ADI教学模式的教学实践研究——以“遗传信息的转录”教学为例

论证探究式教学模式(ADI)是将科学论证融入科学探究活动中的一种教学模式。本文通过利用相关科学实验将科学探究过程和课堂论证过程相结合,阐释如何将ADI教学模式引进生物学课堂教学,落实生物学学科的核心素养。

有机磷对胎鼠RET基因转录和致突变作用的研究

目的 探讨有机磷农药在先天性巨结肠症发病中的作用。方法 40只妊娠Wistar大鼠随机分为 4组。在大鼠妊娠期 8～ 1 4d ,Ⅰ组每日以生理盐水灌胃作为阴性对照 ;Ⅱ组每日以 5 0mg·kg-1敌百虫 (LD50 的 1 /1 0 )灌胃 ;Ⅲ组给予 1 0mg·kg-1敌百虫 (LD50 的 1 /5 0 ) ;Ⅳ组给予 2mg·kg-1敌百虫 (LD50 的1 /2 5 0 )。分娩前处死母鼠 ,取出胎鼠 ,每只母鼠取 4只体重相似的胎鼠 ,取其远段 1cm结肠组织 ,提取DNA和RNA。采用RT -PCR方法检测RET基因表达 ,采用PCR -SSCP对RET基因第 1 5外显子 (E1 5 )进行基因突变检测 ,阳性PCR产物进行直接测序。结果 RET基因在所有的标本中均稳定表达。在Ⅲ组 (1 0mg·kg-1敌百虫 )的 2只胎鼠 (由不同母鼠所产 )和Ⅱ组 (5 0mg·kg-1敌百虫 )的 1只胎鼠的DNA标本在PCR -SSCP分析时发现泳动变位 ,经测序证实均为V90 6密码子存在GTG→GTT的同义突变。

T7 RNA聚合酶的克隆及其介导基因转录功能的鉴定

目的构建含T7RNA聚合酶(T7RNA Polymerase,T7RNP)的真核表达载体,同时构建含T7启动子、增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)和T7RNP转录终止信号的载体,并通过观察EGFP的表达推测T7RNP表达和T7表达系统介导基因转录的功能。方法根据编码T7RNP的基因序列,应用PCR技术从含有T7RNP基因的E.coli BL21(DE3)基因组中扩增编码T7RNP的基因片段,克隆至载体pcDNA3·1(+)。同时从px8δt载体和pGEM-Teasy/EGFP上切下T7RNP识别的终止信号(terminator,TER)和编码EGFP的基因,克隆至载体pcD-NAII。将获得的两个重组质粒共转染BHK细胞。48h后,通过观察EGFP基因在真核细胞内的表达情况,推测T7RNP基因的表达及表达后识别T7启动子介导基因转录功能。结果成功构建了含T7RNP编码基因的真核表达载体pcDNA3·1(+)/T7RNP和原核表达载体pcDNAII/EG-FP/TER,共转染BHK细胞后,可观察到EGFP表达的绿色荧光。结论T7RNP能顺利在真核细胞内表达,并通过与T7启动子和TER的相互作用,成功实现了EGFP基因的转录和表达。

肝细胞内源性microRNA与HBV交互作用影响HBV转录的机制

microRNA(miRNA)可参与转录后基因表达的调控,在调控HBV转录、复制中发挥着关键性作用。总结了肝细胞内具有抗HBV作用的miRNA及4种调控机制,HBV通过HBx及自身编码miRNA等影响肝细胞内源性miRNA表达,促进复制的机制。分析表明,肝细胞内源性miRNA与HBV交互作用构成一个复杂的调控网络,相互竞争调控的结果,决定了HBV转录的活性及疾病发展的趋势。深入研究肝细胞内源性miRNA与HBV交互作用影响HBV转录的机制,对探索新的抗HBV方法具有重要的意义。

鼻咽癌中hMLH1基因启动子甲基化状态及转录表达的研究

目的探讨鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子区甲基化状态及其对转录表达的影响。方法运用甲基化特异性PCR和半定量反转录PCR法检测54例鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子甲基化状态及其转录表达水平,分析鼻咽癌组织中hMLH1甲基化与临床资料的关系,以及hMLH1甲基化对转录表达的影响。结果54例鼻咽癌组织hMLH1基因启动子甲基化频率为42.59%(23/54),鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子甲基化与临床资料无关。23例甲基化鼻咽癌组织hMLH1基因相对转录表达水平为0.9396±0.0375,31例非甲基化鼻咽癌组织hMLH1基因相对转录表达水平为0.9513±0.0551,两者间差异无统计学意义(P>0.05)。结论鼻咽癌组织中hMLH1基因启动子甲基化与临床资料及转录表达水平均无关,表明其转录表达可能不受甲基化调控。

