河南省溪蟹体内并殖吸虫内转录间隔区2与环氧化酶1基因序列分析

目的分析河南省溪蟹体内并殖吸虫囊蚴内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)和环氧化酶1(cyclooxygenase 1,COX1)基因序列,鉴定并殖吸虫虫种,并分析其与国内其他省份并殖吸虫间的遗传学关系。方法2016—2021年,从河南省郑州市、洛阳市、平顶山市、南阳市及济源市等5个市8个调查点采集溪蟹,检出溪蟹中并殖吸虫囊蚴,计算溪蟹囊蚴感染率;提取囊蚴DNA进行PCR扩增并测序。使用DNASTAR软件拼接测序结果、进行基因序列比对,同时与GenBank数据库中并殖吸虫基因序列进行BLAST比对。以肝片吸虫为外群,使用MEGA 6.0软件,采用邻接法构建基于ITS2、COX1基因序列的系统进化树。结果河南省郑州市、洛阳市、平顶山市、南阳市及济源市等5个市8个调查点溪蟹并殖吸虫囊蚴感染率分别为6.83%(11/161)、50.82%(31/61)、18.52%(5/26)、8.76%(12/137)、14.29%(9/63)、17.76%(19/105)、18.50%(32/173)和42.71%(41/96),平均阳性率为19.46%(160/822),平均感染度为0.57个/g。PCR扩增结果显示,并殖吸虫ITS2、COX1基因片段长度分别约为500、450 bp。河南省8个调查点溪蟹并殖吸虫囊蚴ITS2基因序列与斯氏并殖吸虫(GenBank登录号:MW960209.1)同源性最高,为99.8%~100.0%;基因进化树中与四川省(GenBank登录号:AY618747.1)、广西壮族自治区(GenBank登录号:AY618729.1)、湖北省斯氏并殖吸虫(GenBank登录号:AY618751.1)以及福建(GenBank登录号:AY618741.1)和日本宫崎并殖吸虫(GenBank登录号:AB713405.1)聚为1个大分支。COX1基因序列与斯氏并殖吸虫(GenBank登录号:AY618798.1)同源性最高,为90.0%~100.0%;在进化树中与所有斯氏并殖吸虫聚为1个大分支,且与湖北省斯氏并殖吸虫(GenBank登录号:AY618782.1、AY618764.1)聚为1个小支。结论河南省溪蟹体内并殖吸虫虫种均为斯氏并殖吸虫,且与湖北省斯氏并殖吸虫基因序列同源性最高。本研究结果可望为河南省以及全国并殖吸虫研究提供参考。

兔痒螨和水牛痒螨第二转录间隔区(ITS-2)基因序列分析

为了探讨水牛痒螨株和兔痒螨株的分类地位,采用PCR技术扩增了四川水牛痒螨株和四川兔痒螨株的第二内部转录间隔区(ITS-2)基因,并与GenBank中注册的5个国外痒螨株的同源基因进行了比较。序列分析发现:兔痒螨株和水牛痒螨株的序列长度分别为277bp和281bp,两序列间存在多处转换、颠换和缺失。四川水牛痒螨株同四川兔痒螨株间及国外痒螨分离株间的ITS-2基因同源性较低(87.1%～88.0%);而四川兔痒螨株与国外痒螨分离株的同源性较高(95.5%～100.0%)。用痒螨ITS-2基因构建的MP,NJ,ME及UPGM树中,兔痒螨株和水牛痒螨株在不同的系统树中其位置比较固定,且两者相距均较远。根据痒螨ITS-2基因同源性分析和系统树构建结果以及其他已报道的相关证据,作者认为:兔痒螨株和水牛痒螨株可能为痒螨属Psoroptes中两个不同的种,兔痒螨分离株为马痒螨P.equi;而水牛痒螨株与来自兔、山羊、绵羊和黄牛等痒螨株亲缘关系较远,可能为痒螨属中的另一个独立有效种。

