甜橙转录因子CsGRF04转录激活活性分析

生长调节因子(Growth-regulating factor,GRF)是一类植物特有的转录因子,在植物生长发育、激素信号转导、逆境胁迫响应等多个生物学进程中均发挥重要作用.前期研究在对甜橙GRF家族进行全基因组挖掘与逆境胁迫下表达模式分析的基础上,筛选出一个在多重激素和非生物胁迫处理下均显著诱导上调的关键基因CsGRF04.为了进一步验证CsGRF04的转录激活活性,利用酵母系统与双荧光素酶活性分析(LUC)实验分别进行分析.结果表明,CsGRF04在酵母系统中无法激活报告基因表达从而使酵母细胞在缺陷培养基中正常生长,但在LUC系统中能够显著抑制双荧光素酶活性,说明CsGRF04是一个典型的转录抑制因子.为后续深入研究CsGRF04基因在甜橙抗逆响应中的功能奠定了基础.

拟南芥花组织高表达TCP家族转录因子At1g30210的克隆与转录激活活性鉴定

本文从拟南芥中克隆到基因At1g30210的全长读码框。多序列比对结果表明,在推导的氨基酸水平上,该基因编码的蛋白含有特征性的TCP保守结构域,与已知的玉米、金鱼草和水稻的TCP家族基因中都存在显著性的保守性。另外通过酵母单杂交实验证明该基因编码的蛋白在酵母体内具有转录激活功能。同时RT-PCR实验结果表明,该基因在拟南芥花组织中表达量相对较高,具有明显的组织表达特异性。花器官高表达转录因子的克隆将为研究TCP基因调控植物花发育和花形态建成提供新的物质基础。

极细链格孢菌蛋白激发子Peat1在酵母双杂交系统中转录激活活性检测

以PCR法从pGEX-6p-1-peaT1中扩增出peaT1基因片段,电泳回收后将peaT1基因定向克隆到plexA载体中。将诱饵载体plexA-peaT1经酶切和测序鉴定后,用PEG/LiAC法转化酵母EGY48[p8op-lacZ],并进行诱饵载体转录激活活性检测。结果表明,重组质粒经EcoR I和XhoⅠ双酶切后,琼脂糖凝胶电泳检测可见2条与预期相符的条带,表明诱饵载体构建成功。β-半乳糖苷酶活性分析表明,诱饵载体plexA-peat1无转录激活活性,对酵母菌株也无毒害作用。该诱饵载体可用于酵母双杂交系统中,为下一步筛选cDNA文库奠定了基础。

拟南芥TCP家族转录因子At2g31070的转录激活活性鉴定与表达谱分析

TCP家族转录因子是植物所特有的转录因子家族,它主要在分生组织中起作用,与细胞分化和生长有很大联系。我们以哥伦比亚野生型拟南芥为模板得到基因At2g31070的全长ORF,生物信息学分析结果表明它具有TCP家族保守结构域,属于TCP家族的转录因子。以拟南芥成株不同组织的RNA为模板进行RT-PCR实验,结果发现较之其它组织,该基因在花中有比较高的表达量;通过酵母单杂交实验鉴定该基因具有转录激活活性。综合以上结果,我们认为At2g31070基因在拟南芥花形成发育的过程中发挥转录因子的作用,在一定程度上调控和影响了这个过程。

一种在哺乳动物细胞中研究蛋白分子转录激活活性系统的建立

为了在哺乳动物细胞中建立一套用于研究蛋白分子转录激活活性的系统 ,首先以质粒pTet Off和真核表达载体pCDNA3.1B( ) /myc his为基础 ,分别构建重组质粒pZHO1(用于插入待测基因并作为该系统的阴性对照 )、pZHO2(用于作阳性对照 ) ,此外 ,该系统还包括质粒pTRE luc(编码Firefly荧光素酶报道基因 )和质粒pRL TK(编码Renilla荧光素酶基因 ,用作内参对照 )。为验证该系统的可行性 ,分别将质粒pZHO1、pZHO2、pZHO3(编码p5 3分子N端转录激活区 73个氨基酸片段 ,作为实验组 )与质粒pTRE luc和pRL TK共转染至C4 2、MCF 7、COS73种不同的细胞株中 ,通过检测各转染组细胞中Firefly荧光素酶相对活性的大小来判断该系统的可行性。结果表明 ,所构建的系统可以在哺乳动物细胞中检测目的分子的转录激活活性。