HPVE7介导HDAC抑制宫颈癌细胞MHC-Ⅰ基因转录的研究

目的探讨表达高危型人乳头瘤病毒(HPV)E7基因抑制宫颈癌细胞主要组织相容性抗原I(MCH-I)转录的机制。方法利用荧光素酶检测实验和染色质免疫沉淀试验(ChIP)确定MHC-I启动子中E7的作用位点;ChIP检测MHC-I启动子的乙酰化状态和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的结合;特异性siRNA干扰E7后,ChIP检测MCH-I启动子的乙酰化和HDAC结合的改变,流式细胞仪检测细胞表面MHC-I表达。结果 E7特异性结合在MHC-I启动子中的-184～-500bp区域;MHC-I启动子低乙酰化且HDAC结合在启动子上;E7干扰后MHC-I启动子高乙酰化,HDAC与启动子结合降低,细胞表面MHC-I表达上调。结论 E7通过募集HDAC到MHC-I启动子上,使启动子组蛋白去乙酰化,从而导致MHC-I转录抑制。

舌鳞癌组织中cyclinA和cyclin D1的基因转录

目的 :探讨不同级别舌鳞癌组织中细胞周期相关蛋白cyclinA和cyclinD1基因转录情况。方法 :DIG标记及检测试剂盒进行组织原位杂交。结果 :舌鳞状细胞癌组织Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级中cyclinA基因转录阳性率分别为 47 6%、76 9%和 87 5 % ;cyclinD1基因转录阳性率分别为 62 0 %、 69 2 %和75 0 %。在有淋巴结转移的情况下 ,cyclinAmRNA和cyclinD1mRNA的表达较高。cy clinA和cyclinD1表达与舌鳞癌的恶性程度及淋巴结的转移均呈正相关 ,P <0 0 5。结论 :cyclinA和cyclinD1表达与舌鳞癌分化程度及淋巴结转移有关 。

人端粒酶逆转录酶基因转录调控研究进展

人端粒酶逆转录酶(hTERT)是端粒酶活性的限速因子,因此hTERT活性调控被认为是人端粒酶活性调节的一个主要机制。目前有关hTERT活性调控的研究主要集中在hTERT基因转录水平。研究表明已知的几种转录因子、细胞分化诱导剂、某些病毒相关蛋白以及DNA甲基化和乙酰化状态可能在转录水平对hTERT表达起调控作用。

apoAⅠ启动子-93 bp～-63 bp片段及-75 bp位点突变对基因转录调控作用的研究

目的:研究载脂蛋白AⅠ(apoAⅠ)启动子区域-93bp～-63bp对基因转录活性的影响,探讨-75bp位点G→A置换在基因转录中的作用。方法:在人类基因组数据库中截取并下载apoAⅠ基因启动子序列,对照基因图谱人工合成apoAⅠ启动子区域-93bp～-63bp片段,-75bp位点分别为突变型(A)或野生型(G),进行生物素标记。培养HepG2细胞,提取核蛋白混合物。将核蛋白与标记好的两条DNA链结合,进行电泳迁移率(EMSA)实验,观察两者结合情况。结果:apoAⅠ启动子-93bp～-63bp区域可与某种特异性核蛋白转录因子结合。-75bp位点为G等位基因的探针与含A的探针相比,核蛋白的结合明显增多。同时,竞争抑制实验表明,含G的探针与核蛋白的亲和力高于含A的探针。结论:apoAⅠ基因启动子-93bp～-63bp区域通过与核蛋白转录因子的结合参与基因调控,-75bp位点G→A置换降低与转录因子的亲和力,降低apoAI转录活性从而影响基因表达。

小鼠骨组织中转录调控因子CBF1的表达

目的:探讨转录调控因子CBF1(Cpromoterbindingfactor1,CBF1)在成鼠骨组织以及小鼠胚胎性骨组织的表达情况.方法:采用实时RTPCR方法检测包括骨组织在内的成年小鼠13种器官组织中CBF1的相对表达水平.采用组织原位杂交技术检测小鼠胚胎性趾骨、肋骨和椎骨中CBF1的分布.结果:转录调控因子CBF1在成年小鼠各组织器官中广泛存在,在骨组织中检测到较高的CBF1表达水平.原位杂交分析显示:发育中的趾骨和肋骨软骨细胞CBF1阳性染色,染色阳性程度与软骨细胞的分化程度有关;肋骨和椎骨骨化区周围成骨细胞呈强阳性染色;埋入骨基质的骨细胞则呈弱阳性染色.结论:转录调控因子CBF1参与了小鼠骨组织的发育形成,可能也参与了成熟骨组织的改建和代谢.

