海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建

利用RT-PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基因(AOC),并进行序列测定和BLAST程序进行同源序列分析。从RT-PCR得到的产物,其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化酶基因AO(CBAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体pBS-AOC,pJIT60-AOC,最后克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到双35S的pGreenII0229-AOC植物表达载体。AOC基因和ipt基因通过中间载体pBS-AOC,pBS-ipt,pBS-AOC-ipt,pJIT60-AOC-ipt;最后将AOC和ipt基因以转录融合的方式克隆到植物表达载体pGreenII0229上,得到具有双35S启动子的AOC,ipt双基因转录融合的植物表达载体pGreenII0229-AOC-ipt。

AOC-ipt转录融合基因转化热研5号柱花草

以无菌热研5号柱花草子叶为材料,采用农杆菌介导把AOC-ipt基因转录融合转化热研5号柱花草,通过10 mg/L的潮霉素筛选,获得约500余株抗性苗,通过PCR检测获得23株阳性苗,对这23株阳性苗进行RT-PCR检测,其中14株为阳性。对这14株转基因苗进行了抗盐性初步观察,转基因苗并没有明显地提高热研5号柱花草的抗盐能力。

百脉根根瘤菌nod-lacZ转录融合子构建及表达分析

根据Mesorhizobium loti基因组信息,克隆nodA、nodB、nodD等基因的启动子序列,分别与报告基因构建相应的转录融合子(nod-lacZ),并分别导入中慢生型百脉根根瘤菌MAFF303099和广谱根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.)中,利用百脉根根的抽提物作为诱导物,检测结瘤基因的表达。结果表明:在MAFF303099菌株中,百脉根根抽提物不能诱导nodA的表达;能诱导nodB和nodD1的表达;nodD2呈组成型表达;供试的5种不同的类黄酮化合物都不能诱导nodA基因表达;在NGR234菌株中,毛地黄酮(Luteolin)能诱导nodA表达。

防御假单胞菌FD6中RpoS蛋白理化性质预测及rpoS-lacZ转录融合结构构建

Sigma因子是一类依赖于DNA的RNA聚合酶亚基,在生防细菌中通常可调控抗生素的合成。防御假单胞菌(Pseudomonas protegens) FD6中rpoS基因编码的RpoS蛋白是一类非必需sigma因子。利用BPROM在线工具预测rpoS基因的启动子区,并用PCR技术将其克隆到pRG970Km质粒中无启动子的lacZ基因上游,将构建的rpoS-lacZ转录融合质粒转化至菌株FD6中,为后续抗生素合成调控机制的探究提供重要的试验材料。此外,利用生物信息学方法分析P.protegens FD6中RpoS的功能,并通过邻接法构建RpoS的系统发育树。结果表明:FD6中RpoS蛋白分子量约为38 ku,理论等电点为5.14;具有多个磷酸化位点;无跨膜结构,且N端无信号肽;二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。系统发育树结果显示, FD6中RpoS蛋白的氨基酸序列与防御假单胞菌Pf-5相似性最高,二者在系统发育树中位于同一分支。

慢性髓性白血病异基因造血干细胞移植后M-bcr/abl及m-bcr/abl融合转录子追踪观察

为研究慢性髓性白血病 (CML)异基因造血干细胞移植 (SCT)后M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子表达特征 ,采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术测定 72例CML患者SCT后不同时间骨髓M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子的表达。结果显示 ,CML患者移植后 <6个月M bcr/abl阳性率 (79.2 % ,4 2 /5 3)显著高于 6 - 12个月(34.3% ,11/32 )及≥ 12个月 (35 .1% ,13/37) (P <0 .0 0 1) ,各时间段M bcr/abl阳性患者的临床复发率分别为1 9% (1/5 3) ,0 (0 /32 )及 16 .2 % (6 /37) ;6例临床复发患者中有 5例复发时M bcr/abl与m bcr/abl同时阳性。 14例遗传学缓解患者移植 6个月后M bcr/abl阳性的 17份标本无 1例m bcr/abl阳性。结论 :多数CML患者移植后M bcr/abl仍为阳性 ,一般在 6个月内转阴 ,移植后M bcr/abl阳性的患者不一定复发 ,同时追踪观察M bcr/abl及m bcr/abl融合转录子可能会有助于监测残存白血病。

