C/EBPα和C/EBPβ抑制PHLPP的表达影响细胞增殖

目的分析影响抑癌基因磷酸酶PHLPP表达的因素,进一步研究肿瘤发生、发展的机制。方法分析比对多种种属的PHLPP基因序列,根据其启动子中均有碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)转录因子C/EBPα、C/EBPβ的结合位点,也有SP1的结合位点这一特点,通过双荧光素酶报告法和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP),过表达或抑制C/EBPα、C/EBPβ的表达,再通过PCR、RT-PCR、Western blot、细胞生长实验和肿瘤组织切片免疫组化进行分析。结果 C/EBPα和C/EBPβ与PHLPP的启动子相结合并抑制其表达,与PHLPP的表达呈负相关,SP1不影响PHLPP的表达。结论 C/EBPα和C/EBPβ通过作用于PHLPP影响细胞增殖。

高渗状态下肾脏COX2表达的基因调控

目的本研究旨在阐明核转录因子C/EBPβ和NFκB是否协同作用影响高渗状态下COX2的基因表达。方法体外培养肾髓间质细胞(RMICs),通过病毒转导或质粒转染技术将体外构建的COX2基因突变载体转入培养细胞,经高渗培养不同时间后,采用免疫印迹、荧光素酶报告基因活性检测等方法观察培养细胞COX2蛋白表达及活性的改变,同时应用染色质免疫沉淀分析法观察COX2基因与C/EBPβ、NFκB结合能力的改变。结果免疫印迹显示,高渗刺激能明显提高对照组COX2蛋白表达,应用突变序列IκBm阻断NFκB活性后COX2表达明显下降,应用突变序列C/EBP-βP20阻断C/EBPβ亦能显著降低COX2表达,但同时运用突变序列C/EBP-βP20和IκBm无法使COX2表达进一步下降。然而,将野生型、含NFκB或C/EBPβ结合位点突变的COX2启动子萤火虫荧光素酶报告基因的重组质粒转染至RMICs,高渗培养24h后显示:高渗刺激能显著增加野生型组COX2荧光素酶的活性,NFκB位点突变无法阻断该作用,而C/EBPβ结合位点突变却能完全抑制COX2高活性。进一步应用染色质免疫沉淀分析研究显示,高渗刺激能显著增加NFκB(P65)或C/EBPβ与COX2基因的结合,并呈时间依赖性;NFκB结合位点突变不能消除高渗诱导的NFκB(P65)与COX2基因的结合增强,但在NFκB和C/EBPβ结合位点同时突变组该作用被阻断。结论在NFκB活化COX2基因转录过程中需要另一个核转录因子C/EBPβ的参与,C/EBPβ途径在高渗诱导肾脏内髓间质细胞表达COX2过程中具有重要作用。

转录因子C／EBPα异常与急性髓系白血病

增强子结合蛋白C／EBPα在造血系统髓系分化中扮演着重要的角色，其功能的改变与白血病的发生发展存在着关联，尤其是与急性髓系白血病（AML）的分类及预后关系密切，同时对AML的治疗具有指导意义。本文就转录因子C／EBPα异常与AML的相关性进行综述。

大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠肾组织中内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP表达的影响

目的:通过研究大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠肾组织中内质网应激(ERS)相关蛋白的影响,探讨其保护肾功能延缓肾间质纤维化(RIF)的作用机制。方法:90只健康SD雄性大鼠随机分为假手术组,模型组,大黄泄浊方低、中、高剂量(6.825、13.650、27.300 g/kg)组和尿毒清颗粒组(2.600 g/kg)。除假手术组外,其余均采用5/6肾切除手术诱导慢性肾衰竭(CRF)大鼠模型。模型诱导成功后,各药物干预组分别予规定剂量的药物混悬液灌胃,每日1次,连续8周。给药结束后,检测大鼠血肌酐(Scr)、血尿素氮(BUN)水平和24 h尿蛋白定量(UTP);Masson染色观察RIF程度;免疫组织化学法检测肾组织中葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达情况。结果:与假手术组相比,模型组大鼠血Scr、BUN、UTP水平显著增高(P<0.05),肾间质发生显著纤维化,GRP78、CHOP蛋白表达水平显著增加(P<0.05);与模型组相比,大黄泄浊方各剂量组和尿毒清颗粒组血Scr、BUN、UTP水平具有不同程度降低(P<0.05),RIF不同程度改善,GRP78、CHOP蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论:大黄泄浊方可减轻5/6肾切除术诱导的CRF大鼠肾功能恶化、改善RIF病理改变,其机制可能与降低GRP78、CHOP蛋白表达以抑制ERS有关。