我国4种白蛉的核糖体内转录间隔2区PCR-RFLP多态性分析

采用PCR-RFLP方法对我国内脏利什曼病传播媒介中华白蛉(Phlebotomus chinensis)、吴氏白蛉(Ph.wui)、长管白蛉(Ph.longiductus)和亚历山大白蛉(Ph.alexandri)等4种白蛉的核糖体内转录间隔2区(ITS2)进行分型。PCR-RFLP结果显示,以限制性内切酶DraⅠ酶切ITS2片段,可分出4种RFLP带型,即A为450 bp,B为154 bp/127 bp/93 bp/66 bp/10 bp,C为311 bp/80 bp/60 bp,D为353 bp/300 bp/160 bp/58 bp。结果显示,4种白蛉均只有1种RFLP带型,中华白蛉为AA型,亚历山大白蛉为BB型,吴氏白蛉为CC型,长管白蛉为DD型。利用PCR-RFLP方法可区分我国4种内脏利什曼病传播媒介的种类。

微小按蚊rDNA内转录间隔2区序列差异

目的 :比较不同地株微小按蚊核糖体DNA(rDNA)内转录间隔 2区 (ITS2 )序列差异。方法 :通过对PCR扩增rDNAITS2片段测序 ,比较其不同地株差异。结果 :对 6株微小按蚊测序比较 ,存在有微小按蚊A和C型。结论 :rDNAITS2序列差异可用于建立A。

我国尖音库蚊复合组蚊虫核糖体DNA第2内转录间隔区序列测定与分析

通过对我国尖音库蚊复合组蚊虫及三带喙库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区 (rDNA ITS2 )的序列测定 ,表明rDNA ITS2序列在我国尖音库蚊复合组种内亚种间和亚种内的变异存在有重叠现象。分子系统关系分析没有发现与形态学亚种阶元分类地位的一致性 ,但在种间差异明显。

不同地区微小按蚊rDNA-ITS2序列差异

目的 比较我国云南、海南省、广西壮族自治区及泰国等不同地区微小按蚊核糖体 DNA第 2内转录间隔区 (ITS2 )序列差异。 方法 取单只雌蚊蚊腿消化提取 DNA,PCR特异扩增 r DNA- ITS2片段 ,并对其扩增产物纯化、测序及分析。 结果 发现 2种不同的 ITS2序列 (Gen Bank登录号 :AF4 16 783,AF4 16 784 ) ,分别与微小按蚊 A和 C同源 ,ITS2序列长度及 GC含量分别为 4 81bp,5 4 .0 4 %和 4 83bp,5 4 .2 3% ,两者无显著性差异 ;但 2 2个固定位点存在碱基置换和插入 /缺失 ,序列差异为 5 .8%。 结论 研究区内微小按蚊存在 A和

深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2区克隆及SNP分析

目的克隆和序列分析深圳市白纹伊蚊核糖体DNA(rDNA)第2内转录间隔区(ITS2),并探明其rDNA ITS2核酸的特异性及不同个体在rDNA ITS2区的单核甘酸的多态性(Single Nuclear Polymorphism,SNP),以便利用ITS2基因的高度保守性及其蚊媒不种群在ITS2片段的多态性来分子鉴别白纹伊蚊。方法PCR特异扩增白纹伊蚊rDNA ITS2,利用QIAquick技术从琼脂糖胶上回收纯化扩增的目的ITS2 DNA片段,纯化后的目的ITS2 DNA片段被连接到TA载体上,在含有青霉素的琼脂糖胶平面上筛选含目的ITS2 DNA片段的阳性克隆,阳性克隆经含有青霉素的LB液体培养基培养,用Ultrapure^(TM)质粒提取试剂盒提取克隆质粒,用双酶切鉴定插入的片段大小,DNA序列分析仪分析每个蚊rDNA ITS2的序列,用生物信息系统进行白纹伊蚊rDNA ITS2 SNP的差异分析。结果518bp全长的深圳市白纹伊蚊rDNA ITS2被克隆和序列分析,深圳市四个不同地理的白纹伊蚊rDNA ITS2的同一性为97％,而两个地方之间的比较有99％的同一性,其rDNA ITS2基因单核苷酸存在转换、颠换和缺失,在518bp的范围内有6个C→T,2个A→G的转换,3A→T,一个A→C的颠换,3个CG和一个AC缺失。结论白纹伊蚊rDNA ITS2有高度的保守性,不同个体也表现了单核苷酸的多态性。

