人参茎叶皂甙增强糖皮质激素受体转录激活效应的实验研究

目的探讨人参茎叶皂甙 (ginsenosides stem leaves ,GSL)对糖皮质激素受体 (glucocorticoidre ceptor,GR)转录激活效应的影响。 方法将糖皮质激素受体荧光素酶报告基因 pGRE tk Luc与内参照基因pRL SV4 0共同瞬时转染细胞 ,利用双荧光素酶报告基因检测方法 (Dual LuciferaseReporterAssay) ,观察地塞米松 (dexamethasone ,Dex)和GSL对报告基因表达的影响。结果Dex诱导HL770 2细胞内报告基因的表达呈剂量和时间依赖性 ,Dex的最大诱导倍数达 93倍。糖皮质激素受体的拮抗剂RU4 86可以阻断Dex对报告基因的诱导 ;GSL不能诱导报告基因的表达 ,但可使Dex对GR报告基因的诱导表达效应提高6 1 4 %。

类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术

人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,从而引起基因组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰,开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)自2010年底开始成功应用于基因打靶,很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。文章综述了TALEN技术的研究进展及应用前景,重点介绍TALEN的结构、作用机制与构建方法和利用TALEN进行基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,特别是在斑马鱼中的应用,为开展这一领域的研究工作提供参考。

类转录激活因子效应物及其在生物技术领域的应用

综述了类转录激活因子效应物(TALEs)技术的研究进展及生物技术应用前景,重点介绍TALEs的结构特征、作用机理、广谱抗性基因的人工构建及利用类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator like effector nucleases,TALENs)进行基因组定点修饰的策略。

自发光转录激活子样效应因子的功能分析

目的:对转录激活子样效应因子(TALE)蛋白进行特异性标记.方法:通过分子生物学技术,在TALE蛋白的C-端融合了一种具有优异光学性能的萤光素酶.结果:融合蛋白不仅可对目的 DNA进行特异性识别,还可产生萤光素酶的特征光谱.结论:萤光素酶的融合不影响TALE蛋白的正常功能,其光谱信息有望成为分析TALE蛋白与DNA相互作用的特异性检测信号.

类转录激活因子效应物核酸酶介导的E-cad和Bmi-1基因联合干预鼻咽癌的体外研究

目的:检测类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)介导的E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)、B细胞特异性莫洛尼氏白血病毒插入位点1(B-lymphoma Moloney murine leukemia virus insertion region-1,Bmi-1)基因联合干预对鼻咽癌细胞生物学行为的影响。方法:构建多位点基因打靶载体p UC-DS1-E-cad-2ANeo-DS2(以下简称E-cad打靶载体)和p UC-DS1-Bmi-1 sh RNA-Zeo-DS2(以下简称Bmi-1打靶载体),将E-cad打靶载体、Bmi-1打靶载体及佛山科学技术学院分子医学研究院前期构建的TALEN载体以不同组合转染鼻咽癌CNE-2细胞。采用PCR检测靶基因的整合,Western印迹检测靶基因蛋白表达水平变化,细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞增殖能力变化,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡变化,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力变化。结果:靶基因E-cad和Bmi-1 sh RNA表达元件成功整合到鼻咽癌CNE-2细胞的基因组中;转染后鼻咽癌CNE-2细胞中E-cad的蛋白表达水平明显上升,Bmi-1的蛋白表达水平明显下降;干预E-cad及Bmi-1不影响细胞的增殖、周期和凋亡,但显著抑制细胞的迁移和侵袭能力,且E-cad和Bmi-1联合干预比单独干预更能显著抑制鼻咽癌CNE-2细胞体外迁移能力(均P<0.01)。结论:TALEN介导的E-cad和Bmi-1联合干预能有效抑制鼻咽癌CNE-2细胞的体外迁移和侵袭,可为人类癌症的基因治疗建立前期的实验基础。

基于类转录激活因子效应物(TALEs)的基因组定点操控技术

基于类转录激活因子效应物(transcription activator-like effectors,TALEs)的基因组定点操控技术能够对基因组功能体系的反向遗传操作于基因及转录水平进行精确操控。TALEs是来源于植物病原菌—黄单胞杆菌(Xanthomonas spp.)的DNA结合蛋白,其结合域通常由包含34个氨基酸残基的重复模块串联而成。根据编码规则,可人为重新编排重复模块顺序使其能够识别新的DNA序列。该人工设计TALEs对基因组的定点操控(包括转录调控和基因组编辑)已在体外培养的人类细胞和多种模式生物中得到了成功应用,为模式生物基因功能研究,农作物性状改善及人类遗传性疾病治疗等开辟了新时代。