雌激素受体α磷酸化位点突变体T224A和S559A的构建及其转录激活活性检测

目的:构建雌激素受体α(ERα)T224A和S559A磷酸化位点突变体载体,在HEK293T细胞中检测其表达及突变体生物活性的改变。方法:以pc DNA3-Flag-ERα为模板,通过重组PCR技术扩增目的基因片段并突变碱基,插入pc DNA3-Flag载体;将构建的质粒转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western印迹检测融合蛋白的表达,采用萤光素酶报告基因方法检测ERα突变体的活性改变。结果:T224A和S559A磷酸化位点突变体在HEK293T细胞中得到表达,相对分子质量为66×103。在无雌激素(E2)时,野生型ERα及T224A和S559A突变体的转录活性分别为空载体的1.94、1.49和1.84倍;在雌激素存在时,野生型ERα活性增强了1.57倍,T224A和S559A突变体活性分别增强了0.54和0.61倍。结论:224位Thr磷酸化修饰对ERα的活性起重要作用,且2个磷酸化位点突变体受雌激素调控减弱。

水稻矮缩病毒外壳蛋白P9具有体内转录激活活性

将RDV微核心蛋白基因S9克隆到酵母表达载体pGBKT7中,转入AH109酵母细胞,转化子可以在SD/Trp-His-Ade-多营养缺陷固体培养基上正常生长,证明RDV P9在酵母中具有转录激活活性,运用β-半乳糖苷酶的活性分析对重组质粒转化子的转录激活程度做了定量分析,发现与正对照相比,转化pGBK-S9的酵母菌中β-半乳糖苷酶活性可达到正对照的40%以上。构建了含有gusA报告基因的植物表达载体用来分析P9在植物中的转录激活活性,实验结果表明,融合GAL4 DB的P9蛋白可以在植物体内激活报告基因的表达,Western印迹法分析表明了P9蛋白在酵母和植物中均可以表达。证明了在植物体内RDV P9蛋白同样能够激活基因的转录,暗示该蛋白可能在病毒的侵染和复制过程中参与调控病毒或寄主基因的转录表达。

日本结缕草ZjERF2基因的克隆、转录激活活性、亚细胞定位和表达分析

采用RACE的方法,克隆了日本结缕草(Zoysia japonica)ZjERF2基因(GenBank登录号为MH479420)。其开放阅读框为825 bp,编码274个氨基酸,含有一个高度保守的AP2结构域,具有典型的ERF转录因子特征。遗传进化分析表明其与黍(Panicum hallii)ERF亲缘关系最近。利用染色体步移的方法克隆ATG上游1 549 bp的启动子序列,PLACE预测其含有多个响应激素和胁迫处理的作用元件。构建了pGBKT7-ZjERF2载体,转化Y2HGold酵母感受态细胞,结果表明其具有较强的转录激活活性。为探析其亚细胞定位情况,成功构建35S??ZjERF2?YFP载体,本生烟草(Nicotiana tabacum)瞬时表达结果证明ZjERF2定位于细胞核。利用实时荧光定量的方法分析了ZjERF2的表达特征,结果表明ZjERF2基因在日本结缕草不同部位及不同发育时期表达量均有差异,在成熟叶片表达量最高。此外ZjERF2表达受ET、MeJA的诱导,但受ABA、PEG和NaCl的抑制。本研究表明ZjERF2是一个参与多种信号转导途径的转录因子。

铁皮石斛DcNAC1基因克隆、表达及转录自激活活性分析

【目的】克隆铁皮石斛NAC转录因子基因(DcNAC1),并进行表达模式及转录自激活活性分析,为铁皮石斛抗逆相关基因鉴定及其分子机制研究提供参考。【方法】以铁皮石斛cDNA为模板,PCR扩增DcNAC1基因,运用生物信息学软件分析DcNAC1蛋白的理化性质、保守结构域、信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位,通过实时荧光定量PCR检测DcNAC1基因在不同组织和不同逆境胁迫下的表达模式。同时构建该基因的酵母表达载体,分析其转录自激活活性。【结果】从铁皮石斛中PCR扩增获得DcNAC1基因的开放阅读框(ORF),全长为945 bp,与参考序列(LOC110104882)的核苷酸序列相似性为100%。该基因编码314个氨基酸残基,蛋白分子量为35.40 kD,理论等电点(pI)为8.16,为不稳定的亲水性蛋白,定位于细胞核,不含信号肽和跨膜结构域,含有特征性的NAC保守结构域。DcNAC1基因的启动子序列含茉莉酸甲酯响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)、胁迫响应元件(TC-rich repeats)、光响应元件(G-box)、干旱诱导MYB结合位点(MBS)和低温响应元件(LTR)。根中DcNAC1基因的相对表达量在高温胁迫和低温胁迫处理6 h分别达最高,显著高于处理0 h(P<0.05,下同);茎中DcNAC1基因在盐胁迫处理48 h的相对表达量达最高,显著高于处理0 h。将构建的重组质粒pGBKT7-DcNAC1转化酵母菌株Y2HGold,结果发现该重组质粒无毒性,DcNAC1蛋白具有自激活活性。【结论】DcNAC1基因表达受到茉莉酸、低温、干旱、光信号和逆境胁迫等多种信号的调控。DcNAC1蛋白具有自激活活性,通过激活下游基因的表达,参与到植物生长发育和逆境胁迫响应的转录调控过程中。