真核生物基因组转录诱导融合基因的研究进展

真核生物的基因组由基因和基因间区组成.基因转录时,从转录起始点开始到该基因的转录终止点结束,形成独立的转录单元.然而有少量的文献表明,转录有时会通读基因间区,产生包含上游基因、基因间区和下游基因的融合基因转录本.融合转录本经基因间剪接而成为有功能的成熟转录本.对真核生物转录诱导融合基因的基因间剪接方式、产生机制和意义进行了综述.

转录介导融合基因RBM6-RBM5在肿瘤细胞及组织中的表达

目的:鉴定RBM6-RBM5融合基因的存在,研究其与肿瘤发生的关系。方法:采用GLC20、MDA、MB、231、Jurkat、TF-1、MCF-7、Hela、BT-474、A431、K562及Raji10种肿瘤细胞株,肺、卵巢、骨骼肌、皮肤、脾脏、子宫、心脏、骨、脑、淋巴结、胰腺、前列腺及睾丸等肿瘤组织及其相应正常对照组织的cDNA,5例乳腺癌组织,以巢式PCR方法检测融合基因的存在,并通过QPCR方法研究融合基因的产生与RBM6、RBM5基因表达水平之间的关系。结果:RBM6-RBM5融合基因首次在MDA、MB、231细胞株中获得鉴定,序列分析发现该基因为RBM6和RBM5的融合体,该融合体不包括RBM6的外显子20、21以及RBM5的外显子1。该融合基因在10种肿瘤细胞株及部分肿瘤组织中表达,但在正常组织中却未见表达。融合基因的表达与RBM6和RBM5 mRNA的表达有关;RBM6和RBM5 mRNA的表达水平在融合基因阳性的肿瘤组织中明显高于融合基因阴性的肿瘤组织。结论:融合基因的表达与肿瘤发生有关,高水平的RBM6和RBM5 mRNA水平可能是融合基因产生的原因之一。

E2A-PBX1融合基因阳性的儿童急性淋巴细胞白血病携带变异型融合转录本

为了研究儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)中E2A-PBX1融合基因的表达,采用位于E2A基因不同位置的上游引物与下游PBX1引物,检测了410例儿童ALL,包括362例B细胞ALL和48例T细胞ALL。结果发现:17例患儿携带E2A-PBX1融合基因,检出率4.1%,且全部为B细胞ALL,而且所有阳性病例均表达一种变异型融合转录本,后者是由E2A基因的第13外显子(159bp)被差异剪切形成的。经BLASTn比对分析,这种转录本保持了原来的开放阅读框,但导致53个氨基酸残基的丢失。这53个氨基酸残基位于活化区2,会导致融合蛋白中部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。结论:携带E2A-PBX1融合基因的儿童ALL表达典型和变异型2种融合转录本,后者是由E2A基因第13外显子被差异剪切而形成的,它将导致融合蛋白中53个氨基酸残基及其所构成的部分环-螺旋结构以及全部七聚体亮氨酸重复序列的丢失。