新疆6种蚊虫的rDNA-ITS2区序列分析

测定并分析了新疆 ４种伊蚊和 ２种按蚊的 ｒＤＮＡ—ＩＴＳ２区序列，新疆伊蚊、刺扰伊蚊ＩＴＳ２区长度分别为 ２３１ｂｐ～２５６ ｂｐ、２５０ｂｐ或 ２５３ｂｐ，其克隆间、种内序列差异分别为 ０．３％～４．３％、０．８％～１．４％；里梅伊蚊与长刀伊蚊的长度为３３０ ｂｐ、２５１ ｂｐ，种内序列无差异；４种伊蚊种间序列差异明显大于种内差异水平，为１２．３％～３３．５％；赫坎按蚊和米赛按蚊的 ＩＴＳ２区序列长度分别为 ４６３ｂｐ、３１１ｂｐ，种内个体间无差异，而种间的差异为 ３０．８％．结果显示 ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２区序列差异，为形态上易混淆蚊种提供了有意义的分子鉴别特征。

基于ITS2序列及二级结构的维吾尔族药材孜然及其混伪品鉴别

目的:应用DNA条形码技术,建立维吾尔族药材孜然及其混伪品小茴香、芫荽子的分子鉴别方法。方法:提取38批孜然及其混伪品的基因组总DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增内转录间隔区2 (ITS2)序列并双向测序,测序结果经CodonCode Aligner软件进行序列拼接,利用MEGA软件分析序列特征,计算种内、属间遗传距离,构建邻接(neighbor-joining,NJ)系统聚类树,预测其ITS2二级结构。结果:孜然药材ITS2序列中主体单倍型为A1,序列长度均为226 bp,鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)占比为47.79%~48.23%;小茴香ITS2序列中,主体单倍型为B1,序列长度均为224~227 bp,G+C占比为53.30%~55.36%;芫荽子ITS2序列中,主体单倍型为C1,序列长度均为220~227 bp,G+C占比为56.82%~56.83%。孜然的种内遗传距离明显小于属间遗传距离。二级结构表明,孜然及其混伪品螺旋区的茎环大小、数目、位置及螺旋角度均有明显差异。结论:ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别孜然及其混伪品药材,为保障孜然临床安全用药提供了有效技术手段。

基于ITS2序列的火绒草药材分子鉴定研究

目的 应用内转录间隔区2(ITS2)序列鉴定不同分布区、不同居群火绒草药材,明确火绒草种间、不同居群间和居群内火绒草样品遗传关系。方法 采用DNA提取试剂盒提取20个居群共220个火绒草药材基因组DNA。利用植物药DNA条形码通用引物ITS2序列对提取的DNA进行扩增并测序。将所得序列使用MEGA6.0软件进行序列对比分析,用NJ TREE法构建系统聚类树。结果 火绒草样本ITS2序列长度为222 bp, GC含量为52.25%。居群内火绒草样品ITS2序列一致,无变异位点。不同居群火绒草样品可利用72 bp处“T”碱基来区分河南产地样本。ITS2序列构建NJ系统聚类树分析显示,辽宁分布区及河北分布区火绒草聚类在一起,河南分布区火绒草与辽宁及河北分布区样本有一定的遗传距离。结论 ITS2序列可以准确、有效地鉴定不同分布区、不同居群火绒草药材,为火绒草种质资源多样性研究提供分子依据。

基于ITS2序列诊断临床深部真菌感染的初步研究

目的建立以ITS2为靶序列的PCR方法诊断临床深部真菌感染,并进行初步研究。方法用通用引物扩增纯菌落和临床标本的ITS2区域,对PCR产物测序,测序结果在GenBank中进行Blastn等分析,以此来鉴定真菌属种。结果 10种常见致病性真菌纯菌落和10例临床标本的DNA测序结果均与表型鉴定符合。结论以ITS2为靶序列的PCR可成为临床快速诊断深部真菌感染的重要方法之一。

长白山地区药用植物龙胆DNA条形码鉴定

目的:基于内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)碱基序列,运用DNA条形码鉴定技术对长白山地区药用植物龙胆进行鉴别研究,为龙胆药材的基原植物鉴定和药材的真伪鉴别提供参考。方法:采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)提取法提取龙胆叶片及药材的DNA,对其中特定ITS2碱基序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,检测后测序,并从GenBank下载同属植物序列,运用SeqMan软件对碱基序列拼接后,采用MEGA 7.0软件对数据进行分析处理及对比,计算Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离,建立邻接(NJ)法,进行对比分析。结果:根据NJ聚类树可知,不同种龙胆属植物笔龙胆、三花龙胆、高山龙胆、坚龙胆都自为一支,区分明显,龙胆和条叶龙胆聚在一支未能区分开,同时结合变异位点及K2P遗传距离发现,条叶龙胆和龙胆应用ITS2碱基序列区分时种间差异十分小。吉林省长白山10个不同地区的龙胆种内几乎无差异,经Blast比对确定碱基序列的确为所需要鉴定的品种。结论:运用ITS2碱基序列的DNA分子条形码鉴别方法对龙胆植物及药材进行鉴别有效可行且成功率较高,可以用于龙胆属种间及种内鉴别。