PC-1分子转录激活功能研究

PC 1基因是在人前列腺癌细胞中克隆的新基因 ,表达水平随前列腺癌恶性程度增加而升高 ,其表达产物具有转录因子的一些特征 .为研究PC 1分子的转录激活功能 ,首先应用酵母双杂交系统将PC 1全长以及不同区段的cDNA克隆到表达载体pAS2 1中 ,然后分别转化酵母细胞株CG 194 5 .lacZ和His3报告基因激活的检测结果表明 ,该分子具有转录激活活性并将该活性定位于N端的 4 6个氨基酸区域 .此外 ,将PC 1分子不同区段的cDNA分别克隆至表达载体pZHO1中 ,将它们与报告基因质粒pTRE luc共转染哺乳动物细胞COS7和C4 2 ,Firefly荧光素酶相对活性的检测结果表明 ,该分子N端的 4

大豆MYB转录因子基因GmMYBJ6和GmMYBJ7的克隆及表达分析

MYB转录因子以保守的DNA结合域为共同特征,是植物最大的转录因子家族之一,广泛参与植物代谢调控。本文根据植物中MYB转录因子的DNA保守结构域,通过RT-PCR和RACE的方法从大豆品种吉林3号的叶片中分离得到了2个MYB基因GmMYBJ6和GmMYBJ7,并对其结构特征和表达特性进行了分析鉴定。基因组DNA序列分析表明,两个基因都含有两个内含子;酵母系统检测表明,两个基因均具有转录激活活性;β-半乳糖甘酶活性分析表明,内含子的存在使两个基因的转录激活活性明显降低;实时荧光定量PCR检测结果显示,GmMYBJ6在大豆中的表达受ABA、GA3和NAA的诱导,而GmMYBJ7的表达则受ABA和NAA的诱导;半定量RT-PCR分析表明,两个基因在大豆的根、茎、叶、花和未成熟种子中均有表达。GmMYBJ6和GmMYBJ7为典型的R2R3-MYB转录因子新基因;他们在大豆中的表达可能与ABA和NAA的信号转导途径有关。

大豆转录因子基因GmMYB111的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆MYB转录因子基因,进行序列分析和表达模式分析,并对其功能进行鉴定。【方法】通过对盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据分析,获得一个MYB转录因子Gm MYB111;以盐胁迫处理的c DNA为模板,利用RT-PCR法分离克隆MYB基因c DNA编码序列;根据Gm MYB111蛋白序列进行同源性搜索,得到与Gm MYB111蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5.05对Gm MYB111蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在大豆中受非生物胁迫诱导表达情况及组织特异性表达情况;利用拟南芥原生质体转化体系分析Gm MYB111的亚细胞定位情况;通过酵母杂交系统检测其转录激活活性以及体外结合活性。【结果】根据前期江苏省农业科学院农业生物技术研究所盐土农业研究室盐胁迫相关的数字表达谱(DGEP)数据获得盐胁迫响应显著上调(27倍)的Gm MYB111,利用RT-PCR方法从栽培大豆根组织中克隆该基因片段,序列比对发现其与已公布的Williams82基因组数据库序列一致,生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有MYB类转录因子的共同特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,同时其C-端还存在一个富含酸性氨基酸的转录激活区;系统进化树分析表明,该基因编码的蛋白与Gm MYB76、Gm MYB12a以及苜蓿Mt MYB61的亲缘关系最近;Gm MYB111在大豆中的表达受高盐、干旱、冷害和ABA诱导表达,实时荧光定量PCR检测结果显示,在高盐和冷害胁迫下,Gm MYB111呈上调表达,在干旱胁迫诱导后呈先上调后下调的表达模式,在ABA诱导下其表达量呈现波动式上调和下调表达;时空表达分析表明,Gm MYB111为组成型表达,在大豆幼苗期和成熟期的表达量相对较强,成熟期的表达量相对较低,从不同组织来看,Gm MYB111在茎、叶和花中表达量最高,在根中表达量相对较低,在豆荚中不表达;亚细胞定位结果显示Gm MYB111定位于细胞核中,为典型的转录因子;酵母杂交系统检测表明,Gm MYB111具有转录激活功能,并且能够与顺式作用元件TAACTG基序相结合。【结论】Gm MYB111为典型的R2R3-MYB转录因子基因,具有转录激活活性及DNA结合活性,在大豆中的表达可能与大豆的非生物胁迫和ABA信号转导途径有关,推测其可能通过调节下游基因的表达来调控大豆对非生物胁迫的应答。