bcr/abl融合转录子阳性的B细胞型急性淋巴细胞白血病免疫表型特点

为探讨B细胞型急性淋巴细胞白血病 (B ALL)中bcr/abl融合转录子阳性白血病细胞的生物学特征 ,用流式细胞术检测 2 6例bcr/abl阳性及 32例bcr/abl阴性B ALL病例的免疫表型 ,用PCR法检测免疫球蛋白重链(IgH)基因重排。结果表明 :所有的病例均为CD19阳性。bcr/abl阳性与bcr/abl阴性B ALL表面分子有显著统计学差异 (P <0 .0 5 )的是CD34(96 .2 %与 6 5 .6 % ) ,CD10 (96 .2 %与 71.8% )及CD38(43.8%与 95 .4 % )。在 2 6例bcr/abl阳性病例中 ,原始细胞共表达CD10 + /CD19+ /CD34+ ,CD10 + /CD34+ /HLA DR+ 和CD10 + /CD34+ /CD38-分别为 92 .3% (2 4 / 2 6 ) ,73 1% (19/ 2 6 )和 5 6 .2 % (9/ 16 )。对bcr/abl阳性组的 17例进行了IgH基因重排检测 ,10例阳性 (5 8.8% )。 14例bcr/abl阴性组中 12例 (85 .7% )阳性。在 32例bcr/abl阴性病例中 ,原始细胞共表达CD10 + /CD19+ /CD34+ 和CD10 + /CD34+ /HLA DR+ 分别为 4 3.8% (14 / 32 )和 37.5 % (12 / 32 ) ,无 1例表型为CD10 + /CD34+ /CD38-。结论 :bcr/abl阳性B ALL患者CD34和CD10阳性率较高 ,而CD38阳性率较低 ,且IgH基因重排检出率较低 ,其独特的免疫表型特征是CD10 + /CD34+ /CD38-。

应用RT/PCR技术检测急性粒细胞白血病M2型AML1/ETO融合基因转录本的研究

目的 :探讨检测AML1 ETO融合转录本在t( 8;2 1)急性粒细胞白血病M 2型 [M 2 /t( 8;2 1]的临床诊断和预后判断中的意义。方法 :用半筑巢式逆转录聚合酶链反应 (RT/PCR)技术检测AML1/ETO融合基因转录本 ,应用Southernblot技术及限制性内切酶技术检测PCR产物的特异性。结果 :在 19例AML M 2中共检出 10例存在AML1/ETO融合基因转录本 ,阳性率为 5 2 .6 % ,2例MDS中 1例为阳性 ,其余病例包括 3例M4均为阴性 ,第一轮PCR的检测水平为 1/ 10 3 10 4 个细胞 ,第二轮PCR的敏感性达 1/ 10 4 10 5个细胞 ,说明该技术的敏感性很高。结论 :半筑巢式RT/PCR技术是一种快速、简便、灵敏、可靠的检测AML1/ETO融合转录本的方法 ,对M2 /t( 8;2 1)

原发性t(10;11)易位白血病CALM和AF10融合转录检测及其体外化疗敏感性分析

为了研究CALM和AF10融合转录在原发性t( 10 ;11)易位白血病形成和治疗中的作用 ,采用RT PCR技术检测了 5例原发性t( 10 ;11)易位白血病患者CALM AF10融合转录 ,体外MTT法检测了其白血病细胞体外化疗敏感性。结果表明 :在 5例原发性t( 10 ;11)易位白血病患者中检测到 5种分子量的AF10 CALM融合转录和 4种分子量的CALM AF10融合转录 ;MTT法显示 5例原发性t( 10 ;11)易位白血病患者的白血病细胞有 2例对体外化疗敏感 ( 60 % ) ,3 6例非t( 10 ;11)易位白血病细胞有 3 1例对体外化疗敏感 ( 86% ) ,统计分析有显著差异 (P <0 0 1) ,与临床治疗结果一致。化疗药物处理 72小时 ,t( 10 ;11)白血病细胞的凋亡率为 ( 16.3 7± 2 .5 6) % ,而非t( 10 ;11)白血病细胞的为 ( 3 3 .75± 5 .5 9) % ,差异有显著性 (P <0 .0 1)。结论 :CALM AF10是t( 10 ;11)易位白血病的常见特点之一 ,可能与该白血病发生密切相关 ,且t( 10 ;11)易位白血病患者预后较差。

