染色检测临床肿瘤样本中ZBTB20的表达情况;随后通过转染ZBTB20和sh-ZBTB20慢病毒建立ZBTB20过表达和敲减的GH3垂体瘤细胞系;通过CCK-8细胞增殖实验、划痕愈合实验检测ZBTB20对垂体瘤细胞增殖、侵袭能力的影响;同时通过蛋白免疫印迹(WB)、实时荧光定量PCR(qPCR)检测增殖侵袭相关基因表达的改变。结果免疫组织化学染色结果显示,侵袭性垂体瘤样本中ZBTB20表达量显著高于非侵袭性样本;ZBTB20过表达及敲减的GH3细胞系研究中,CCK-8细胞增殖实验、划痕愈合实验结果提示ZBTB20提高了GH3细胞的增殖能力和侵袭能力,WB和qPCR结果显示该作用与PCNA、MMP2、MMP14蛋白表达增加有关。结论转录因子ZBTB20与垂体瘤侵袭发展呈正相关,ZBTB20通过促进PCNA、MMP蛋白表达提高垂体瘤细胞增殖、侵袭能力,对深入理解垂体瘤侵袭发展机制、发掘潜在治疗靶点有重要意义。

野生大豆转录因子GsNAC20基因的分离及胁迫耐性分析

NAC(NAM,ATAF1/2,CUC2)转录因子作为一类新型转录因子已成为非生物胁迫基因工程领域的研究热点。本研究以野生大豆(Glycine soja)为材料,利用酵母单杂交的方法筛选到一个能够与MYB1AT元件(核心序列为AAACCA)结合的转录因子基因,该基因与大豆NAC20(EU440353.1)基因具有99%的相似性,命名为GsNAC20。GsNAC20蛋白含有典型的NAC结构域和转录激活区。酵母试验表明,GsNAC20转录因子能够与耐逆相关顺式元件MYB1AT特异结合,但不具有自激活功能。细胞定位分析证明该基因位于细胞核中,符合转录因子的特征。GsNAC20能够响应高盐、干旱和低温胁迫,并且在根和叶中具有不同的表达模式。超量表达GsNAC20基因的拟南芥对盐胁迫的敏感性提高。以上结果表明GsNAC20参与植物非生物胁迫反应过程,该基因在非生物胁迫基因工程研究领域具有良好的理论研究和实际应用价值。

加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织核转录因子-κB、锌指蛋白A20表达的影响

目的:观察加味小青龙汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺组织核转录因子-κB 65(NF-κB65)、锌指蛋白A20蛋白及其基因表达的影响。方法:Wistar大鼠按随机数字表法分为正常组、模型组、地塞米松和加味小青龙汤组。采用脂多糖气管滴注联合烟熏方法建立COPD大鼠模型,检测支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β含量,检测肺组织NF-κB65、A20蛋白及其基因表达,观察加味小青龙汤对上述指标及肺组织病理形态学变化的影响。结果:与正常组比较,模型组TNF-α、IL-1β、NF-κB和A20蛋白及其基因表达均明显上调;与模型组比较,加味小青龙汤组TNF-α、白介素-1β、NF-κB蛋白表达明显降低,加味小青龙汤组A20基因表达显著上调。病理观察结果显示,与正常组比较,模型组肺组织炎症细胞浸润,管腔中有大量中性粒细胞及黏液聚集,管壁明显增厚,胶原染色显示肺间质纤维组织大量增生;加味小青龙汤组肺组织病理改变明显轻于模型组,加味小青龙汤组肺组织少数呈轻度间质性肺炎,仅见少量的纤维组织增生。结论:加味小青龙汤能够减轻COPD模型大鼠肺组织损伤,对COPD模型肺组织有保护作用,其机理可能与其降低TNF-α和白介素-1β含量、下调NF-κB蛋白表达、上调A20基因表达有关。

