应用体外转录法和荧光素制备RNA探针的技术

为建立一种快速制备RNA探针的方法,以研究不同的RNA与RNA之间的相互作用,介绍一种用体外转录法制备RNA,然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)纯化得到纯化的RNA,最后用荧光素标记得到RNA探针的新方法,用该方法制备RNA探针简便、高效、安全,尤其适合小剂量RNA探针的制备。

人野生型抑癌基因PTEN的逆转录PCR法克隆及序列分析

以正常人胎盘组织总RNA为模板,通过优化引物和PCR条件,采用逆转录PCR法扩增出人野生型PTEN基因cDNA片段,并克隆到pMD18-T载体,获得重组子pMD-PTEN.序列分析表明,该cDNA长1212bp,与GenBank中PTEN基因序列相比有3个碱基发生了变化,但全部为同义突变,证实获得了人野生型抑癌基因PTEN的cDNA克隆,为进一步构建原核表达载体及研究PTEN蛋白的抑癌效果、抑癌机理打下基础.

适合转录组测序的葡萄叶片总RNA试剂盒提取法的改进

RNA试剂盒法是获取植物高质量RNA样品的常用技术,针对3种常见RNA提取试剂盒在红地球葡萄叶样品RNA提取效果进行评估和优化,以期找到适合红地球葡萄叶片RNA表达谱测序需求的高质量RNA提取策略。试验依据3种试剂盒推荐时间和条件进行RNA提取,并对时间等条件进行优化,比对了优化前后RNA质量。结果显示,试剂盒经优化后的方法提取的RNA收率高,完整性好,OD260/OD280在1.8-2.2之间,OD260/OD230大于2,28S与18S条带清晰完整,RNA-Seq测序质量及基因覆盖度符合要求。在红地球葡萄叶片上的RNA提取结果表明,延长提取试剂与样品的接触时间操作可以显著提高RNA提取质量(纯度/完整性)。

用逆转录病毒法制作鸡输卵管生物反应器的研究

本文综述了鸡的生物反应器和逆转录病毒法的研究 。

逆转录—巢式PCR法分析胃癌活检组织CD44拼接变异体

目的 改进CD44基因异常表达检测方法，探讨该方法对胃癌早期诊断、转移监测的意义。方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)结合巢式PCR(Nested PCR)技术，检测了89例胃镜活检标本，其中70例胃癌、19例癌前病变(11例非典型性增生、8例肠上皮化生)及其相应的病变旁正常组织活检标本CD44v(CD44拼接变异体)以及CD44v8—10(CD44外显子8—10拼接变异体)的表达。并对巢式PCR产物测序验证其可靠性。结果 建立了逆转录巢式PCR检测胃镜活检标本CD44异常拼接变异体方法。对巢式PCR产物测序证实符合相应的CD44核苷酸序列，结果可靠且更为简便。全部标本均有CD44s(CD44标准型)的表达。胃癌组织CD44v表达阳性率88．6％(62／70)，其中CD44v8—10阳性率72．9％(51／70)。癌前病变组织CD44v表达阳性率为81．8％(非典型性增生9／11)和37．5％(肠上皮化生3／8)，CD44v8—10阳性率在非典型性增生为72．7％(8／11)。病变旁正常组织CD44v阳性率16．9％(15／89)，其中CD44v8-10阳性率13．5％(12／89)。胃癌和非典型性增生组显著高于正常组。本研究对35例在我院行手术治疗的CD44v阳性患者进行了追踪，有2例胃癌患者第1次胃镜检查为非典型性增生，CD44v强阳性表达。分别在第二、三个月后再次行胃镜检查确诊为胃癌。结论 RT—巢式PCR方法灵敏度高、特异性好，应用此法检测CD44v及CD44v8—10在胃癌及非典型性增生活检组织中呈现高表达，可作为胃癌诊断和判断预后的标志之一。

血液筛查实验室转录介导的扩增法室内质控初探

目的通过箱体图法及峰度法对同一数据进行离群值检验,探寻适合转录介导的扩增法使用的室内质控方法。方法使用外部阳性标准物质,每日随当日血液筛查标本一同进行核酸单人份联检,对检测结果分别进行峰度法和箱体图法离群值检验。结果 HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA外部标准物质经检测185次结果,采用峰度法离群值检验分别发生1次、6次和3次离群;采用箱体图法离群值检验分别发生2次、8次和3次离群;外部标准物质检测值离群时诺华内部质控系统未表现出异常。结论使用外部标准物质进行室内质控,可以增强当批次实验结果的可靠性;且根据检测结果是否离群进行分析,推断实验过程是否发生微小变化,对实验室质量体系的建立与提高具有重要的意义。