CALM/AF10反义核酸对原代CALM/AF10融合转录白血病细胞的体外作用分析

目的 :确定 CALM和 AF1 0融合转录在原发性 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病形成和治疗中的作用。方法 :检测 5例原发性 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病患者 CAL M- AF1 0融合转录 ,检测 CALM/AF1 0硫代反义核酸对其白血病细胞体外化疗敏感性和凋亡的作用。结果 :RT-PCR在 5例原发性 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病患者中检测到 5种分子量大小的 AF1 0 - CALM融合转录和 4种分子量大小的 CAL M- AF1 0融合转录。原代 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病细胞对体外化疗敏感性较非 t( 1 0 ;1 1 )转换的显著低 ,而 AS- PS- ODNs增加了其体外化疗敏感性和凋亡率。5μM AS- PS- ODNs处理时有 4例阳性 ,1 0μM和 2 0μM AS- PS- ODNs处理时 5例全阳性 ,而单纯化疗药组和化疗药 + 1 0μM正义硫代核酸 ( S- PS- ODNs)组分别只有 3例。化疗药+ 1 0μM AS- PS- ODNs处理 48h、72 h、96h后 ,细胞凋亡指数分别显著高于单纯化疗药组和化疗药 + 1 0μM S- PS- ODNs组。而单纯化疗药组和化疗药 + 1 0μM S- PS- ODNs组间凋亡指数在对应时间无差别。结论 :CALM- AF1 0与 t( 1 0 ;1 1 )转换白血病的发生密切相关 ,且 t( 1 0 ;1 1 )转换的白血病患者预后较差。

急性T细胞白血病细胞变异型sil-tal1融合转录本和基因组DNA断裂点

本研究探究1例儿童急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)的变异型sil-tal1融合转录本的序列。将PCR扩增产物克隆入质粒载体并测序,针对变异部分序列设计引物,对基因组DNA进行PCR扩增及序列比对。结果表明,在cDNA水平发现4种不同的融合转录本,分别保留了sil基因的部分外显子或内含子序列,并存在插入和删除现象。经分析白血病细胞的基因组DNA序列,发现了一种新的sil-tal1重组,其sil基因的断裂点在DNA水平上与文献报道不同。结论:此例患儿白血病细胞的tal1基因发生了新型重组,并表达经典型的和至少3种变异型的融合转录本,此现象可能是由于白血病细胞转录剪接机制异常所致。

HPV18融合转录本E1/CCAT1在宫颈癌筛查中的应用

目的探讨融合转录本E1/CCAT1在人乳头瘤病毒(HPV)18感染的宫颈组织和上皮细胞中的表达及临床意义。方法选取2016年2月至2020年3月浙江省中医院收治的HPV18感染宫颈癌前病变及宫颈癌患者共62例和宫颈癌筛查者105例作为研究对象。收集所有患者经手术或活检获取的宫颈组织和筛查者宫颈脱落上皮细胞标本,培养Hda细胞。以非HPV18感染或因良性疾病切除的宫颈组织作为对照,通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测HeLa细胞株及收集样本的融合转录本E1/CCAT1和C-MYC的表达。结果在HPV18阳性的部分宫颈组织标本和HeLa细胞株中均发现E1/CCAT1(E1_1489084/Chrom8_128,231,211)的表达。E1/CCAT1和C-MYC的相对表达量均随着宫颈分级程度加重而逐级升高,且E1/CCAT1在宫颈病变组织中的相对表达水平与C-MYC呈正相关(P<0.01,r=0.8862)。105例HPV18阳性的宫颈脱落上皮细胞中有10例检测出E1/CCAT1融合转录本,后续随访经阴道镜活检为低或高度上皮内瘤变患者。结论HPV18可能通过与宿主细胞转录融合形成E1/CCAT1转录本参与宫颈癌的病变过程,有望成为宫颈癌筛查的新标志物。