基于PERK/ATF4/CHOP的益肾通络方抑制内质网应激改善肾小管上皮细胞凋亡的作用机制

目的:验证益肾通络方(YSTLP)对肾小管上皮细胞凋亡的影响,并基于内质网应激通路蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/活化转录因子4(ATF4)/转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)探讨其作用机制。方法:将db/db小鼠随机分为模型组、缬沙坦组(10 mg·kg^(-1)·d^(-1))、YSTLP低、中、高剂量组(1、2.5、5 g·kg^(-1)·d^(-1))给予药物干预8周后取材。同窝的db/m小鼠作为正常组。体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),分为正常组、糖基化终产物(AGEs)组、AGEs+益肾通络方低、中、高质量浓度组(100、200、400 mg·L^(-1));原位末端标记(TUNEL)染色检测HK-2细胞的凋亡情况;细胞活力测定实验检测HK-2细胞存活率;钙离子荧光探针染色,以及荧光素酶报告基因法检测为折叠蛋白反应元件(UPRE)荧光素酶活力,检测内质网应激情况;免疫组化法(IHC)检测小鼠肾脏中磷酸化(p)-PERK蛋白的表达(p-PERK)、CHOP、ATF4的蛋白表达水平;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测小鼠肾脏、HK-2细胞中CHOP、X盒结合蛋白1(XBP1)的mRNA表达水平;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠肾脏、HK-2细胞中p-PERK、PERK、CHOP、ATF4、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、切割型胱天蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)的蛋白表达水平。结果:细胞实验中,与正常组比较,AGEs组HK-2细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P<0.01),凋亡相关因子Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bax的mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.01),cleaved Caspase-3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与AGEs组比较,YSTLP给药处理后,细胞活力提升,凋亡率降低(P<0.01),Bcl-2的mRNA和蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著升高(P<0.01),Bax的mRNA和蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著降低,cleaved Caspase-3的蛋白表达水平呈时间、剂量依赖性显著降低(P<0.01)。与正常组比较,AGEs组细胞内Ca2+失衡,UPRE荧光素酶荧光强度增加(P<0.01),内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA水平显著升高(P<0.01),p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平明显提高(P<0.05);与AGEs组比较,YSTLP可有效改善HK-2细胞内Ca2+失衡,剂量依赖性降低UPRE荧光强度(P<0.01),降低内质网应激相关因子CHOP、XBP1的mRNA水平(P<0.01),剂量、时间依赖性降低细胞内p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平(P<0.01)。动物实验中,与正常组比较,模型组小鼠Bcl-2的蛋白表达水平显著降低(P<0.01),cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组比较,YSTLP组Bcl-2的蛋白表达水平呈剂量依赖性提升,cleaved Caspase-3、Bax的蛋白表达水平呈剂量依赖性降低(P<0.01)。与正常组比较,模型组小鼠CHOP、XBP1 mRNA表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平明显提高(P<0.05);与模型组比较,YSTLP可显著降低CHOP、XBP1的mRNA表达水平(P<0.01),降低p-PERK、CHOP、ATF4的蛋白表达水平(P<0.01)。结论:YSTLP可有效抑制内质网应激、改善肾小管上皮细胞凋亡情况,其作用机制可能与调节PERK/AFT4/CHOP通路有关。

不同强度及时程电针干预对非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏PERK/ATF4/CHOP通路的影响

