基于T7转录系统的谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的创建

本研究以前期构建的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pAU2为基础,通过添加T7 RNA聚合酶编码基因及人工合成的克隆表达区,构建了1个新的谷氨酸棒杆菌分泌型基因高效表达载体pAU29KS。pAU29KS载体克隆/表达盒使用T7启动子作为目的基因的启动子,通过载体序列中T7 gene 1基因编码的T7 RNA聚合酶与T7启动子互作来进行目的基因的高效转录;启动子区下游使用谷氨酸棒杆菌核糖体结合位点RBS保守序列(gaaagga)来高效起始目的蛋白合成;克隆/表达盒RBS与多克隆位点MCS之间使用谷氨酸棒杆菌强信号肽cgl_2070编码序列来进行目的蛋白的胞外高效分泌。以嗜热脂肪土芽孢杆菌的α-淀粉酶AmyF作为报告蛋白,进行谷氨酸棒杆菌C.glutamicum/pAU29KS表达系统的蛋白分泌生产能力检测。透明圈法检测结果显示,工程菌株C.glutamicum/pAU29KS-amyF能够在淀粉平板上产生清晰可见的透明圈;培养物上清液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和Western Blotting检测结果都显示出清晰的特异性条带,与AmyF预测分子量相一致;淀粉酶活性检测结果显示,培养物上清液呈现高淀粉酶活力,而细胞裂解上清液未检测到淀粉酶活力,说明高效表达的α-淀粉酶在强信号肽cgl_2070的介导下完全分泌到胞外培养基中。本研究构建的基于T7转录系统的C.glutamicum/pAU29KS能够对目标蛋白进行高效分泌生产,是一套新的谷氨酸棒杆菌分泌型重组蛋白表达系统。

真核细胞转录系统启动T7启动子起始的研究

利用氯霉素乙酰转移酶基因 (CAT)和人低密度脂蛋白受体基因 (LDLR)作为报道基因 ,根据α -鹅膏蕈碱 (α -amanitin)对真核生物RNA聚合酶的选择性抑制 ,分析T7噬菌体启动子为哺乳类动物细胞启动外源基因表达的机制 结果表明 :真核生物RNA聚合酶Ⅱ可启动T7启动子的转录 ;同时应用DNA -蛋白质凝胶泳动技术 ,发现人工合成的T7启动子能与核蛋白质结合 。

利用PCR技术构建体外高效转录系统

设计并合成了一对 PCR 反应引物,其5′端引物除含有目的基因5′端序列外,还外加 T7 RNA 聚合酶启动子的17个核苷酸.3′端引物则按常规设计.以染色体 DNA为模板,通过 PCR,可扩增出带有 T7 RNA 聚合酶启动子的目的基因 DNA 片段.以此 PCR 产物为模板,在体外成功实现了高效转录.这是一种快速、简便构建体外高效转录系统的好方法.

以太网技术在Firefly仪器T3数据转录系统中的应用

Firefly仪器是一款新型的无线地震数据采集系统,它能够适应各种复杂的勘探环境和地质条件,具有很高的施工效率和较低的HSE风险。本文在深入研究以太网及其通信协议的基础上,从组网方式、传输协议和通信管理这三个方面对Firefly仪器T3数据转录系统的工作原理做了深入地分析探讨,并提出了自己的观点,给出了一种提高地震数据下载速度的以太网设计方案,为更好地使用这种新仪器奠定了基础。

双噪声激励下的基因转录调控系统的稳态分析

鉴于噪声对生物系统的基因转录调控有着重要的影响作用,研究了乘性高斯白噪声和加性Lévy噪声共同激励下的基因转录调控系统的动力学特性。首先借助Janicki-Weron算法模拟出Lévy噪声,然后利用四阶Runge-Kutta算法计算出蛋白质浓度的稳态概率密度函数,并通过绘制其图像对系统的动力学行为进行稳态分析。研究发现:高斯噪声强度、Lévy噪声强度、稳定性指标、偏斜参数均会诱导蛋白质浓度发生相变现象,且这些参数指标的增大会使基因转录调控系统逐渐从“开启”状态转变为“关闭”状态。

