转录因子增强子结合蛋白-4基因沉默对子宫内膜癌细胞凋亡的影响

目的观察内源性转录因子增强子结合蛋白-4(AP-4)沉默对子宫内膜癌细胞凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法将人子宫内膜癌细胞(HEC-1-A和RL95-2)分为NC组、si#1组、si#2组,si#1组转染siTFAP4片段1,si#2组转染si-TFAP4片段2,NC组转染对照siRNA。采用Hoechest 33258染色观察凋亡核形态,采用Annexin V-FITC/PI染色流式细胞术测算细胞凋亡率,采用real-time PCR技术检测存活素(Survivin)mRNA表达,采用生物信息学分析预测Survivin编码基因BIRC5的启动子区域内是否存在AP-4的结合位点,采用染色体免疫共沉淀技术验证AP-4是否结合到BIRC5的启动子区域,采用双荧光素酶报告系统检测BIRC5的启动子转录激活情况。结果在HEC-1-A、RL95-2细胞中,与NC组相比,si#1组、si#2组凋亡核型细胞数均增加,细胞凋亡率均增加,Survivin mRNA相对表达量均减少(P均<0.05)。BIRC5的启动子区域内存在一个高置信度的AP-4结合位点,沉默HEC-1-A、RL95-2细胞内源性AP-4后能降低AP-4对BIRC5启动子区域的结合并抑制其转录激活状态。结论沉默内源性AP-4能诱导子宫内膜癌细胞凋亡,其机制可能为降低了AP-4对Survivin的转录激活,从而诱导了肿瘤细胞的凋亡。

四君子汤对胃癌肿瘤干细胞标志物活性及TFAP4蛋白的作用机制

目的 探讨四君子汤对胃癌肿瘤干细胞标志物活性及转录因子激活增强子结合蛋白(TFAP)4蛋白的作用机制。方法 SGC-7901干细胞分为A组(SGC-7901干细胞)、B组(SGC-7901干细胞在75μl 2.5%大鼠四君子汤含药血清中培养)、C组(SGC-7901干细胞在75μl 5%大鼠四君子汤含药血清中培养)、D组(SGC-7901干细胞在75μl 7.5%大鼠四君子汤含药血清中培养)及E组(SGC-7901干细胞+含有1 mg/ml的5-氟尿嘧啶培养基中培养)。采用倒置显微镜观察SGC-7901干细胞形态;比较SGC-7901细胞及SGC-7901干细胞及集落形成能力;CCK-8检测各组细胞活性;流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;Western印迹检测各组干细胞标志物CD44及CD133蛋白,B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、Bcl-2及TFAP4蛋白。结果 SGC-7901干细胞随着生长周期的延长,球体逐渐增大,3 d时体积较小结构松散,4 d时细胞呈现椭圆形生长,5 d时细胞结构更致密,形态更加接近球形,且一个球体所包含细胞数目可达到数十个;SGC-7901及SGC-7901干细胞的细胞集落数组间比较存在显著差异(P<0.001);与A组相比,B、C、D及E组24、48、72及96 h时SGC-7901干细胞活性均显著降低(P均<0.05),与B组相比,C、D、E组上述时间细胞活性显著降低(P<0.05),与C组相比,D、E组上述时间细胞活性显著降低(P<0.05),组间比较存在统计学差异(F=112.900,P<0.001);与A组比较,B组、C组、D组及E组干细胞凋亡率、Bax显著增加,CD44、CD133、Bcl-2及TFAP4显著降低(P<0.05)。与B组相比,C、D、E组干细胞凋亡率、Bax显著增加,CD44、CD133、Bcl-2及TFAP4降低(P<0.05),与C组相比D、E组有显著意义(P<0.05)。D组与E组上述指标无统计学意义(P>0.05)。结论 四君子汤含药血清可以显著抑制胃癌肿瘤干细胞标志物活性,通过抑制Bcl-2表达激活Bax加快胃癌干细胞凋亡,研究机制可能与抑制TFAP4活性相关。

LSD1、NUSAP1和TEAD4在人乳头瘤病毒感染尖锐湿疣及宫颈癌中的表达及意义

目的观察组蛋白赖氨酸去甲基化酶1(histone lysines demethylase 1,LSD1)、核仁纺锤体相关蛋白1(nucleolar and spindle-associated protein 1,NUSAP1)和转录增强因子4(TEA domain transcription factor4,TEAD4)在低危型、高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染尖锐湿疣组织及宫颈鳞状细胞癌(宫颈癌)组织中的表达变化及其临床意义。方法采用免疫组化法分别检测LSD1、NUSAP1和TEAD4在30例宫颈癌组织、30例高危型HPV感染尖锐湿疣组织、30例低危型HPV感染尖锐湿疣组织以及10例正常宫颈组织中的表达情况。结果宫颈癌组、高危型组、低危型组、正常对照组中LSD1阳性率分别为76.67%、53.33%、16.67%、0.00%,NUSAP1阳性率分别为90.00%、56.67%、20.00%、0.00%,TEAD4阳性率分别为86.67%、50.00%、13.33%、0.00%;组间多重比较结果显示,与正常对照组相比,宫颈癌组、高危型组LSD1、NUSAP1和TEAD4表达水平均显著升高:与低危型组相比,宫颈癌组、高危型组LSD1、NUSAP1和TEAD4表达水平均显著升高:与高危型组相比,宫颈癌组NUSAP1和TEAD4表达水平均显著升高:与高危型组相比,宫颈癌组LSD1的表达差异无显著性:与正常对照组相比,低危型组LSD1、NUSAP1和TEAD4的表达差异无显著性。结论LSD1、NUSAP1、TEAD4参与了高危型HPV感染向宫颈癌的发展,可能成为宫颈癌研究的新思路。