环磷腺苷效应元件结合蛋白转录共激活因子在食管癌中的表达及与临床病理的关系

探讨环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)转录共激活因子1(CRTC1)在食管癌组织与癌旁组织中的转录水平和翻译水平变化,及其变化与临床病理的关系。收集25例食管癌鳞癌患者的癌组织及与之配对的癌旁组织,通过qRT-PCR检测CRTC1的mRNA水平,Western blot检测CRTC1的蛋白水平。结果表明:在食管癌中,CRTC1蛋白表达低于癌旁组,而mRNA水平高于癌旁组;CRTC1在转录水平上与肿瘤位置和淋巴结转移有关。由此可见:CRTC1在食管癌中存在异常表达,CRTC1的mRNA有望用于食管癌诊断及淋巴结转移评估。

组蛋白甲基化修饰效应分子的研究进展

作为一种重要的表观遗传学调控机制,组蛋白甲基化修饰在多种生命过程中发挥了重要的作用。细胞内有多种组蛋白甲基化酶和去甲基化酶共同调节组蛋白的修饰状态,在组蛋白甲基化状态确定后,多种效应分子特异的读取修饰信息,从而参与基因转录调控过程。文章从组蛋白甲基化效应分子的作用机制方面综述了这一领域的研究进展。

针刺对快速老化小鼠SAMP10转录调节因子NF-E2、YB-1、LRG47的影响

目的:探讨针刺延缓衰老的机制。方法:采用快速老化小鼠(SAMP10)、正常老化小鼠(SAMR1)为模型,运用地高辛标记的非放射性Northernblot技术,观察8月龄SAMR1对照组、SAMP10对照组、SAMP10针刺组及SAMP10非穴位刺激组全脑、皮层和海马NF-E2、YB-1、LRG47基因表达的变化。结果:SAMP10对照组小鼠NF-E2、YB-1、LRG47在全脑、皮层、海马中的表达下调,针刺后表达上调并趋向于正常组。结论:SAMP10小鼠脑衰老与NF-E2、YB-1、LRG47基因表达异常有关,针刺可以通过调节NF-E2、YB-1、LRG47基因表达增强红细胞系统功能和细胞增殖,提高细胞抗菌免疫,从而起到延缓衰老的作用。

基因编辑技术在免疫缺陷动物模型研究中的应用进展

免疫缺陷动物模型在临床前研究中发挥重要作用,是现代生物医学研究领域的重要实验工具,广泛应用于免疫学、遗传学、肿瘤学与微生物学等研究领域。基因编辑是针对生物体基因组进行靶向修饰的技术,从出现到应用,极大推动了生物医学研究领域的发展。基因编辑技术主要包括HEs、ZFNs、TALENs与CRISPR/Cas9系统。目前,研究者已利用该技术建立了多种类型的免疫缺陷动物模型,各有其优势和局限性。近年来,大量研究证实人源化免疫缺陷动物模型能够精准模拟癌细胞、药物以及免疫系统在人体内的作用,可以更好地模拟人类疾病,广泛用于研究人类免疫生物学及人类复杂疾病的潜在机制。本文对利用基因编辑技术构建免疫缺陷动物模型的研究应用进展进行综述,对基因编辑技术在免疫缺陷动物模型制备中存在的问题及优化策略深入探讨,并对其未来发展前景进行了展望,以期为研究者选用和建立免疫缺陷动物模型提供参考。

TAL效应子应用研究进展

转录激活因子样效应子(transcription activator-like effectors,TALEs)是一类在植物病原黄单胞菌(plant pathogen Xanthomonas sp.)中发现的天然的DNA结合蛋白,它具有与目标DNA序列特异性结合的能力。随着研究的深入,TALEs的结构信息和特异性结合DNA序列的分子机理被破解,这就为人工设计构建TALE-DNA结构结合域提供了理论基础。人工构建的TALEs可以应用于各种各样的基因组工程,包括转录调控和基因组编辑。综述TALE的结构、TALE与DNA结合的分子密码,重点综述人工构建TALEs的应用,并对其未来的发展方向进行展望。

Y染色体嵌合缺失与心脑血管疾病

研究提示,外周血白细胞发生Y染色体嵌合缺失(mosaic loss of chromosome Y,mLOY)增加全因死亡和心脑血管等年龄相关疾病的风险。mLOY是男性特有的遗传变异因素,高龄、吸烟、空气污染等可能是mLOY的危险因素。近年来的全基因组关联分析(genome wide association studies,GWAS)研究发现了不少与mLOY相关的基因位点。基础研究和基于人类基因数据库的分析提示mLOY对心脑血管疾病的发生和复发、预后有不良影响,其可能机制有“免疫监控”假说和“共同土壤”假说。目前针对mLOY的检测方法主要是于单核苷酸多态性基因微阵列测序数据或全基因组测序数据,其中前者的应用更为广泛。

应用TALEN技术对兔CCR5基因进行靶向修饰

缺少合适的能够被人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1,HIV-1）感染的动物模型是获得性免疫缺陷综合征/艾滋病（Acquired immunedeficiency syndrome,AIDS）疫苗和药物研发的瓶颈.HIV-1能在野生型兔子中形成持续感染,在共表达人CD4和CCR5的兔细胞系中,HIV-1能高效复制,并形成合胞体.若在家兔中高表达人CD4和CCR5,就可能获得研究AIDS的理想动物模型.文章采用高效基因打靶技术—类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）,探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5,获得能够感染HIV-1家兔模型的可能性.针对家兔CCR5基因,设计了两对TALENs和一个同源打靶载体,TALEN mRNAs和DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中,体外培养3～5 d后,收集24枚胚胎,对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析.结果显示,在家兔CCR5位点,24枚胚胎均发生了基因敲除,5枚胚胎还发生了人CD4和CCR5基因敲入.该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础.