减肥胶囊对肥胖大鼠脂肪组织瘦素受体后JAK-STAT信号转录系统的影响

目的:研究减肥胶囊对瘦素受体后信号转录系统的影响,从分子水平探讨减肥胶囊的减肥机制。方法:采用77只普通级SD雄性仔鼠,随机分为空白组10只和高脂饲料组67只,两组体重比较无显著性差异。空白组给予普通饲料,高脂饲料组给予高脂饲料,喂养8周后,选取高脂饲料组大鼠体重高于空白组大鼠平均体重的20%作为肥胖大鼠模型。将复制成功肥胖大鼠随机分为模型对照组、减肥胶囊高剂量组、低剂量组3组。各组均喂普通饲料,高剂量组和低剂量组分别按13.7,6.85 g·kg-1 ig减肥胶囊水煎液(10 mL·kg-1·d-1),空白组和模型对照组ig等体积蒸馏水,共ig 4周。4周后,称重,麻醉大鼠,腹主动脉穿刺取血后,迅速摘取下丘脑和生殖器周围脂肪,采用组织原位杂交法检测下丘脑和脂肪组织酪氨酸蛋白激酶(JAK1),信号转导及转录活化因子(STAT3),信号转导及转录活化因子6(STAT6)基因表达水平。结果:不同浓度的减肥胶囊水煎液能够提升肥胖大鼠下丘脑和脂肪组织中JAK1,STAT3,STAT6基因表达水平,但同时发现,模型对照组下丘脑和脂肪组织中JAK1,STAT3,STAT6基因也处于高水平表达;高剂量组和低剂量组之间存在着一定的不统一性,存在着一定的量效关系。结论:减肥胶囊的作用机制可能是通过对下丘脑和脂肪组织中瘦素受体后信号转录系统的影响而发挥作用,但其机制还需要作进一步的探讨。

PCR辅助转录滴定系统定量检测AFP mRNA方法的建立

目的 :建立 PCR辅助转录滴定系统 (PATTY)定量检测 AFP m RNA的方法。方法 :采用 RT- PCR定点替代突变及体外转录技术合成单碱基突变 AFP m RNA内竞争模板 ,以竞争性 RT- PCR定量检测各肝癌细胞株 AFP m RNA。结果 :成功制备引入 Hind 酶切位点的单碱基突变 AFP m RNA内竞争模板 ,建立 PATTY定量检测 AFP m RNA的方法 ;检测 1μgHep G2 和 Huh7两株肝癌细胞总 RNA中 AFP m RNA含量皆为 10 1 0 copy/ μg,PL C/ PRF/ 5细胞株为 10 7copy/ μg。 结论 :PATTY检测 AFP m RNA能同步监控待检靶 m RNA逆转录过程 ,扩增效率不受 PCR诸因素干扰 ,检测结果可靠 ,适合微量循环肝癌细胞相关 AFP m RNA的定量检测研究。

杀香鱼假单胞菌Ⅲ型分泌系统转录调控蛋白ExsA突变株的构建及其对大黄鱼的毒力特征分析

杀香鱼假单胞菌是大黄鱼内脏白点病的致病菌,感染该菌常会导致养殖大黄鱼很高的死亡率和严重的经济损失。病原株NB2011编码典型的Ⅲ型分泌系统,可能是该菌重要的毒力因子,ExsA是控制此分泌系统表达的重要调控蛋白。为确认ExsA在NB2011致病过程中的作用,开发有效疫苗,实验采用双交换同源重组法构建了ExsA内部序列被卡那霉素基因替换的突变株,检测突变株与野生株对鼠巨噬细胞J774的黏附、内化和胞内增殖特性,并比较对大黄鱼的毒力变化,同时,通过透射电子显微镜观察人工感染后大黄鱼内脏组织的病理变化。研究表明,巨噬细胞对突变株的内化率降低,内化的细菌在12 h内被清除,野生株在内化后虽然一段时间内数量稍有下降,12~24 h期间数量急剧上升;突变株对大黄鱼的96 h LD_(50)为2.59×10~7/mL,比野生株高数百倍;电镜切片中未观察到组织内有菌体的存在,表明突变株的毒力明显减弱,可以作为弱毒疫苗的开发对象。