基于ITS2的和田玫瑰分子进化分析

目的:分析和田玫瑰分子系统发育进化式样并评价其道地性。方法:采用聚合酶链式反应获得和田玫瑰内转录间隔区2(ITS2)序列,在美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)比对,从GenBank获取邻近属ITS2序列共52条,利用MEGAX软件进行多重比对分析,构建邻接(NJ)系统发育树,推断进化时间,预测ITS2序列二级结构。结果:基于ITS2引物扩增获得长度为409 bp的序列,包括小亚基核糖体核糖核酸基因和内部转录间隔区的部分序列(1~39 bp)、5.8S核糖体核糖核酸基因全序列(40~64 bp)、ITS2标准全序列(65~268 bp)、大亚基核糖体核糖核酸基因的部分序列(269~409 bp)。分析发现和田玫瑰与英国、意大利等欧洲产玫瑰Rosa sherardii距离最近,共同亲本是大马士革玫瑰,和田玫瑰于20000多年前开始出现。结论:和田玫瑰ITS2标准序列为204 bp,起源于欧洲大马士革玫瑰,分歧进化时间约为29000年,与《中华人民共和国药典》2020年版收录玫瑰花的ITS2序列二级结构的区别主要在Ⅲ螺旋区部位。

白色念珠菌ITS2的实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及评价

目的建立一种快速鉴定白色念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法在白色念珠菌核糖体RNA编码基因(r DNA)中的内转录间隔区2(ITS2)上设计特异性引物和Taq Man-MGB探针,通过实时荧光定量PCR分析系统建立白色念珠菌的检测方法,对其敏感度、重复性和特异性进行方法学评价,并在模拟白色念珠菌血症的血标本中初步探讨其应用价值。结果所建方法对白色念珠菌纯菌液的准确检测下限为101CFU/ml,相应的批内、批间变异系数(CV)分别为1.57%和2.20%。对135株白色念珠菌临床分离株、其他非白念菌株、细菌临床分离株和血液标本进行检测,结果显示该方法特异性为100%。另外,对于模拟白色念珠菌血症的血标本,该方法的最低检测下限为102CFU/ml。结论所建方法具有特异性和敏感度高、重复性好的特性,可适用于临床上白色念珠菌引起的血流感染的快速鉴定。

基于ITS2条形码的市售延胡索鉴别

目的:利用DNA条形码技术对市售的经过蒸煮等加工的延胡索饮片进行分子鉴定,以评价内转录间隔区2(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列对延胡索饮片的鉴别能力。方法:采用改良后的试剂盒法提取样品DNA,用ITS2序列引物进行PCR扩增后测序,采用CodonCode Aligner软件对测序峰图进行拼接、校对,采用MEGA 7.0软件进行种内、种间变异比对及Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离分析,并基于邻接法构建系统聚类树。结果:约80%的样品的ITS2序列被成功扩增与测序,系统聚类树显示,所得延胡索ITS2序列和参考序列紧密聚合,具有良好的单系性,能够明显区分混伪品。结论:ITS2条形码可以准确鉴别延胡索不同加工品及其常见混伪品,为延胡索的鉴定提供分子生物学依据。