目的:基于肝脏蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)-活化转录因子4(ATF4)-转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路,分析不同强度、不同时程电针“丰隆”“足三里”对非酒精性脂肪肝病大鼠的影响,探讨其作用机制。方法:将SD大鼠随机分为普通饮食组、高脂模型组、假电针组、强刺激电针组、弱刺激电针组,每组15只,每组再分为2、3、4周3个亚组。采用高脂饲料喂养建立非酒精性脂肪肝病大鼠模型。造模成功后电针双侧“丰隆”“足三里”,疏密波(4 Hz/20 Hz),电流强度分别为4 mA、2 mA,持续20 min,1次/d,每周治疗5 d,休息2 d;假电针组只连接电针仪,不通电。不同时程亚组分别干预2、3、4周。干预结束后采用全自动生化分析仪检测大鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)含量,油红O染色观察肝组织形态学变化,实时荧光定量PCR、Western blot法检测大鼠肝脏组织PERK、ATF4、CHOP mRNA与蛋白的表达。结果:高脂模型组大鼠肝细胞红色脂滴聚积明显,强刺激电针组4周时大鼠肝细胞红色脂滴明显减少。与同时程普通饮食组比较,高脂模型组大鼠血清ALT、AST含量与肝脏组织PERK、ATF4、CHOP mRNA与蛋白表达均升高(P<0.01)。与同时程高脂模型组比较,强、弱刺激电针组血清ALT、AST含量及肝脏组织PERK、ATF4、CHOP mRNA与蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05)。与同时程假电针组比较,强、弱刺激电针组大鼠血清ALT、AST含量与肝脏组织PERK、ATF4、CHOP mRNA表达降低(P<0.01,P<0.05),强刺激电针组大鼠肝脏组织PERK、ATF4、CHOP蛋白表达降低(P<0.01),弱刺激电针组大鼠2、3、4周时肝脏组织PERK、CHOP蛋白表达降低(P<0.01),2周时ATF4蛋白表达降低(P<0.05)。与同时程强刺激电针组比较,弱刺激电针组大鼠血清ALT、AST含量及肝脏组织PERK、ATF4、CHOP mRNA与蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。与本组2周时比较,强、弱刺激电针组大鼠3、4周时血清ALT、AST含量及肝脏组织PERK、ATF4、CHOP mRNA与PERK蛋白表达降低(P<0.01,P<0.05),强刺激电针组3、4周时肝脏组织ATF4蛋白表达降低(P<0.01),强刺激电针组4周时、弱刺激电针组3周和4周时肝脏组织CHOP蛋白表达降低(P<0.01)。与本组3周时比较,强、弱刺激电针组大鼠4周时血清ALT、AST含量,PERK、ATF4、CHOP mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),强、弱刺激电针组4周时肝脏组织PERK、CHOP蛋白表达降低(P<0.01),强刺激电针组4周时肝脏组织ATF4蛋白表达降低(P<0.05)。结论:电针“丰隆”“足三里”可显著改善非酒精性脂肪肝病大鼠肝功能,其作用机制可能是通过抑制PERK表达进而靶向调控下游ATF4/CHOP信号通路,抑制内质网应激,从而发挥肝脏保护效应;电针强度4 mA治疗4周时效果最佳。

睾酮在体外对人卵巢颗粒细胞SVOG凋亡的影响及其内质网应激机制

目的:探讨睾酮在体外对颗粒细胞凋亡的诱导作用,并阐明其作用机制。方法:噻唑蓝(MTT)比色法检测人卵巢颗粒细胞SVOG的细胞增殖抑制率,筛选最佳药物作用浓度后,将SVOG细胞分为对照组、睾酮组(1.0×10^(-5)mol·L^(-1)睾酮)、睾酮+氟他胺组(1.0×10^(-5)mol·L^(-1)睾酮+1.0×10^(-5)mol·L^(-1)氟他胺)、睾酮+牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)组(1.0×10^(-5)mol·L^(-1)睾酮+1.5 g·L^(-1)TUDCA)。采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)法检测各组SVOG细胞中剪切型X盒结合蛋白1(XBP1s)、激活转录因子4 (ATF4)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)和死亡受体5(DR5)mRNA表达水平,流式细胞术检测各组SVOG细胞凋亡率。结果:与对照组比较,睾酮组SVOG细胞形态改变,异型细胞增多,胞质中出现较多颗粒,培养基中细胞碎片增多,SVOG细胞增殖抑制率升高(P<0.05);与睾酮组比较,睾酮+氟他胺组和睾酮+TUDCA组SVOG细胞形态变化减少,细胞增殖抑制率降低(P<0.05);流式细胞术,与对照组比较,睾酮组SVOG细胞凋亡率升高(P<0.05);与睾酮组比较,睾酮+氟他胺组和睾酮+TUDCA组SVOG细胞凋亡率降低(P<0.05)。RT-qPCR法,作用48 h后,与对照组比较,睾酮组SVOG细胞中XBP1s、ATF4、CHOP和DR5 mRNA表达水平均明显升高(P<0.05);与睾酮组比较,睾酮+氟他胺组和睾酮+TUDCA组SVOG细胞中XBP1s、ATF4、CHOP和DR5 mRNA表达水平降低(P<0.05)。结论:睾酮可诱导人卵巢颗粒细胞凋亡并引起卵泡闭锁,其作用机制可能是雄激素与雄激素受体(AR)结合激活CHOP-DR5通路,诱导内质网应激(ERS)发生,促进颗粒细胞凋亡。