逆转录病毒表达系统及其在外源蛋白高效表达中的应用

逆转录病毒表达系统是一种新的重组蛋白高效表达系统,它由逆转录病毒载体,包膜蛋白载体和包装细胞系构成,在基因治疗和生物制药领域有很大的应用潜力。逆转录病毒和宿主细胞基因组的重组倾向于发生在转录活性区;口炎疱疹病毒-G蛋白(vesicular stomatitis virus G,VSV-G)能有效扩大逆转录病毒感染宿主细胞的范围、提高逆转录病毒的感染效率;用高滴度的重组病毒感染细胞,经过简单的筛选即可获得高表达细胞株。就逆转录病毒表达系统的组成、感染的特点和机制及其应用前景作了概述。

非高斯噪声激励下的基因转录调控系统

考虑生物生长过程中受到的不可预知的跳跃性的环境扰动,运用一类非高斯噪声建立了随机的基因转录调控系统. 利用 Monte Carlo 法得到了系统的稳态概率密度函数,研究了非高斯噪声的各个参数对蛋白质浓度的影响,发现噪声强度不能够诱导基因开关,而稳定性指标和偏斜参数能够作为基因开关的控制参量. 进一步研究了非高斯噪声作用下系统从一个态跃迁到另一个态的平均首通时间(MFPT) ,并讨论了各个参数不同的作用机理.

时间延迟和关联噪声对基因转录调节系统统计性质的影响

研究延迟时间τ和交叉关联噪声对基因转录调节系统关联函数C(s)和弛豫时间TC的影响.在小延迟近似下,利用微扰理论,得到了系统的定态概率分布函数Pst(x).基于Pst(x),通过Stratonovich解耦近似框架导出了C(s)和TC的近似表达式.数值计算结果表明,TC随乘性噪声强度D的变化曲线呈一单峰结构,τ和噪声间正关联时的关联强度λ的增大均使TC增大,而噪声间负关联时|λ|和加性噪声强度α的增大则使TC减小;系统态变量x(蛋白质浓度)的C(s)随时间s呈指数规律衰减,τ对C(s)的影响显示一个临界行为,即存在一个临界值τC,当τ<τC时,τ的增大使C(s)增大,而τ>τC时,使C(s)减小.λ>0时,λ增大使C(s)增大,而λ<0时,使其减小.D对C(s)的影响也显示一个临界行为,即D较小和较大时D的增大对C(s)的影响相反,然而,α的增大只会使C(s)值减小.

基因转录调节系统中噪声和时间延迟诱导的相变行为研究

用定态概率分布来研究基因转录调节系统中噪声和时间延迟诱导的相变行为.结果表明,延迟时间、噪声间的关联强度、乘性噪声强度的增大均可引起系统发生相变,即系统由双稳态变成单稳态,系统中蛋白质浓度状态可由"开"到"关"或由"关"到"开"转换.但是,噪声间为正关联时,关联强度和延迟时间的增大对系统起相反作用,而噪声间为负关联时,关联强度和延迟时间的增大对系统起相同作用.此外,加性噪声强度的增大不会引起系统的相变行为,但可以改变系统状态的稳定性.

重组逆转录病毒载体系统的建立及其感染滴度的研究

选择新霉素磷酸转移酶II(NeoR)做为标记基因 ,将重组逆转录病毒载体经包装细胞包装后得到的重组病毒浓缩后 ,应用该重组逆转录病毒载体系统体外感染靶细胞NIH3T3以测定其滴度 ,其滴度可达到 1 0 6。

神经系统特异性转录因子Nhlh2的研究进展

Nhlh2(nescient helix-loop-helix2)基因,又名HEN2(HUA ENHANCER2)和NSCL2(neuronal stem cell leukemia2)(或NSCL-2),其编码蛋白是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子家族的新成员,在神经系统中尤其是神经内分泌组织中特异性表达。目前已在鸡、小鼠、大鼠、牛和人类等多种真核生物中发现其同源基因,该基因的功能研究主要集中在神经内分泌系统、视网膜发育和肿瘤等相关领域,对其分子调控机制的探询已经取得一些初步成果。本文将从Nhlh2的基因和编码蛋白的特性、表达时空、功能研究以及调控与被调控机制等方面对其研究进展进行综述,并对今后的研究提出了展望和思考。