大豆GmTGA15基因的克隆、转录激活活性分析及亚细胞定位研究

以大豆“Williams 82”为试验材料,利用RT-PCR法从中克隆得到转录因子GmTGA15基因。生物信息学分析表明,GmTGA15基因组序列包括8个外显子和7个内含子,开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸;蛋白理化性质分析表明,GmTGA15蛋白分子量为41.01 kDa,理论等电点为6.28,为亲水性蛋白;蛋白一级结构具有1个典型的bZIP保守结构域,属于bZIP转录因子家族,与其他15种植物TGA(TGACG motif-binding factor)蛋白同源比对及系统进化分析显示,均具有相同的bZIP保守结构域,与同科植物野大豆亲缘关系最近,为97.25%;其蛋白二级结构预测α-螺旋为主,占63.81%。通过酵母单杂试验验证GmTGA15具有转录激活活性;利用PEG4000介导法将融合表达载体转化拟南芥原生质体,发现GmTGA15定位于细胞核。TGA转录因子在植物抵御逆境胁迫及生长发育中起重要作用。此结果将为GmTGA15基因功能的进一步研究提供基础,也为植物抗逆调控机制的研究提供理论参考。

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。

水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的酵母双杂交载体的构建及自激活效应检测

将编码水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的S3,S7,S8,S9,S10,S11和S12基因分别克隆到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中,转化AH109酵母细胞,结果显示:除pGBK-S10转化子可以在SD/-Trp和SD/-His营养缺陷固体培养基上正常生长外,其它转化子均只能在SD/-Trp或SD/-Leu营养缺陷固体培养基上正常生长。通过α-半乳糖苷酶活性分析揭示,除pGBK-S10可以在SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长并变蓝外,其它均不变蓝。结果证实:RGDVPn10在酵母细胞中具有转录激活活性,融合GAL4的RGDVPn10蛋白可以在酵母细胞内激活HIS3和MEL1报告基因的表达。暗示该蛋白可能在病毒的侵染和复制过程中参与调控病毒或寄主基因的转录表达。

人糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及其活性研究

目的构建人糖皮质激素受体变异体表达载体,研究其表达和功能。方法运用RT-nested PCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD(ligand b ind ing dom ain)的cDNA序列,将PCR产物定向克隆至pEGFP-N2质粒载体,测序筛选重组质粒;荧光显微镜观察重组质粒转染表达情况;相对荧光素酶法检测GR转录激活活性。结果扩增出长1 601 bp的cDNA序列,测序证实:克隆片段与Genbank该基因序列同源性为100%;重组质粒表达产物定位于细胞核;转染组细胞转录激活活性增强。结论成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体,该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。

薰衣草LaMYB1转录因子的克隆及表达分析

本研究获得了薰衣草转录因子MYB基因,并探究了该基因在薰衣草不同组织、花器官不同时期的表达特性和转录激活活性。采用RACE和RT-PCR技术克隆了薰衣草(Lavandula angustifolia Mill.)LaMYB1转录因子,该基因全长729 bp,编码242个氨基酸,蛋白分子量为27.60 kDa,等电点为9.01。该基因与白桦BpMYB21基因亲缘关系较近。薰衣草LaMYB1基因在‘杂花’和‘法国蓝’两个品系不同组织和花器官不同时期的表达规律具有相似性,该基因在雄蕊的表达量最高,在衰败期的表达量最高。α-蒎烯、乙酸薰衣草酯、氧化石竹烯、莰烯和柠檬烯在雄蕊中的含量最高,这些萜类物质在两个品系不同组织中的含量变化规律与LaMYB1基因在不同组织中的相对表达量变化规律一致;LaMYB1基因在‘法国蓝’薰衣草中的相对表达量最高,右旋樟脑和柠檬烯的含量在‘法国蓝’薰衣草衰败期最高。薰衣草LaMYB1基因具有转录激活活性。