乙型肝炎病毒转录体血清学检测及其在母婴垂直传播中的意义

目的:探讨乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)转录体的检测在母婴传播中的意义.方法:自HBV表面抗原(HBsAg)阳性母亲及其新生儿血清中提取核酸,经PCR及RTPCR扩增HBVDNA,全长型RNA(FulllengthRNA,fRNA)和顿挫型RNA(TruncatedRNA,trRNA),琼脂糖凝胶电泳显示产物.结果:HBeAg(+)/HBeAg(-)母亲血样病毒DNA,fRNA和trRNA的阳性率分别为75%,65%,70%和37.5%,20.8%,58.3%,两组间前两项指标相差显著.44例新生儿血样HBsAg,病毒DNA和fRNA阳性率分别为9.1%,4.5%和6.8%,显著低于其母亲;儿血中trRNA阳性率达52.3%,与其母亲trRNA的存在有一定关联.15例乙肝五项检测仅显示HBsAb阳性的新生儿血样中均未见到病毒DNA和fRNA,但其中11例(73.3%)可检测到trRNA.结论:与HBsAg、病毒DNA及fRNA相比,trRNA可能是HBV母婴传播过程中早期出现的血清学指标,这一指标的应用可能有助于更精确的确定新生儿HBV感染的状态.

单细胞转录组测序在生殖发育领域应用进展

细胞是生物体结构和功能的基本单位,细胞命运的决策是单细胞层面的过程。基因组和表观遗传的重编程,以及在细胞分裂和分化过程中出现的误差造成来自同一细胞系或个体的细胞呈现出不同的基因组、转录组和表观基因组,即细胞异质性。单细胞测序允许对单个细胞进行高通量分子检测,不仅在解决生物异质性方面有着强大的功能,同时在低数量的生物材料问题上有许多优势。单细胞转录组测序(scRNAseq)在观察哺乳动物配子发育以及早期胚胎发育方面均有重要作用,对生殖领域的发展意义重大。现对scRNA-seq在方法学和技术应用的研究进展进行阐述。

雌激素对载脂蛋白AⅠ基因启动子不同区域转录活性的影响

目的:探讨雌激素对载脂蛋白(Apo)AⅠ基因启动子不同区域转录调节活性的影响。方法:利用含荧光素酶报告基因的表达载体pGL2构建携带ApoAⅠ基因启动子不同区域片段的重组质粒和同时携带ApoCⅢ/AⅣ基因片段的重组质粒。阳离子脂质体法将重组质粒与pRL-null内参质粒共转染HepG2细胞,加入10μmol/L雌激素刺激24h检测细胞荧光素酶报告基因的荧光强度,以反映ApoAⅠ的转录水平。结果:pGL2/-256AⅠ,pGL2/-2500AⅠ,pGL2/-256AⅠCⅢAⅣ及pGL2/-2500AⅠCⅢAⅣ转染后雌激素组荧光素酶相对活性明显高于对照组(P<0.05);而pGL2/-41AⅠ及pGL2/-41AⅠCⅢAⅣ质粒转染后雌激素组与对照组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:ApoAⅠ启动子-256^-41区域可能包含与雌激素作用相关的反应元件,受雌激素刺激后转录活性增强。

转录因子AP-2在肿瘤发生中的双向调节作用

激活蛋白-2是一类具有细胞特异性结合DNA的转录因子家族,能特异性调控靶基因的表达,迄今已发现α、β、γ、δ、ε五个亚型,在调节细胞增殖、分化和凋亡以及哺乳动物的胚胎发育中起到重要作用。近年来,其在肿瘤发生发展中的作用也日益受到关注。众多研究表明,激活蛋白-2的调节效应可能为双向,即抑癌或促癌,与组织特异性、时间先后以及各亚型之间差异性等相关。文中着重综述了AP-2在肿瘤发生中作用的最新进展以及临床应用前景。

先天性心脏病相关转录因子研究进展

先天性心脏病（congenital heaa disease，CHD）属于多基因遗传病，遗传因素在CHD发病中起重要作用．遗传度为55％-65％。心脏胚胎发育涉及不同时间、不同空间若干基因的先后表达以及这些基因间复杂而精确的相互作用。心脏发育过程中有大量转录因子参与．