膀胱癌细胞中锌指蛋白A20对核转录因子κB抑制的机制探讨

目的 为了探讨锌指蛋白A2 0在膀胱癌细胞中抑制核转录因子κB(NuclearTranscriptionFactorKappaB ,NF κB)作用的可能机制。方法 转染绿色荧光蛋白融合的A2 0质粒 (GreenFluorescentProteinfusedA2 0 ,GFP A2 0 )和A2 0显性失活突变体质粒 [GFP A2 0 (1- 36 8) ]入膀胱癌细胞T2 4 ,荧光显微镜观察质粒在细胞中表达情况 ,RT PCR检测肿瘤坏死因子受体I(Tu morNecrosisFactorReceptorⅠ ,TNFRⅠ )、核转录因子κB受体激活子配体 (ReceptorActivatorofNF κBLigand ,RANKL)、NF κB抑制蛋白ⅠκBα的mRNA表达变化。结果 转染 2 4h后 ,质粒在细胞中稳定表达 ,4 8h后表达继续增加。转染A2 0质粒或A2 0显性失活突变体质粒 2 4h及 4 8h后 ,TNFRⅠ和RANKLmRNA表达无明显变化 (P >0 .0 5 )。而在这两个时间点处 ,A2 0质粒转染可明显抑制细胞内ⅠκBαmRNA的表达 ;A2 0质粒处理组与未处理组之间、A2 0质粒转染组与显性失活突变体质粒转染组之间差异均有显著性 (P <0 .0 1)。结论 A2 0作用于TNFR的下游对NF κB起抑制作用 ,ⅠκBαmRNA可能作为NF κB报告基因受A2 0抑制。

幽门螺杆菌感染胃癌中CCL20核转录因子-κB表达的相互关系及临床意义

幽门螺杆菌（helicobacte pylori，HP）感染与胃癌的发生关系密切．是第一类致癌因素。但迄今为止其确切的致病和致癌机制尚不清楚。

甲状腺转录因子1细胞角蛋白7细胞角蛋白20联合检测在原发性肺腺癌和转移性肺腺癌中的诊断价值

肺,因血供丰富,常常是其它脏器恶性肿瘤转移最常见的部位之一,其中腺癌可能来自胃肠道、乳腺等,未知原发部位的转移性肺腺癌占所有肺癌的3%~5%[1]。一些腺癌转移至肺脏时仍然表达“原发组织器官特征”的标志物,借助有效的抗体组合可以进行鉴别诊断。最近的研究显示免疫组化标志物甲状腺转录因子1(TTF-1)、细胞角蛋白(CK)7、CK20在鉴别诊断中有价值。

A20人工锌指转录因子真核载体的构建及其对内皮细胞炎症反应的影响

目的观察A20基因的人工锌指转录因子(zinc finger-artificial transcription factor,ZF-ATF)对内源性A20基因及内皮细胞炎症反应的影响。方法根据人A20基因的序列,设计出其ZF-ATF,合成靶序列Oligo DNA,退火形成双链DNA,与通过BamHⅠ和KpnⅠ酶切后的载体连接产生ZF-ATF真核载体,质粒转化感受态细菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,限制性内切酶酶切鉴定,鉴定阳性克隆进行测序。质粒DNA转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cell,HUVEC),通过Western blot检测A20蛋白的表达,用脂多糖(LPS)诱导HUVEC细胞产生炎症反应,利用Western blot检测NF-κB p65的表达情况,利用ELISA检测TNF-α、IL-6、IL-8等的水平。结果限制性内切酶酶切鉴定与DNA测序证实合成的含ATF的真核载体寡核苷酸链插入正确,Western blot证实转染HUVEC后A20蛋白表达显著增加。ELISA法检测结果表明,在LPS刺激后,空载体组及空白组细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α表达均明显上调,而ZF-ATF转染组没有明显上调,与空载体组及空白组比较,有统计学差异(P<0.05,P<0.01);Western blot证实在LPS刺激后ZF-ATF转染组NF-κB p65的表达(19.8±4.5)较空载体组(90.2±5.9)及空白组(96.3±3.3)显著下调(P<0.01)。结论成功构建人工锌指转录因子真核表达载体,且能够启动内源性A20的稳定表达,并发挥其抗炎等作用。

转录因子Ets-2调控小鼠成釉细胞MMP-20基因表达的研究

目的:通过研究Ets-2转录因子对调控小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloproteinase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,进一步明确Ets-2在釉质发育中的作用。方法:应用免疫组化方法观察出生后5d小鼠切牙成釉细胞中Ets-2的表达;在小鼠成釉细胞中分别转染200ng pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2和Ets-2siRNA后,利用实时定量RT-PCR法检测MMP20基因表达的不同变化;用双荧光素酶报告基因检测系统分析Ets-2对MMP-20启动子突变后转录活性的影响。结果:免疫组化显示Ets-2在成釉细胞中呈阳性表达。实时定量RT-PCR研究发现Ets-2过表达后,MMP-20表达水平显著增加;当Ets-2基因沉默后,MMP-20表达水平则显著下降。双荧光素酶报告基因检测系统检测显示,转染pcDNA3.1/myc-HisA-Ets-2的实验组与对照组相比,MMP-20启动子的转录活性升高;对启动子Ets潜在结合部位进行定点突变后,MMP-20启动子的转录活性显著下降,Ets-2丧失上调MMP-20启动子转录活性的作用。结论:小鼠成釉细胞核中Ets-2可通过MMP-20启动子上Ets潜在结合位点,上调MMP-20基因表达水平。