松材线虫Bx-HSF-1转录激活活性研究

【目的】通过研究松材线虫热激转录因子Bx-HSF-1转录激活活性及其靶基因在松材线虫7个虫态(龄)的表达量,揭示Bx-HSF-1在松材线虫生长发育过程中的具体功能。【方法】构建pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒,转化酵母AH109菌株,验证Bx-HSF-1的转录激活活性。应用RNA干扰(RNAi)和转录组技术鉴定Bx-hsf-1基因沉默后松材线虫差异表达基因。对差异表达基因进行基因互作分析,筛选出受Bx-HSF-1调控的靶基因。应用RT-qPCR鉴定5条靶基因在J_(2)、DJ_(3)、DJ_(4)、J_(3)、J_(4)、雌成虫和雄成虫共7种虫态(龄)中的表达量。【结果】转入pGBKT7-Bx-hsf-1重组质粒的酵母AH109菌株能够在SD/-Trp和SD/-Trp/-His/-Ade培养基上正常生长,并且在SD/-Trp/-His/-Ade+X-α-gal培养基中显蓝色,表明Bx-HSF-1能够激活下游报告基因表达,具有转录激活活性。通过荧光显微观察及RT-qPCR验证,RNAi处理12 h后靶向siRNA可顺利导入松材线虫细胞,且有效抑制Bx-hsf-1的表达。RNAi处理后转录组数据分析共鉴定到110条差异表达基因,其中86条下调表达。基因互作分析筛选到5条靶基因(Bx-daf-21、Bx-hsp-1、Bx-hsp-70、Bx-sti和Bx-cdc),通过RT-qPCR对这5条靶基因在7种虫态(龄)中的表达量进行分析。在7种虫态(龄)中,Bx-daf-21与Bx-hsf-1的表达量变化趋势一致,Bx-hsp-70与Bx-hsf-1表达量变化趋势相反,Bx-sti和Bx-hsp-1与Bx-hsf-1表达量变化趋势无相关性。在DJ_(3)中,Bx-cdc与Bx-hsf-1表达量变化趋势相反。【结论】松材线虫Bx-HSF-1具有转录激活功能,通过转录调控参与松材线虫各虫态(龄)发育过程。

蒙古沙冬青AmNAC2蛋白转录激活活性及其编码基因表达分析

NAC转录因子家族与植物抗逆性和生长发育关系密切。本研究利用酵母自激活体系对克隆自强抗逆植物蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)的AmNAC2基因的编码蛋白进行了转录激活活性分析,同时利用RT-qPCR技术检测了该基因在不同逆境胁迫和不同器官中的表达变化。结果显示,AmNAC2的完整蛋白产物(含292个氨基酸)及其C端部位(第159~292位氨基酸)具有转录激活活性,而其N端部位(第1~158位氨基酸)无此活性;室内培养的蒙古沙冬青幼苗中AmNAC2的表达水平受低温、高盐和高温胁迫诱导迅速显著上调,而其在干旱胁迫下的表达上调较为迟缓;野外蒙古沙冬青成株嫩叶中,该基因的转录水平在秋季和冬季明显高于春、夏两季,而在春季野生成株的不同器官中,其表达量在根中最高,其他依次为叶片、嫩枝、未成熟果荚和花蕾。本研究结果为深入分析AmNAC2的生理功能和作用机理提供了依据。

大鼠肺泡巨噬细胞Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1表达变化及其调节糖皮质激素受体功能的研究

目的:在模拟大鼠肺泡巨噬细胞炎症合并糖皮质激素治疗的条件下,阐明Bcl-2相关抗凋亡蛋白-1(BAG-1)的表达变化及其对糖皮质激素受体(GR)功能的调节作用。方法:Western blot检测脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1表达变化;免疫共沉淀法检测核蛋白中BAG-1与GR相互结合作用;相对荧光素酶法检测GR转录激活活性。结果:LPS和Dex作用后,细胞总蛋白中BAG-1 L表达增加,BAG-1 S表达无变化;核蛋白中只能检测到BAG-1 L,表达量在LPS作用24 h内逐渐增加;细胞核内BAG-1 L与GR在LPS和Dex作用后存在着相互结合,同时GR转录激活活性逐渐降低,其变化与核蛋白中BAG-1 L表达变化呈负相关。结论:LPS和Dex作用大鼠肺泡巨噬细胞BAG-1 L表达增加,与GR结合后共同转核,并抑制GR活性。该机制可能是感染条件下糖皮质激素抵抗的重要因素。