大黄泄浊方对5/6肾切除大鼠肾脏保护作用及对PERK/ATF4/CHOP通路的影响

目的 通过观察大黄泄浊方对慢性肾衰竭大鼠内质网应激凋亡途径相关蛋白的影响,探讨其延缓肾间质纤维化的可能作用机制。方法 90只SD雄性健康大鼠随机分为假手术组,模型组,大黄泄浊方低、中、高剂量组(6.825g·kg^(-1)、13.65g·kg^(-1)、27.30g·kg^(-1))和尿毒清颗粒组(2.60g·kg^(-1)),除假手术组外其余分组大鼠均采用5/6肾切除术造模。模型诱导成功后,各药物干预组分别给予规定剂量的中药混悬液灌胃,每日1次,连续8周。给药结束后,检测大鼠血清中血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血白蛋白(ALB)水平及大鼠24h尿蛋白定量(UTP)水平;苏木素-伊红(HE)、马松(Masson)染色观察肾脏病理学改变;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测大鼠肾组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、IV胶原蛋白(collegen IV)mRNA的相对表达量情况;免疫组织化学法(IHC)检测肾组织中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)蛋白、大分子B淋巴细胞瘤(Bcl-xl)蛋白、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Bcl-2基因相关启动子重组蛋白(Bad)的表达情况;蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测肾组织中蛋白激酶RNA样内质网激酶(PERK)、转录激活因子4(ATF4)、转录因子C/EBP同源蛋白(CHOP)蛋白的表达情况。结果 与假手术组相比,模型组大鼠血SCr、BUN水平显著增高(P<0.05),ALB水平显著降低(P<0.05),UTP水平显著增高(P<0.05),肾组织中α-SMA、collegenIV mRNA相对表达量显著增高(P<0.05),Bcl-2、Bcl-xl表达水平显著降低(P<0.05),Bax、Bad、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达水平显著增加(P<0.05);与模型组相比,各药物干预组血SCr、BUN水平均有不同程度降低(P<0.05),ALB水平均有不同程度增高(P<0.05),UTP水平均有不同程度降低(P<0.05),肾组织中α-SMA、collegenIV mRNA相对表达量均有不同程度降低(P<0.05),Bcl-2、Bcl-xl表达水平均有不同程度增高(P<0.05),Bax、Bad、PERK、ATF4、CHOP蛋白表达均有不同程度降低(P<0.05)。结论 大黄泄浊方可改善肾功能、延缓肾纤维化,其机制可能是通过调控PERK/ATF4/CHOP通路相关蛋白的表达,抑制内质网应激,减少细胞凋亡有关。

基于ATF6/GRP78/CHOP信号通路探讨龟鹿二仙胶对膝骨关节炎大鼠退变软骨细胞内质网稳态的影响

目的:探讨龟鹿二仙胶对毒胡萝卜素诱导的大鼠退变软骨细胞激活转录因子6(ATF6)/葡萄糖调节蛋白78(GRP78)/C/EBP同源蛋白(CHOP)信号通路的影响。方法:用大鼠膝关节提取软骨细胞进行体外培养。将软骨细胞分为空白对照组、模型对照组、10.8 g/kg 10%龟鹿二仙胶含药血清组、2μmol/L蛋白运输蛋白SX61抑制剂组。干预24 h后,以CCK-8法检测各组软骨细胞活性;免疫荧光染色检测蛋白运输蛋白SX61(SEC61)因子的表达情况;流式细胞术及TUNEL染色检测各组软骨细胞凋亡情况;Western blot及qPCR法检测软骨细胞ATF6/GRP78/CHOP、Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)蛋白及mRNA的表达。结果:与空白对照组相比,模型对照组软骨细胞活性显著下降(P<0.01),软骨细胞凋亡率及凋亡指数显著增高(P<0.01),SEC61荧光强度显著增强(P<0.01),GRP78、ATF6、CHOP、COL2A1、MMP-13蛋白及mRNA的表达明显上调(P<0.05);与模型对照组相比,10.8 g/kg 10%龟鹿二仙胶含药血清组及2μmol/L蛋白运输蛋白SX61抑制剂组软骨细胞活性显著提高(P<0.01),软骨细胞凋亡率及凋亡指数显著降低(P<0.01),SEC61荧光强度显著降低(P<0.01),GRP78、ATF6、CHOP、MMP-13蛋白及mRNA表达明显下调(P<0.05),COL2A1蛋白及mRNA表达上调(P<0.05);与10.8 g/kg 10%龟鹿二仙胶含药血清组相比,2μmol/L蛋白运输蛋白SX61抑制剂组软骨细胞活性显著提升(P<0.01),软骨细胞凋亡率及凋亡指数降低(P<0.05或P<0.01),SEC61蛋白荧光强度显著降低(P<0.01),GRP78、ATF6、CHOP、MMP-13蛋白及mRNA表达下调(P<0.05),COL2A1蛋白及mRNA表达上调(P<0.05)。结论:龟鹿二仙胶可通过ATF6/GRP78/CHOP信号通路抑制退变软骨细胞内质网应激(ERS)反应,调控细胞外基质(ECM)分解合成平衡,改善软骨细胞ER稳态,进而减少软骨细胞凋亡。