TFAP4低表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及机制

目的探讨TFAP4低表达对胃癌细胞恶性生物学行为的影响及机制。方法用RT-PCR、Westernblot⁃ting法检测细胞中TFAP4表达,选取TFAP4 mRNA和蛋白表达最高的MGC-803细胞作为实验细胞。将MGC-803细胞随机分为空白对照组(Control组)、阴性对照组(NC组)、TFAP沉默组(siTFAP组)、TFAP沉默+空载转染组(siT⁃FAP4+Vector组)、TFAP沉默+HMGB1过表达组(siTFAP4+HMGB1组)并进行转染。用RT-PCR技术检测各组细胞中TFAP4 mRNA表达,确认转染效率。用RT-PCR技术检测细胞中HMGB1 mRNA表达,用Westernblotting法检测细胞中TFAP4、HMGB1蛋白表达及胞质、胞核YAP蛋白表达,用划痕实验检测细胞迁移能力,用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力,用体外血管生成实验检测内皮细胞成管能力,用双荧光素酶报告基因实验验证TFAP4对HMGB1的转录调控作用。结果与NC组比较,siTFAP4组细胞迁移率低,细胞侵袭数目和管腔形成数目少,TFAP4、HMGB1及胞核YAP表达低,胞质YAP表达高(P均<0.05)。与siTFAP4+Vector组比较,siTFAP4+HMGB1组细胞迁移率高,细胞侵袭数目和管腔形成数目多,HMGB1、胞核YAP表达高,胞质YAP表达低(P均<0.05)。双荧光素酶实验结果显示,与pGL3-Basic+TFAP4+pRL-TKVector转染细胞比较,pGL3-Basic-Promoter+TFAP4+pRL-TKVector转染细胞荧光素酶相对活性高(P<0.05)。结论TFAP4低表达可抑制胃癌细胞侵袭、迁移,促进内皮成管,其机制可能与TFAP转录调控HMGB1激活YAP信号有关。

非小细胞肺癌组织TFAP4表达及其对A549增殖和侵袭影响

目的转移和复发是导致非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治疗失败的主要因素'明确影响转移和复发的相关机制对提高治疗效果及改善患者预后具有重要意义。本研究旨在检测转录因子激活增强子结合蛋白4(transcription factor activating enhancer-binding protein 4 ,TFAP4)在 NSCLC 组织中表达,并探讨下调该基因对 A549 增殖和侵袭的影响。方法选取2015-03-06-2018-03-04海南省人民医院行手术治疗的NSCLC标本及对应的癌旁组织(距肿瘤边缘≥5cm)78例,采用免疫组化法检测NSCLC和癌旁组织中TFAP4蛋白表达。细胞实验包括培养NSCLC细胞株,随机分为siRNA-TFAP4组(转染TFAP4基因干扰序列)、对照序列组(转染阴性对照序列)和对照组(不作任何处理),通过实时荧光定量聚合酶链反应法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)及蛋白质印迹法检测沉默的效率。四甲基偶氮唑盐(methyl thiazoly tetrazolim, MTT)比色法和Transwell小室分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,蛋白质印迹法检测细胞中Snail、E-cadherin和Vimentin蛋白表达。结果 NSCLC组织中TFAP4蛋白阳性表达率为79.49%,高于癌旁组织的 30.77%,χ^2=37.419,P<0.001;TNM 分期Ⅲ~Ⅳ期(χ^2=6.395,P<0.05)、低分化(χ^2=4.577,P<0.05)和发生淋巴结转移的NSCLC组织中TFAP4(χ^2=7.386 ,P<0.05)蛋白阳性表达率升高;siRNA-TFAP4组细胞中TFAP4 mRNA相对表达量为0.31±0.07,低于对照序列组(0.98±0.13)和对照组(1.00±0.03),F=120.840, P<0.001;siRNA-TFAP4组迁移细胞数为 104.04±3.70,低于对照序列组(133.94±8.20)和对照组(130.98±7.26),F=6.555,P<0.001;siRNA-TFAP4组侵袭细胞数为96.12±4.36,低于对照序列组(120.31±4.67)和对照组(122.63±5.23),F=56.880,P<0.001;与对照序列组和对照组比较,24、48、72和96h siRNA-TFAP4组细胞的增殖能力降低,F值分别为9.924、16.429、18.156和16.970,均P<0.05;siRNA-TFAP4 组细胞中 TFAP4、 Snail和Vimentin 蛋白相对表达量低于对照序列组和对照组,F值分别为169.815、34.473和55.089,均P<0.05 ,而E-cadherin蛋白相对表达量高于对照序列组和对照组,F=33.780, P<0.05。结论 TFAP4蛋白在NSCLC组织中呈高表达,下调A549细胞中TFAP4基因表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,其机制可能与抑制上皮-间质转化过程有关。