实时逆转录环介导等温扩增法快速检测甲型肝炎病毒

目的建立甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)实时逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)快速检测方法。方法通过反应引物的筛选、检测温度的优化、灵敏度和特异性研究、模拟样品检测应用,进行甲型肝炎病毒实时RT-LAMP法检测体系建立。结果针对甲型肝炎病毒特异性基因,通过设计筛选出最佳实时RT-LAMP引物组,并使用该组引物特异、灵敏、快速地检测到甲型肝炎病毒。最佳检测温度为63℃,最小检测限为10拷贝/μL,且只对甲型肝炎病毒靶基因特异,检测应用结果可靠。结论实时RT-LAMP技术可以用于食品中甲型肝炎病毒的高效特异性检测,为食品中甲型肝炎病毒的检测工作提供更加有效的技术保障。

实时逆转录环介导等温扩增法快速检测GI型诺如病毒

目的建立实时逆转录环介导等温扩增法(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)快速检测GI型诺如病毒的分析方法。方法通过反应引物的筛选、检测温度的优化、灵敏度和特异性研究、样品检测应用等,进行GI型诺如病毒实时RT-LAPM法检测关键技术的研究。结果针对GI型诺如病毒特异性基因,通过设计筛选出最佳实时RT-LAMP引物组,并使用该组引物特异、灵敏、快速地检测到GI型诺如病毒。最佳检测温度为65℃,最小检测限为22.6拷贝/µL,且只对GI型诺如病毒靶基因特异,检测应用结果可靠。结论本研究建立了GI型诺如病毒的实时RT-LAMP检测方法,可用于GI型诺如病毒的样品检测。

毛细管电泳多重RT-PCR法在儿童呼吸道感染中的应用分析

目的分析毛细管电泳多重反转录聚合酶链(RT-PCR)法在儿童呼吸道感染中的应用效果。方法收集呼吸道感染住院患儿的标本共478例,检测常见的13种呼吸道病原体,并对结果进行统计分析。结果478例患儿中342例呼吸道病原体检测阳性,总阳性率为71.55%,检出病毒共381份,病毒检出率为79.71%,检出率前3位分别为呼吸道合胞病毒(HRSV)26.78%(128/478)、鼻病毒(HRV)18.20%(87/478)和副流感病毒(HPIV)10.67%(51/478)。单一感染率为63.81%(305/478),2种及以上病原体混合感染率为7.74%(37/478),其中以2种病原体混合感染多见。病原体在男性、女性患儿中的检出率比较,差异无统计学意义(χ^(2)=2.38,P>0.05);在年龄0~3个月组、4~6个月组、7个月~1岁组、2~3岁组和>3岁组检出率比较,组间差异有统计学意义(χ^(2)=113.55,P<0.05);在12月、1~3月份不同月份检出率比较,差异亦有统计学意义(χ^(2)=20.32,P<0.05)。结论毛细管电泳的多重RT-PCR法可高效快速准确检测多种病原体,HRSV、HRV和HPIV是引起冬春季节湖州市儿童呼吸道感染的主要病原体,且病原体检出率在不同年龄阶段和不同月份间存在一定差异。

免疫磁性捕获反转录-聚合酶链反应法检测Norwalk病毒

Norwalk病毒(NV)是人杯状病毒的原型,每年可引起2000多万急性胃肠炎病例,是美国暴发性胃肠炎的主要病因。本文建立了一种快速检测NV的免疫磁性捕获反转录-聚合酶链反应(IMC/RT-PCR)方法。

生物制品中逆转录酶活性检查假阳性结果的原因分析及对策

目的对造成生物制品中逆转录酶活性检查假阳性结果的原因进行分析和讨论,并探讨相应的对策。方法查阅生物制品中逆转录酶活性检查方法的相关文献,并结合实际工作中的检定结果进行分析总结。结果多种因素可造成逆转录酶活性检查结果的假阳性,可针对这些原因采取相应的策略。结论逆转录酶活性检查方法的进一步完善,对于生物制品的质量控制具有十分重要的意义。

乳腺癌中法尼酯X受体的表达及意义

目的观察法尼酯X受体(farnesoid X receptor,FXR)在人乳腺癌组织中的表达,并分析其与患者临床病理参数以及ERα、ERβ之间的关系。方法采用RQ RT-PCR技术检测25例新鲜乳腺良性增生组织和60例乳腺浸润性导管癌组织中FXR mRNA的表达水平,并分析其与患者临床病理参数以及ERα、ERβmRNA表达的关系。结果乳腺浸润性导管癌组织中FXR mRNA相对表达水平(9.7±2.7)明显低于良性增生组织(40.8±7.9)(P=0.007);淋巴结转移组FXR mRNA相对表达水平(17.1±9.0)明显高于无淋巴结转移组(4.3±2.9)(P=0.041);乳腺浸润性导管癌组织中FXR mRNA的相对表达水平与ERβ呈正相关(P=0.000,r=0.771),与ERα无相关性(P=0.051)。结论 FXR可能参与乳腺癌的发病,其高水平表达时可能促进乳腺癌的侵袭转移;FXR与ERβ两者表达呈正相关。