转录因子Ets-1表达载体的构建及调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达

目的构建转录因子Ets-1的pcDNA331／myc-HisA真核表达载体，转染小鼠成釉细胞，检测Ets-1调控小鼠成釉细胞MMP-20的表达，为研究Ets-1在牙釉质发育过程中的重要作用奠定基础。方法以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得eDNA为模板，用RT-PcR法扩增得出含有kpnI和BamHI的Ets-1目的基因连接到pcDNA3．1／myc-HisA真核表达载体上。将重组质粒瞬时转染到小鼠成釉细胞中观察，并通过实时定量RT-PCR的方法检测MMP-20mRNA的相对表达量。结果①经过PCR引物扩增得到-约1399bp的基因片段，重组质粒pcDNA3．1／myc．HisA-Ets-l双酶切进行初步鉴定后，与GenBank登录基因对比显示生物公司测序结果完全正确。（爹重组质粒pcDNA3．1／myc-HisA-Ets-1转染小鼠成釉细胞后（以转染空载体pcDNA3．1／myc-HisA作为对照），实时定量RT-PCR检测MMP-20tuRNA的相对表达量上升明显。结论成功构建了Ets-1的真核表达载体，初步研究证明小鼠成釉细胞核中Ets-1可以上调MMP-20基因表达水平。

小鼠胚胎干细胞核心转录因子nanog靶基因Zbtb9的生物信息学分析

通过特异性引物用RT-PCR方法扩增Zbtb9基因。利用生物信息学对小鼠的Zbtb9基因启动子进行生物信息学分析,预测Zbtb9基因启动子位置和启动子区内含有的转录因子结合位点,以及nanog在Zbtb9基因转录调控中的作用及Zbtb9蛋白的基本性质。Zbtb9基因启动子区可能定位于转录起始点上游790 bp至1024 bp之间。启动子区内含有15个转录调控因子结合位点,nanog的作用靶序列位于Zbtb9基因启动子区与转录起始位点之间,提示nanog在Zbtb9基因转录调控中起作用,小鼠Zbtb9蛋白二级结构可能以螺旋为主,富含疏水性氨基酸;对Zbtb9基因疏水区的氨基酸进行跨膜区分析,提示可能是跨膜蛋白。经SMART分析,Zbtb9蛋白含有BTB/POZ结构域。

核转录因子NF-κB、A20蛋白与多种皮肤病相关性研究进展

皮肤是人体免疫系统的第一道屏障,皮肤病的发生、转归与免疫调节密不可分,随着对皮肤病发病机制的研究,越来越多的皮肤疾病与其易感因素得到了揭示,核转录因子NF-κB信号传导通路与锌指蛋白A20就是近年来研究的热点之一。NF-κB信号传导通路贯穿于机体多种生理、病理过程,如免疫反应的调节、炎症反应和肿瘤的转归等,它是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者,参与细胞生长、发育、凋亡等多种生理功能,A20通过负性调节NF-κB信号途径介导的细胞凋亡,研究两者与皮肤疾病的关系,对于探索皮肤疾病病因,为将来针对多种皮肤病寻找可能作用的靶点、研发基因治疗方案具有重要意义。本文通过总结近年来对NF-κB信号转导通路、A20的研究进展,综述两者与数种皮肤病关系。

转录因子c-fos/c-jun调控成釉细胞基质金属蛋白酶20基因的表达

背景:基质金属蛋白酶20是在成釉细胞中特异性表达的一种蛋白酶,其在牙齿釉质发育过程中具有重要作用。从分子角度研究基质金属蛋白酶20可受到的调控机制,为进一步做动物实验奠定基础。目的:通过研究转录因子c-fos/c-jun对小鼠成釉细胞基质金属蛋白酶20基因的调控作用,初步确定c-fos/c-jun在牙釉质发育中的作用。方法:首先构建c-fos真核表达载体重组质粒,分别利用双荧光素酶基因检测报告系统和定时定量RT-PCR法分析c-jun、c-fos转染成釉细胞对基质金属蛋白酶20基因活性的影响;并利用基因定点突变和双荧光素酶基因检测报告系统进一步分析c-jun、c-fos对基质金属蛋白酶20基因活性的影响。结果与结论:双荧光素酶基因检测报告系统和定时定量RT-PCR法分析显示c-jun、c-fos转染转染小鼠成釉细胞后,基质金属蛋白酶20基因表达显著上调;突变基质金属蛋白酶20启动子的AP1结合位点后,c-fos/c-jun失去上调基质金属蛋白酶20启动子的转录活性的作用。结果提示c-fos/c-jun对基质金属蛋白酶20基因表达具有重要的调节作用,表明其在釉质发育过程中有其重要的生物学意义。