类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)的构建及其在基因组定点修饰中的应用

类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)是一种新发现的基因组定点修饰工具。TALENs由TALE蛋白及II型核酸内切酶Fok I组成,其中TALE由多个重复的氨基酸序列构成,对DNA序列的识别达到一个重复单元结合一个碱基的程度,它在结合Fok I内切酶后就形成了具有DNA定点修饰功能的TALENs。该文主要介绍TALENs的构建及其在基因组定点修饰中的应用。

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变,目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认,采用"单元组装法"构建人工TALEN的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。

基因组编辑开启家蚕研究新纪元

蚕桑丝绸产业的主体产品是蚕丝,蚕丝性能改良的技术创新之于蚕桑丝绸产业的重要性和迫切性,尤其体现在蚕丝遗传改良相关的生物技术上。近年来,锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活效应子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列系统(CRISPR/Cas9)等基因组编辑技术的产生与发展,已经在生命科学基础理论研究、经济物种的遗传改造以及人类疾病的预防与治疗等领域掀起了一场如火如荼的革命。在家蚕基因组生物学国家重点实验室的研究团队和中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所、日本国立农业生物资源研究所等国内外同仁的努力下,家蚕的研究也紧跟时代潮流,建立了基因组编辑技术体系,并跻身于众多模式生物基因组编辑技术的前沿阵列。更为可喜的是,部分家蚕基因组编辑的论文发表以后,得到了生命科学界、蚕桑丝绸业界和政府相关部门对蚕业科技的极大关注,其中有多篇SCI论文被高频次引用,蚕桑丝绸业界长期关注和难以解决的蚕丝遗传改良、丝腺生物反应器等问题在基因组编辑技术的介入后有望得到快速突破。本文就家蚕基因组编辑技术带给传统蚕桑丝绸产业的机遇,以及该项技术的发展、应用现状和前景作简要总结,以供研究者借鉴和参考。

基因编辑技术及其应用的研究进展

基因编辑技术是一项对生物体内源基因进行精准定点修饰的技术,极大地推动了生命科学的发展进程,是目前生物科学研究领域应用最广泛的技术。基因编辑技术主要包括锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和规律性重复短回文序列簇(CRISPR/Cas)。基因编辑技术可以特异性识别靶向序列,定点修饰靶向基因,进而深入研究目标基因的功能。基因编辑技术具有操作简便、作用效率高和脱靶率低等优势,因此广泛应用于生命科学研究、疾病模型的构建、药物研发以及农业生产等领域。作者主要介绍了ZFN、TALEN、CRISPR/Cas 3种新型基因编辑技术,综述了基因编辑技术在基因治疗、品种研发和改良、研究功能基因以及构建疾病动物模型等方面的应用,简要讨论了基因编辑技术与传统转基因技术之间的区别,并对基因编辑技术的应用前景进行了展望。

TALEN技术研究进展

类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是近年来新兴的分子生物学工具。该技术可高效地介导DNA编辑修饰,如基因敲除、基因敲入、碱基替换、点突变等。近年来,随着人们对TALEN系统研究的不断深入和改造,TALEN已成功地应用于人类细胞、鼠、斑马鱼等物种中,成为一项具有广阔应用前景的基因编辑技术。对TALEN的来源、构建及应用情况进行阐述,并对其未来发展进行展望。

人工核酸酶用于基因组定点编辑的研究进展

人工核酸酶(EN)技术,是利用设计并构建的核酸内切酶与靶DNA序列特异性结合,形成双链断裂(DSB),启动DNA修复通路,进行基因组定点编辑,目前已成功应用于多种细胞和生物体。

靶向REST基因TALEN质粒的快速构建与活性检测

目的针对人REST基因设计并构建特异性类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)质粒,快速获得具有较高突变效率的TALEN。方法根据REST的序列信息设计TALEN靶位,使用单元组装的方法快速构建TALEN质粒,在293T细胞中进行活性检测并计算突变效率。结果针对REST设计并成功构建5个TALEN质粒,组成6对TALEN并实现基因打靶,其中L1和R3组合的突变效率达到60.9%。结论成功获得了靶向人REST基因的高效TALEN,为进一步研究REST的基因功能及其在相关疾病中的作用奠定基础。