转基因拟南芥中雌激素诱导的转录激活系统诱导条件的优化

[目的]探索雌激素诱导的转录激活系统(XVE)在拟南芥中高效表达外源蛋白的条件。[方法]构建XVE-AtNF-YA10:3×flag植物表达载体,转化拟南芥并获得了阳性植株;采用3种不同的诱导表达条件对外源蛋白的表达量进行检测。[结果]1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗外源融合蛋白表达量最高,进一步研究表明1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗在受诱导后8、16、24和32 h外源融合蛋白均有表达,在16 h时表达量达到最高,并持续到32 h。[结论]AtNF-YA10:3×flag融合外源基因最优表达条件为1/2MS培养基生长10 d后的拟南芥转基因苗雌激素诱导16 h。

基于立足开关的无细胞转录翻译系统及其在感染性疾病分子诊断中的应用

感染性疾病严重威胁人类健康,也是临床工作的主要难题之一。分子诊断是感染性疾病诊断的重要部分。临床上常用的分子诊断方法为聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),但其对仪器、场地、人员的专业性要求限制了它在感染性疾病诊断中的应用。近年来,RNA调节系统被开发应用于分子诊断的研究日益增多[1-2]。立足开关(toehold switch)属于RNA核糖调控元件,它通过与目标RNA序列的碱基互补配对来控制基因表达[3]。

不同病毒载体系统应用于水牛体细胞转基因的研究

为了筛选出能高效率感染水牛体细胞、实现基因转移的病毒表达载体系统,试验采用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的3种不同病毒载体介导的转基因,即逆转录病毒载体(pMX-EGFP)、诱导型慢病毒载体(FUW-TETO-EGFP)和慢病毒载体(FUGW-EGFP)系统进行病毒包装,然后分别一次或二次感染不同的水牛体细胞[水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)和水牛胃细胞(BSTC)],应用荧光显微镜观察EGFP是否表达,然后用流式细胞仪检测感染效率,最后用G418对感染效率低的病毒载体系统进行阳性细胞系筛选。结果表明:3种病毒载体系统均能感染BFFs和BSTC,实现了基因的转移和表达,FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率显著高于pMX-EGFP系统(P<0.05);除FUGW-EGFP系统感染BSTC外,同种类型病毒载体系统感染同种细胞,二次感染的感染效率高于一次感染,但均差异不显著(P>0.05);同一病毒载体系统一次感染BSTC的效率高于感染BFFs。说明FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率高于pMX-EGFP系统,而且BSTC比BFFs更易被病毒感染。

体外转录mRNA系统的建立及其在呼吸道合胞病毒疫苗中的应用

目的建立mRNA的体外转录系统,并用于评价呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)mRNA疫苗的免疫效果。方法以增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)为模式蛋白,将EGFP基因分别克隆入pcDNA3.1(+)和pmRV载体中,通过体外转录合成EGFP mRNA,以验证载体及mRNA框架结构的正确性;然后将RSV融合前F蛋白(RSV preF)序列构建于经验证的载体,体外转录合成RSV preF mRNA;转染细胞后,通过荧光显微镜、流式细胞术、免疫荧光和Western blot等方法验证蛋白表达;进一步通过微流控技术用脂质体纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNP)包封体外转录合成的mRNA,经过粒径和多分散性指数检测后进行小鼠免疫和评价。结果经过验证发现,pcDNA3.1(+)的框架结构更适合mRNA;EGFP mRNA转染HEK 293T细胞24 h后,体外转染效率>90%;免疫荧光和Western blot等方法验证RSV mRNA能够在24 h内表达preF;包封后的RSV mRNA疫苗免疫小鼠,血清抗体滴度与RSV preF蛋白免疫抗体滴度相近(P>0.05),细胞因子IFN-γ和IL-4均有一定程度的上调。结论建立了正确表达目的蛋白的mRNA体外转录系统,以此为基础的RSV mRNA疫苗在小鼠体内可诱导强的免疫应答,为潜在的RSV mRNA候选疫苗奠定了基础。