转录因子JunB和JunD调控成釉细胞MMP-20基因转录活性的研究

目的通过研究转录因子JunB,JunD对成釉细胞中MMP-20基因表达的调控作用,从而进一步明确Jun家族在牙釉质形成中的影响。方法首先构建JunB和JunD真核表达载体重组质粒并瞬时转染重组质粒进入成釉细胞中;利用双荧光素酶基因检测报告系统分析不同浓度JunB,JunD对MMP-20启动子特征性序列区域的转录活性的影响;确定有明显作用的启动子区段,利用基因定点突变和双荧光素酶基因检测报告系统分析JunB对MMP-20基因启动子转录活性的影响;最后再观察JunB与JunD共转染时对MMP-20基因活性表达的改变。结果成功构建JunB,JunD真核重组表达载体,顺利将重组质粒转染入成釉细胞;双荧光素酶基因检测报告系统分析显示JunB对MMP20启动子活性表达上调,而JunD对MMP20启动子活性表达无作用;突变MMP20启动子AP1的两个结合位点后,MMP20启动子的转录活性下降,同时JunB也失去了上调MMP20启动子转录活性的作用。最后将JunB和JunD共转染时,在JunB存在的前提下,随着JunD转染量的增加,小鼠成釉细胞MMP20启动子转录活性明显减弱。结论该研究表明转录因子JunB与成釉细胞内MMP-20启动子的特征性序列相互作用,从而调控MMP20的表达水平;而JunD对MMP20启动子特征性序列无明显作用。所以为进一步研究Jun家族成员在釉质发育过程中的作用建立了重要的生物学基础。

锌指蛋白A20能够通过减少细胞因子信号3抑制基因表达来增强白细胞介素-6/信号转导与转录激活因子3增生信号并促进肝脏再生

肝脏再生是肝损伤、肝切除和移植中一个非常重要的临床生理过程。锌指蛋白A20作为一种有效的抗炎蛋白和核因子-κB（NF-κB）的抑制蛋白，已被证实在肝细胞中具有促增殖效应，而这种效应部分是通过减少细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂p21的表达来实现的。A20的C-末端（7-锌指；7Zn）和N-末端（Nter）在降低p21表达和抑制NF-κB分泌作用中都必不可少，但是它们各自也能独立引起肝细胞的增生，这说明除此之外还应有另外一种机制来解释A20在肝细胞中的促增殖效应。课题组研究发现A20可以通过减少细胞因子信号3抑制基因（SOCS3）的表达来增强白细胞介素-6（IL-6）诱导的信号转导与转录激活因子3（STAT3）磷酰化，从而促进肝细胞增殖。A20的这种新效应只与它的7Zn区域有关。相反的，A20的缺乏会导致SOCS3表达的增多，这会阻碍IL-6诱导的STAT3磷酰化进程。在小鼠肝切除再生模型中，A20的超表达会使得IL-6/STAT3信号通路下游的产物增加，而敲除A20基因后下游产物会明显减少。相对的，在A20缺乏的肝脏中IL-6/STAT3的促炎效应明显增强，而在A20过表达的肝脏中这种促炎效应则没有增强。在A20缺乏的肝脏中，位于SOCS3基因上游的调控RNA（miR203）表达显著降低。因此，研究者得出结论：A20通过下调SOCS3表达来增强IL-6/STAT3信号通路，从而促进肝细胞的增生，这种效应可能是基于miR203调控作用实现的。这项新发现可以结合已被证实的其他促增殖机制共同为进一步探索A20的促进肝脏再生和修复作用提供便利和理论依据。

抗新型锌指蛋白ZBTB20单克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备新型锌指蛋白ZBTB20的单克隆抗体,建立敏感和特异的ZBTB20免疫学检测方法,为其生物学功能研究提供技术支持。方法:将经ZBTB20多肽免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合,用ZBTB20的GST融合蛋白为包被抗原进行ELISA筛选,经4次亚克隆后建立稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备腹水并纯化抗体,鉴定其在免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化中的应用效果。结果:成功制备了8株抗ZBTB20单克隆抗体,在不同的免疫学检测中均得到成功应用,尤其是单克隆抗体9A10具有敏感性高、特异性好和通用性强等优点。结论:首次成功制备了ZBTB20单克隆抗体,可应用于免疫印迹、免疫沉淀和免疫组化等免疫学检测,对ZBTB20的功能研究具有重要意义。

