单细胞转录组学测序技术的发展和挑战

单细胞转录组测序技术为表征细胞异质性,解析复杂的生物系统提供了强大的工具;生物医学研究的进一步发展不断地向该技术提出新的需求。经过过去十年的飞速发展,该技术的灵敏度在逐渐提高,并且通量发生了巨大的飞跃,也实现了全转录组和全长转录本测序。本文主要介绍单细胞测序技术的发展,在灵敏度提升,通量提高和实现全转录组测序和全长转录本测序上面临的技术挑战。我们也提出未来需要开发更优的单细胞转录组测序技术,开发自动化单细胞测序仪器,并需要将该技术与空间组学和多组学测序技术更好的结合。

基于食管鳞癌奥沙利铂耐药细胞测序差异表达分析

目的建立食管鳞癌(esophageal squamous cancer,ESCC)奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)耐药细胞株,全转录本测序筛选与L-OHP耐药相关的基因,探索L-OHP耐药机制。方法采用L-OHP大剂量冲击与逐步递增药物浓度的方法建立人ESCC L-OHP耐药细胞株KYSE150/L-OHP,采用CCK-8法鉴定耐药细胞株的耐药性;光学显微镜下观察耐药细胞的形态学改变;Transwell小室试验检测耐药细胞侵袭/迁移能力的变化;全转录本测序筛选KYSE150和KYSE150/L-OHP细胞差异表达基因,并对差异表达基因进行KEGG通路富集和RT-PCR验证。结果L-OHP耐药细胞模型KYSE150/L-OHP的耐药指数为(4.0±1.35),明显高于亲本细胞(t=22.9,P<0.01);光镜下KYSE150/L-OHP细胞体积增大,形态不规则;与亲本细胞株相比,KYSE150/L-OHP细胞的侵袭和迁移能力均显著增强(t分别为25.49和46.05,P均<0.0001);全转录本测序结果显示,P13K-Akt、MAPK、Hippo信号通路可能介导L-OHP耐药的发生过程;RT-PCR验证差异基因表达与测序结果一致。结论成功建立了人ESCC L-OHP耐药细胞模型KYSE150/L-OHP,全转录本测序技术探讨了L-OHP化疗耐药的分子机制,为临床晚期ESCC L-OHP耐药患者的治疗提供了思路。

Pax3对神经细胞中的转录调控作用的实验研究

目的:探讨Pax3的过表达对Neuro-2a细胞中转录本的表达影响,初步分析Pax3对Neuro-2a细胞可能的转录调控作用。方法:反复冻融裂解法获取Pax3过表达腺病毒后将神经瘤母细胞系Neuro-2a传代培养,而后将Pax3过表达腺病毒和传代培养后的Neuro-2a细胞加入到同一培养皿中,蛋白质免疫印迹(Western blot)检测过表达Pax3蛋白的Neuro-2a细胞(Pax3过表达组)和对照组(NC组)Neuro-2a细胞的Pax3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Pax3过表达组和NC组Neuro-2a细胞的Pax3mRNA水平,Trizol法提取Pax3过表达组和NC组Neuro-2a细胞的总RNA,然后进行全转录本测序,最后将选出的有差异性的基因使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证。结果:与NC组相比,Pax3过表达组的Pax3蛋白和Pax3mRNA表达水平明显升高(P<0.05);Pax3过表达组中发现了1045个基因表达上调,1313个基因表达下调。通过qRT-PCR验证发现在Pax3过表达组中Nppb和Chrna5表达水平上升(P<0.05),Arhgap5、Rock1、Rif1、Brca2、Prkg2和Stag2表达水平下降(P<0.05)。结论:Pax3过表达腺病毒感染Neuro-2a细胞后,其蛋白和m RNA表达水平均升高,Rock1、Rif1和Stag2可能作为Pax3的下游靶点参与调控Neuro-2a细胞周期和干细胞特性。