棉花中一个新型转录因子GhWRI1的表达特征与功能分析

AP2(APETALA2)/EREBP(ethylene-responsive element binding protein)是一类特异性存在于植物中的转录因子,在植物中的许多代谢过程都起着十分重要的作用。从棉花中分离并获得了一个新的AP2基因GhWRI1,该基因长1 314 bp,所编码的蛋白含有437个氨基酸,分子量约为48 kD,pI为5.77。序列分析结果显示,GhWRI1蛋白含有2个AP2结构域,该蛋白属于AP2家族;与GFP蛋白的融合表达试验结果显示,在洋葱表皮细胞中,GhWRI1是特异性在细胞核中表达的。Real-time RT-PCR数据显示GhWRI1主要在真叶、根、纤维以及种子中表达,而且其在纤维和种子中的表达量是随着发育时间的推移而不断升高的。同时构建了GhWRI1与LUC共表达的载体,通过检测LUC的活性来反映GhWRI1的表达量,试验数据显示,当GhWRI1与LUC共表达后,LUC的活性提高了约20倍。试验结果都显示GhWRI1是一个很强的转录激活子。

环境化学物雄激素干扰活性检测方法的建立

目的:建立雄激素受体(AR)介导的荧光素酶(Luc)报告基因试验方法,为化学物拟/抗雄激素活性的检测提供研究工具。方法:构建受雄激素反应元件调控的荧光素酶报告基因质粒pMMTV-Luc,将该质粒与表达AR的质粒AR/pcDNA3.1和阳性对照质粒phRL-tk共转染CV-1细胞,建立AR报告基因试验。以5α-双氢睾酮(5α-DHT)为阳性对照检测该方法的筛选效率。CV-1转染后用受试化学物染毒,根据Luc表达的变化,判断化学物的雄激素干扰活性。结果:5α-DHT对共转染三种质粒的CV-1的诱导作用表现为:10-10M的5α-DHT显著诱导Luc的表达,10-7M时达最大值,诱导倍数为61.83倍,计算其半数效应浓度EC50为3.65 nM。糖皮质激素受体(GR)激动剂地塞米松(dexamethasone)不诱导Luc的表达。AR拮抗剂氟他胺(flutamide)在10-7M～10-5M浓度范围内显著拮抗1nM的5α-DHT诱导的Luc的表达,其半数抑制浓度(IC50)为3.49μM。BPA在10-6M和10-5M时能拮抗1 nM 5α-DHT诱导的Luc的表达,其IC50为2.14μM。结论:本研究建立的AR报告基因试验具有较高的灵敏度和特异性,化学物BPA具有抗雄激素活性。

改良的环境化学物雌激素干扰活性检测方法的建立和应用

目的建立雌激素受体(ER)介导的荧光素酶(Luc)报告基因试验方法,为化学物拟(抗)雌激素活性的检测提供研究工具。方法将受雌激素反应元件调控的荧光素酶报告基因质粒pERE-aug-Luc和表达ER的质粒rERα/pCI转染Vero细胞,建立ER报告基因试验。以雌激素(E2)为阳性对照检测该方法的筛选效率。Vero转染后用受试化学物染毒,根据Luc表达的变化,判断化学物的雌激素干扰活性。结果雌激素对转染两种质粒的Vero的诱导作用表现为:10-7 mg/L的雌激素显著诱导Luc的表达,最大诱导倍数为100.959倍,半数效应浓度EC50为3.57×10-6 mg/L。化学物BPA可诱导Luc的表达,其中在0.01mg/L时即可显著性的诱导Luc表达,未发现BPA具有雌激素拮抗作用。结论本研究建立的ER报告基因试验具有较高的灵敏度和特异性,化学物BPA具有拟激素活性。