不同种源银柴胡及其伪品的ITS2序列分析与鉴别

目的:采用基于内转录间隔区2(ITS2)序列的分子鉴定法分别对17份不同种源银柴胡和6种伪品基原植物进行分析和鉴别。方法:对植物样品进行DNA提取、扩增、测序,并检索GenBank数据库,获取17份不同种源银柴胡及6种伪品的ITS2序列。采用ITS2数据库进行注释,去除5.8S和28S片段,获得完整的ITS2序列,利用MEGA 8.0软件进行序列比对、计算K2P遗传距离、构建邻接(NJ)系统发育树,采用美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库和“中药材DNA条形码鉴定系统”进行BLAST分析和物种鉴定,并利用ITS2数据库预测二级结构。结果:17份银柴胡样品共得到3个单倍型ITS2序列(YCH1、YCH2和YCH3),经与银柴胡标准ITS2序列比对,发现YCH1和YCH2与标准序列一致,但YCH3有4处碱基缺失,表现出0.936的遗传距离,在系统发育树中被单独聚为一个分支,并具有不同的二级结构;6种伪品的ITS2序列在长度、鸟嘌呤+胞嘧啶占比、变异位点、遗传距离、NJ系统发育树和二级结构上均与银柴胡ITS2序列表现出明显的差异。结论:基于ITS2序列的分子鉴定方法可以有效鉴别银柴胡真伪,不同种源银柴胡的遗传物质可能存在一定差异。

斑玉蕈菌株的IGS2序列和RAPD分析

采用转录单位间隔区2（IGS2）和随机扩增多态性DNA（RAPD）技术分析了斑玉蕈不同菌株的遗传差异。结果显示，20个不同斑玉蕈菌株的IGS2序列大小不一致，长度在1150—1203bp之间，序列相似度约在95％以上。在100个随机引物中筛选出11个能够扩增出稳定带型且菌株之间带型差异明显的RAPD引物，共扩增出142条条带，特异性条带134条，多态性比例较高，表明RAPD技术对斑玉蕈菌株的扩增具有丰富的多态性，能够在DNA水平上鉴别不同菌株是否存在差异。

广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

〔目的〕建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区(rDNA-ITS2)分子鉴定方法及其系统进化关系。〔方法〕针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性,设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物,对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定,并与GenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析。〔结果〕不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同,M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp～520bp、432bp～438bp、527bp～586bp、439bp～448bp和644bp。序列分析和系统进化关系显示,尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属,再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科,库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类,分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致。〔结论〕建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点,对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。

基于ITS2序列的竹叶花椒及其近缘种药材鉴别

目的:通过分析竹叶花椒及其近缘种药材的核糖体DNA内转录间隔区2(ITS2)条形码序列,探讨DNA条形码技术鉴别竹叶花椒及其近缘种药材的可行性。方法:对样品进行DNA提取、扩增、测序,并从GenBank数据库下载ITS2序列,共获得竹叶花椒及其近缘种药材ITS2序列43条,基于Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)法、临接法(NJ)、Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离和ITS2序列二级结构进行鉴定分析。结果:BLAST结果与性状鉴定结果一致;竹叶花椒种内平均K2P遗传距离小于其与花椒、青花椒、野花椒的种间平均K2P遗传距离;NJ系统聚类树和ITS2二级结构可直观地区分竹叶花椒及其近缘种。结论:应用ITS2条形码可以有效地鉴别竹叶花椒及其近缘种药材。

基于ITS2序列的翻白草与委陵菜分子鉴定

目的:应用DNA条形码技术对翻白草及易混品委陵菜进行分子鉴定,保障药材质量和临床用药安全。方法:提取翻白草及委陵菜的基因组DNA,扩增内转录间隔区2 (ITS2)序列并双向测序,所得序列用SeqMan软件校对、拼接;在线双序列比对翻白草对照药材(FR)及委陵菜对照药材(WR)的ITS2序列,并预测其二级结构;从GenBank下载部分相关序列,运用MEGA X软件进行多序列比对,分析序列变异位点,计算种内、种间遗传距离,采用邻接法(NJ)构建系统进化树。结果:所有样品均成功扩增出ITS2序列,翻白草和委陵菜的ITS2序列长度均为210 bp。双序列比对结果表明,F_(R)与W_(R)的ITS2序列相似性为92.9%,二级结构存在明显差异。多序列分析结果表明,翻白草ITS2序列平均鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)占比为63.0%,存在2个变异位点,种内遗传距离为0~0.009 6;委陵菜ITS2序列平均G+C占比为64.4%,存在5个变异位点,种内遗传距离为0~0.019 3;种间遗传距离为0.054 8~0.075 8。NJ树结果显示,翻白草、委陵菜聚为不同分支,可明显区分。结论:利用ITS2序列可以准确鉴别翻白草与委陵菜,为保障其安全用药提供了新的技术手段。