黑龙江立克次体感染对小鼠脾脏免疫相关基因转录的影响

目的分析黑龙江立克次体感染小鼠脾脏免疫相关基因的转录变化,筛选影响黑龙江立克次体感染致病进程的关键靶标。方法取20只雌性C3H/HeN小鼠,随机分为未感染组(0 hpi)、感染3 h组(3 hpi)、感染3 d组(3 dpi)及感染6 d组(6 dpi),每组5只,采用尾静脉注射法感染黑龙江立克次体,在4个时相点解剖小鼠取脾,提取总RNA进行测序,筛选出特异性转录基因并进行GO注释、R语言富集及KEGG可视化功能分析。结果小鼠感染黑龙江立克次体后,脾脏有219930个mRNA发生了特异性转录,通过GO注释及富集筛选出显著性变化的3类基因:(1)35个天然免疫相关基因,其中参与γ干扰素(IFN-γ)信号通路的irg1、gbp10基因转录上调最明显(P<0.05);(2)31个获得性免疫相关基因,其中参与细胞凋亡通路的gzmb基因转录上调最明显(P<0.05);(3)41个炎症反应相关基因,其中参与细胞因子与细胞因子受体信号通路的ccl4基因转录上调最明显(P<0.05)。结论宿主IFN-γ信号通路中的irg1、gbp10基因,细胞凋亡通路中的gzmb基因,细胞因子及细胞因子受体信号通路中的ccl4基因影响黑龙江立克次体感染的致病进程。

枸杞子对人成纤维细胞寿命及c-fos基因表达的影响

目的:检测枸杞子提取液(fructuslyciiextract,FLE)对人二倍体成纤维细胞国内标准株(2BS)寿命及c-fos基因表达的影响。方法:实验分两组,25代龄2BS细胞用单纯DMEM培养基培养为对照组,实验组25代龄2BS细胞用0.025%FLE培养,计数实验组及对照组所培养的代龄。制备c-fos探针,并以Northern杂交的方法检测c-fos在0.025%FLE处理后的表达情况。结果:实验组的代龄(61.0±2.9)代明显大于对照组(49.0±2.5)代(t=3.31,P<0.05)。在衰老细胞中发现经0.025%FLE处理后能检测到c-fos的表达,而对照组未检测到。结论:枸杞子能有限的延长2BS细胞寿命,并对衰老2BS细胞c-fos基因转录有诱导作用,为延缓细胞衰老的基因学研究提供理论基础。

人绒毛膜促性腺激素对人PBMC产生MIF的影响

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(hCG)对人外周血单核细胞(PBMC)产生巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的影响。方法:分离正常人PBMC,体外加入不同浓度的hCG,在37℃5%CO2条件下培养一定时间收获细胞或加入一定浓度的hCG,同样条件下培养,在不同时间收获细胞,用荧光定量PCR方法检测MIF mRNA转录水平。结果:在实验的hCG浓度范围内,MIF的转录水平随着hCG浓度增加而明显提高。在100U/mL的hCG作用下,MIF mRNA表达在培养的1～2h达到峰值,随后很快下降,至8h基本回到刺激前水平。结论:hCG在一定浓度范围内有促进MIF mRNA转录的作用,且在本实验筛选浓度下,MIF mRNA转录水平与作用时间相关,提示hCG可通过促进PBMC分泌细胞因子参与一定的免疫调节作用。

超级增强子的发现与研究进展

超级增强子(super enhancers,SEs)是一种由连续排列的调控元件串联形成的超长增强子,可以强力驱动细胞相关基因的表达,细胞中的数百个SEs控制着关键基因,决定细胞命运走向。在肿瘤发生、老年痴呆、糖尿病及许多自身免疫疾病中,均发现致病基因的表达与部分超级增强子的异常活化高度相关。现概述SEs的发现历程与基本概念,阐明超级增强子的鉴定方法,并介绍目前SEs的相关数据库。随后对SEs在胚胎干细胞、多系统恶性肿瘤、免疫相关性疾病中的研究进展进行综述,并对其在妇科疾病临床治疗中的应用前景进行展望。

COL1A1-shRNA表达载体的构建及对胃癌细胞增殖迁移的影响

目的:构建COL1A1特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,体外评价其对胃癌细胞BGC-823增殖迁移的影响。方法:根据文献获得3个COL1A1的siRNA靶序列,设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencerTM4.1-CMV neo线性质粒载体连接,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选获得重组质粒;经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染胃癌BGC-823细胞,利用G418筛选稳定表达COL1A1-shRNA的BGC-823细胞株。通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测转染后细胞COL1A1在mRNA及蛋白质水平的表达;MTT法及Transwell法检测COL1A1干扰后胃癌细胞增殖及迁移能力的变化。结果:序列测定表明成功构建3个COL1A1-shRNA表达载体。实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示,COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞的COL1A1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);MTT试验及Transwell迁移试验显示,转染后细胞增殖及迁移能力明显降低(P<0.05)。结论:COL1A1-shRNA转染胃癌BGC-823细胞能有效抑制细胞COL1A1的表达及癌细胞的增殖迁移。