锌指蛋白ZBTB20生物学功能的研究进展

锌指蛋白ZBTB20是ZBTB锌指蛋白亚家族的新成员,与已知的BCL6和PLZF同源。通过基因打靶小鼠和疾病人群研究,学者们发现ZBTB20在肝脏、胰岛、神经系统和免疫系统等多个器官与系统中具有重要生理学功能,是个体发育、学习记忆、痛觉感受、糖脂代谢等正常生理过程所必需的调节分子。ZBTB20表达或功能异常可导致个体发育障碍,与智障、肿瘤和代谢性疾病等多种重大疾病的病理生理过程密切相关。作为甲胎蛋白基因的主要转录抑制因子,ZBTB20在出生后肝脏甲胎蛋白基因的表达失活中发挥了关键性作用,且与肝癌预后密切相关。人群中ZBTB20基因的缺失与多种肿瘤有关,其点突变可导致Primrose综合征。本文就ZBTB20的生物学功能研究进展作一综述。

绿豆C3H和NBS转录因子家族成员鉴定及盐胁迫响应分析

NBS和C_(3)H是植物体内2个重要的转录因子家族,在调控植物抗病与耐盐方面不可或缺。本研究通过转录组数据分析、qRT-PCR分析,分别鉴定出30个和289个绿豆C_(3)H和NBS家族成员,2个基因家族各有13个基因受到纯化选择,并且C_(3)H和NBS基因家族种内共线性关系均为片段重复。耐盐材料的转录组数据分析结果表明,VrC_(3)H5、VrC_(3)H7、VrC_(3)H10和VrC_(3)H13等4个基因的表达量在盐胁迫后发生显著改变。VrC_(3)H5,VrC_(3)H7和VrC_(3)H133个基因对脱落酸(ABA)处理、氯化钠(NaCl)处理、干旱胁迫都有不同程度的响应,VrC_(3)H5在ABA处理后基因表达量上调超过了10倍。在NBS基因中,有85个基因在盐胁迫10 d和15 d后出现显著差异表达,其中9个NBS基因表达变化值|log_(2)FC|(FC为表达倍数变化)大于2。VrNBS20转录因子通过调控EVM0022385参与绿豆的耐盐功能,VrNBS20可能是绿豆抗病与耐盐调控网络中的交叉点。本研究结果为绿豆耐盐与抗病研究提供了丰富的基因资源。

MEF2C调控成釉细胞MMP-20基因启动子转录活性的研究

目的:通过研究MEF2C转录因子对小鼠成釉细胞金属基质蛋白酶-20(matrix metalloprotei-nase-20,MMP-20)基因表达的调控作用,明确MEF2C的功能,为研究MEF2C在釉质形成中的作用奠定基础。方法:用RT-PCR的方法扩增小鼠MEF2C基因,并构建真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA-MEF2C;对MMP-20基因启动子区域(-1197～+23)中MEF2C潜在的结合位点进行定点突变,并构建至荧光报告载体pGL3-Basic中;利用双荧光素酶基因报告系统分析MEF2C对MMP-20基因启动子转录活性的影响。结果:在成釉细胞中过量表达MEF2C能够明显提高MMP-20基因启动子的转录活性,而对定点突变后的MMP-20基因启动子转录调控作用减弱。结论:小鼠成釉细胞核中MEF2C可通过MMP-20启动子上MEF2C潜在的结合位点,上调MMP-20基因表达水平。

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)及其相关因子在T细胞分化及功能中的作用

含锌指和BTB结构域7B(ZBTB7B/ThPOK)是CD4谱系分化中的关键转录因子,并抑制CD8谱系生成。ThPOK蛋白表达促进CD4谱系分化,维持CD4谱系稳定性,并抑制CD8谱系分化。首先在胸腺内,ThPOK基因表达受T细胞受体(TCR)信号、基因增强子、基因沉默子等调节,且ThPOK表达受GATA结合蛋白3(GATA3)、Runt相关转录因子3(Runx3)、白血病/淋巴瘤相关因子(LRF)、胸腺细胞选择相关性高迁移率族盒基因(TOX)、Myc关联的锌指蛋白相关因子(MAZR)、E1A结合蛋白p300(P300)等转录因子影响,进而影响CD4、CD8谱系分化。而在外周T细胞中,ThPOK影响CD_4^+T细胞亚群、CD_8^+T细胞分化及功能。在此基础上,正逐步展开针对外周疾病中ThPOK作用的研究。