新型冠状病毒RNA核酸的检测方法研究及应用

[目的 ] 研究和建立引起严重的急性呼吸道综合征 (SARS)的新型冠状病毒RNA核酸的检测方法。 [方法 ] 使用一步法巢式逆转录聚合酶链扩增法 (RT -PCR)。 [结果 ] 采自临床留观、疑似和临床诊断病人的 10 46份咽漱液 /咽拭子样品中 ,3份样品SARS冠状病毒RNA核酸为阳性 ;在 482份血清样品中 ,有 5份为阳性。 [结论 ] 一步法巢式RT -PCR能检测患者急性期咽漱液 /咽拭子和血清样品中的新型冠状病毒RNA核酸 ,但样本采集的时间和咽漱液

胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶mRNA检测及其意义

目的:通过检测良、恶性胸腔积液脱落细胞端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达情况,探讨其在良、恶性胸腔积液中的诊断价值。方法:采用逆转录-多聚酶链反应法检测39例恶性胸腔积液、16例良性胸腔积液中hTERT基因的表达情况。结果:恶性胸腔积液中hTERT基因的表达率明显高于良性胸腔积液(P<0.05)。检测hTERT基因表达对恶性胸腔积液的敏感性、特异性和诊断符合率分别为87.18%,81.25%和85.45%。结论:hTERT基因参与了恶性胸腔积液的发生、发展过程。采用RT-PCR法检测胸腔积液中hTERT基因表达有助于临床上良、恶性胸腔积液的鉴别诊断。

肝癌组织HNF4αmRNA定量检测方法的建立与初步应用

目的建立一种定量检测肝细胞癌(HCC)组织肝细胞核因子4α(HNF4α)m RNA的方法。方法取手术获得的HCC组织16例,提取总RNA,逆转录PCR扩增获得全长HNF4αm RNA对应c DNA产物,经TA克隆后,测序确认。根据获得序列,设计检测HNF4αm RNA引物及MGB荧光探针。以体外转录HNF4αm RNA为标准品,建立一步法逆转录荧光定量PCR检测方法,同时设定β-actin m RNA为内参对照,最终计算得到组织HNF4αm RNA水平。采用免疫组化染色检测HNF4α蛋白表达,比较HNF4αm RNA水平与HNF4α蛋白表达的对应结果。结果 HCC组织HNF4αm RNA定量标准曲线斜率为-3.237,相关系数r值达0.994,β-actin m RNA定量标准曲线斜率为-3.037,相关系数r值为0.996,表明建立的方法可用于检测HNF4αm RNA定量(V-4α值),16例HCC组织HNF4αm RNA与HNF4α蛋白表达结果呈一致性对应关系。结论我们初步成功建立了定量检测HCC组织HNF4αm RNA水平方法,其意义还需要进一步研究。

去氢骆驼蓬碱治疗细粒棘球蚴病的作用机制研究

目的 应用网络药理学方法预测去氢骆驼蓬碱(HM)治疗细粒棘球蚴病的作用机制。方法 从中药系统药理学数据库(TCMSP)、瑞士靶点预测数据库(SwissTargetPrediction)、药物银行数据库(Drugbank)获取HM相关基因,在基因卡数据库(GeneCards)、DISGENET数据库、DrugBank数据库获取细粒棘球蚴病的作用靶点,将HM的预测靶点和细粒棘球蚴病相关基因相互映射,得到HM作用细粒棘球蚴病的靶点基因,导入String数据库进行网络拓扑属性分析,筛选重要靶点蛋白,构建蛋白质-蛋白质互作(PPI)和成分-疾病-靶点网络。采用DAVID数据库进行基因本体论(GO)功能分析和Kyoto京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,筛选与DNA损伤相关的基因靶点。采用Autodock Vina软件及Pymol软件对相关靶点进行分子对接验证和展示。将活力不低于98%的细粒棘球蚴随机分为空白对照组、1%DMSO组、25μmol/L HM组、50μmol/L HM组、100μmol/L HM组,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(qRTPCR)法、免疫印迹(Western blot)法体外验证HM干预细粒棘球蚴肿瘤蛋白P53(TP53)、拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)、染色体组蛋白H2A的变异体(H2AX)、共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)mRNA和蛋白表达水平。结果 共获得HM靶点105个,细粒棘球蚴病相关基因88个,二者共有靶点为2个。HM干预细粒棘球蚴病的作用靶点主要有促分裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、MAPK1、TP53、热休克蛋白90α家族A类成员1(HSPAA1)、MAPK14、Jun,机制可能涉及MAPK信号通路、受体酪氨酸激酶(ERBB)信号通路、DNA损伤与DNA修复通路、细胞凋亡等过程。体外验证结果显示,与空白对照组相比,25μmol/L HM组、50μmol/L HM组、100μmol/L HM组的TP53,TopoⅠmRNA和蛋白表达均呈下调趋势(P <0.05),H2AX,ATM mRNA和蛋白表达均呈上调趋势(P <0.05)。结论 HM可通过多种生物学过程和相关信号途径治疗细粒棘球蚴病,HM参与细粒棘球蚴病DNA损伤与DNA修复信号通路的调控作用,TP53,TopoⅠ,H2AX,ATM均可能是其作用靶点。该研究为进一步阐明HM治疗细粒棘球蚴病的分子机制奠定了基础。