急性髓细胞白血病M2型AML1-ETO融合转录本的检测

目的：探讨检测AML1－ETO融合转录本在t（8；21）急性髓细胞白血病M2型M2／t（8；21）的临床诊断和预后判断中的意义。方法：用G显带技术对初治M2患者作染色体核型分析，用半筑巢式逆转录聚合酶链反应（RT／PCR）技术检测AML1－ETO融合基因转录本。结果：14例初治M2中共检出9例存在AMLI-ETO融合基因转录本，阳性率为64．3％。细胞遗传学技术证实9例均有t（8；21）易位；5例为阴性，均无t（8；21）易位；4例伴t（8;21）易位患者在处于完全缓解后5～72月，RT／PCR结果仍持续阳性。结论：应用筑巢式RT／PCR技术近似半定量检测AMLI－ETO融合转录本，对M2／t（8；21）的诊断和预后判断具有重要临床价值。

成人Xp11.2易位/转录因子E3基因融合相关性肾细胞癌患者临床特征单中心分析

目的探讨成人Xp11.2易位/转录因子E3基因融合相关性肾细胞癌(Xp11.2/TFE3 RCC)的临床表现、影像学表现与治疗效果。方法收集2014年9月至2019年7月海军军医大学(第二军医大学)长海医院收治的经病理确诊的43例成人Xp11.2/TFE3 RCC患者的临床资料,对患者一般情况、临床症状、影像学资料、手术方式、病理资料及预后进行回顾性分析。结果43例Xp11.2/TFE3 RCC患者中男24例、女19例,年龄25~77岁,平均年龄为(47.5±15.2)岁。首发症状为肉眼血尿5例,腰腹部不适6例,转移部位症状表现1例;健康体检时发现、无明显症状者31例。影像学上,病灶最大径1.1~9.5 cm,平均为(5.1±2.7)cm;病灶为类圆形29例,不规则形14例;边界清楚、有假包膜37例,边界不清晰6例;病变多出现密度或信号不均质改变,主要表现为出血(21例)、囊变或坏死(24例)及钙化(11例);中度至明显强化30例,轻度强化13例,其中乳头状强化23例;肾周侵犯10例,远处转移8例。43例患者中15例行腹腔镜根治性肾切除术,13例行腹腔镜肾部分切除术,7例行智能臂辅助腹腔镜肾部分切除术,5例行开放根治性肾切除术,1例行开放肾局部切除术,1例行肾穿刺活检术,1例行转移性椎管肿瘤清除术。43例患者的TFE3免疫组织化学染色检测及3例患者的TFE3荧光原位杂交检测结果均为阳性;免疫组织化学染色检测结果显示碳酸酐酶Ⅸ(CAⅨ;74.4%,32/43)、亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC;93.0%,40/43)、CD10(93.0%,40/43)、希佩尔林道蛋白(VHL;72.1%,31/43)、低分子量细胞角蛋白(CAM5.2;83.7%,36/43)阳性表达率较高,Ki-67阳性率为1%~60%(平均为9.7%)。除6例失访外,其余37例患者术后随访11~68个月,平均(47.4±17.5)个月。随访期间5例患者出现肿瘤全身多发转移,其中3例死亡,2例使用靶向药物治疗后病情无明显进展、患者仍存活;1例患者术后出现复发。结论Xp11.2/TFE3 RCC患者临床表现主要为血尿及腰腹部不适,健康体检时发现及无症状者较多,影像学表现多样,确诊依赖组织病理检测。外科手术尤其根治性肾切除术是Xp11.2/TFE3 RCC患者的首选治疗方法。大部分患者预后良好,少数患者术后出现复发或转移。

实时定量逆转录PCR在白血病标志物检测中的应用

目的 建立实时定量逆转录PCR（RQ-RT-PCR）检测各种急慢性白血病的特征性分子生物学标志物,评价其在疾病诊断和微小残留病（MRD）监测中的意义.方法 设计TaqMan探针和引物,建立RQ-RT-PCR法对各种融合基因转录本和ABL阳性模板进行扩增,并检测177份白血病标本的转录本含量,同时做细胞遗传学检查.结果 RQ-RT-PCR法最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板,但重复性较差,而（10^8～10^2）拷贝/μl的重复性良好,正常对照无扩增信号.与细胞遗传学相比,RQRT-PCR的敏感性和特异性更强,对白血病标志物的阳性检出率更高.对12例不同类型白血病患者的MRD随访监测表明：患者体内融合基因转录本的含量随病情进展逐渐升高,随病情好转逐渐下降,并且早于细胞遗传学预测疾病复发.结论 RQ-RT-PCR方法更敏感、可靠,与疾病的关系更密切,可用于白血病的诊断和MRD随访.

蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)全长转录组测序及分析

为了深入分析和探索豆科模式植物蒺藜苜蓿的mRNA完整结构,使用单分子长读数测序技术(single-molecule long-read sequencing technology,SMRT)对蒺藜苜蓿进行全长转录组测序及分析。共获得7 728 183个subread和509 014条全长非嵌合序列(full-length non-chimeric read,FLNC),通过比对分析发现,94.36%的序列与93.01%的序列分别与蒺藜苜蓿R108与A17参考基因组匹配。总计存在8 406种可变性剪接,其中主要的剪接方式为内含子保留(intron retention,RI)。共发现23 926个基因,其中12 049个基因存在295 545条转录本,在这些转录本中至少存在一个poly(A)位点。此外,共鉴定出3 223条转录因子,6 595条长非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和479条融合转录本。使用SMRT技术能够深入发掘蒺藜苜蓿转录数据,也为更好地利用蒺藜苜蓿基因组资源提供数据补充。

PolⅡ型启动子K14实现组织特异RNAi

RNAi(RNA interference,RNAi)是继基因打靶技术后的一种高效的研究基因功能的方法。细胞学实验和小鼠模型的研究结果表明,PolⅡ型启动子可以实现组织特异的RNA干扰,从而为鉴定基因在特定组织中的功能及作用机理提供了一个强有力的研究方法。为了能将这种方法用于转基因绵羊生产,探讨基因与绵羊毛囊发育的关系及其作用机制等,文章利用PolⅡ型CMV启动子和毛囊组织特异表达的人角蛋白14(K14)基因的启动子驱动eGFP-shRNA融合转录本的生成,从而实现敲低目的基因的表达。体外基因表达沉默效率分析(pEGFP-C1-shRNA和psiCHECK-BMP4双质粒共转染Hela细胞)结果表明,6个干扰序列均能有效地抑制BMP4基因的表达,抑制效率达到60%以上;体内表达沉默分析(只转染pEGFP-K14-shRNA质粒转染小鼠皮肤细胞系JB6-C41)的实验结果与体外分析结果相似,除3#序列外,其余干扰序列对BMP4基因的抑制效率都在60%以上,其中5#序列的效率达到80%以上。siRNA诱导的目标基因沉默中mRNA和蛋白水平的下降显著正相关。结果表明,设计构建的由PolⅡ型启动子K14驱动eGFP-shRNA融合转录本的形成,从而实现RNAi的研究方法是可行的,利用这种方法可以实现在特定细胞中敲低目的基因的表达水平。为在大家畜特别是绵羊中应用RNAi的方法分析目的基因在毛囊发育、对不同类型毛囊生长发育的诱导和调节等作用机理的研究提供一个参考方法。

集胞藻PCC6803染色体上relNEs(ssr1114/slr0664)TA系统的反馈调控作用

细菌染色体上的毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统通过转录水平和转录后水平调控毒素活性,从而控制细胞的生长速度和死亡,使细菌适应各种环境胁迫。为了证明集胞藻PCC 6803染色体上relNEs TA系统的转录调控,构建了以无启动子的β-半乳糖苷酶(lacZ)基因为报告基因的重组质粒,并测定含转录融合重组质粒的大肠杆菌细胞的β-半乳糖苷酶活性。结果表明,抗毒素RelN能显著抑制relNEs启动子的转录活性,而毒素RelEs能部分减弱这种抑制作用,提示relNEs系统的编码产物对该操纵子具有反馈调控作用。