不同时期转染基因对牵引区新骨生成的影响

背景:前期研究表明,电穿孔介导的重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165能促进牵引区早期新生血管的形成和新骨形成。目的:观察不同时机转染基因对兔下颌骨牵张成骨过程中牵引区新骨生成的影响,探索基因导入的最佳转染时间,以获得更好的治疗效果。方法:新西兰大白兔48只,全麻下行双侧下颌骨截骨及牵引器植入后,采用随机区组法分成4组,分别于造模后即刻、牵引开始时、牵引结束时在双侧牵引区注射2μg(0.1 g/L)重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165,3组均予电穿孔刺激;单纯牵引组单纯牵引不行基因转染。各组于造模后3 d开始以0.8 mm/d、1次/d的速率进行牵引,连续牵引10 d;各组分别于固定期1,2,4,8周处死3只兔子,切取下颌牵引区新生组织行组织学检测和形态计量学分析。结果与结论:组织学检查和形态计量学分析发现,牵引期转染组与即刻转染组、固定期转染组、单纯牵引组比较间隙内有更多的新生血管、成骨细胞和间充质细胞等成分,各时点新生骨量与新生骨小梁宽度明显高于后者(P<0.05)。表明在牵引开始时(牵引期)进行基因转染较其他时间转染促进新骨生成作用明显,能够获得最佳的促进新骨生成的效果,提示牵引期是下颌骨基因治疗的最佳时机。

水动力转染基因在小鼠体内的长期高效表达

水动力转染技术是近年新出现的一种体内基因转染方法,可以实现目的基因在小鼠体内的高效表达,有可能作为受精卵显微注射的一种简单替代技术。但该技术的缺点是转染基因多瞬时表达,外源基因在体内高效表达的时间通常不超过1周,而且局限于肝、肾等器官,从而限制了该技术广泛应用。为了延长水动力转染基因在小鼠体内长期高效表达的时间,从而能对目的基因的体内功能进行长期研究,国外研究者进行了广泛的探索,本文综述了相关研究的最新进展。

体内转染基因在帕金森病治疗中的应用前景

近年来,帕金森病(Parkinson's Disease,PD)的基因治疗动物实验已经取得可喜成果,尽管尚无被认可的临床资料,但灵长类动物的实验成果已开始逼近临床应用。尤其是基因治疗所获得的神经支持和神经再生效果,具有不可低估的应用前景。PD的基因治疗主要通过两种途径实现:一是体外转染细胞的脑内移植(exvi-vo)。另一种是通过脑内注射在体转染靶细胞(invivo);两种途径的转染过程不同,而分子生物学基础基本一致。本文就体内转染途径和方法作一简要综述。

NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究

目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT3)基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象,按随机数字表法分为5组,每组12只(实验过程中部分动物死亡,实际实验数据按每组10只统计)。Ⅰ组未受噪声影响,Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激,Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激,Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激,V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声,强度100 dB,8 h/d,连续10 d,休息5 d,再通过听性脑干反应(Auditory Brain-Stem Response,ABR)测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组,但低于Ⅲ、Ⅳ组,差异有统计学意义(P均<0.05)。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论NT3基因转染后阈值增幅减小,听功能受损有一定程度减轻,对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染在乳腺癌治疗中的研究进展

乳腺癌全球发病率逐年上升,严重威胁女性健康。近年来,随着生物技术的快速发展,基因治疗在乳腺癌中的研究日益增多。超声靶向微泡破坏作为一种潜在的基因或药物递送系统,既可作为载体,又可增加生物屏障的通透性,从而提高肿瘤的治疗效果,已广泛应用于乳腺癌基因治疗研究。考虑到常规基因载体的固有缺陷,研究者倾向将其与超声靶向微泡破坏技术联合应用以提高基因转染的安全性和有效性。本文对超声靶向微泡破坏技术及其与常规基因载体联合介导基因转染治疗乳腺癌的研究进展做一综述。

靶向超声微泡介导VEGF基因转染对薄型子宫ER的影响研究

目的:研究靶向超声微泡介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染对薄型子宫内膜容受性(ER)的影响。方法:选择40只性成熟但未交配的具有动情周期的雌性SD大鼠进行研究。将其随机分为四组,包括正常组10只,模型组10只,阴性对照组10只,治疗组10只。其中模型组、阴性对照组及治疗组大鼠均自宫角处注入95%无水乙醇贮留5 min制备薄型子宫模型,正常组自宫角处注入生理盐水,贮留5 min。模型组予以生理盐水注射治疗,阴性对照组予以超声微泡+抗体(不含基因)治疗,治疗组则以靶向超声微泡介导VEGF基因转染治疗。比较四组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量,子宫内膜血流灌注,子宫内膜VEGF及白血病抑制因子(LIF)水平。结果:正常组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组(P<0.05)。正常组阻力指数(RI)、搏动指数(PI)、脐动脉收缩压与舒张压比值(S/D)均低于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组RI、PI、S/D均低于模型组、阴性对照组(P<0.05)。正常组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组(P<0.05)。结论:靶向超声微泡介导VEGF基因转染可有效修复子宫内膜,改善ER,值得临床重点关注。

CTLA4Ig基因转染猪皮敷料对患儿Ⅱ度烧伤炎症反应的影响

目的:观察人细胞毒T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4 immunoglobulin,CTLA4Ig)基因转染猪皮敷料在患儿Ⅱ度烧伤治疗中对炎症反应的影响。方法:抽取我院基因转染猪皮治疗急性烧伤的患儿40例作为观察组,银离子敷料治疗烧伤的患儿40例作为对照组。对比两组烧伤患儿的住院时长、发热天数,以及治疗前后的白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、C-反应蛋白(CRP)、血清降钙素原(PCT)4种炎症指标的表达水平。结果:基因转染猪皮观察组患儿住院时间为(15.23±5.58)d,短于对照组的(18.85±11.47)d。观察组患儿发热天数为(3.60±2.35)d,少于对照组(P<0.05)。观察组患儿治疗后的WBC、CRP、PCT水平均低于对照组,且降低幅度均高于对照组(P<0.05)。结论:CTLA4Ig基因转染猪皮敷料治疗小儿Ⅱ度烧伤创面具有缩短发热时间、降低炎症反应的优点。

聚酰胺-胺型树状聚合物介导基因转染的实验研究

目的探讨聚酰胺-胺型树状聚合物(PAMAM)作为基因载体,体外转染成纤维细胞的可行性。方法①将pEGFP与PAMAM按不同电荷比混合,通过原子力显微镜(AFM)对PAMAM和PAMAM-pEGFP复合物进行粒径、形态的表征;凝胶电泳实验和Zeta电位实验检验PAMAM与pEGFP质粒在不同电荷比时形成复合物的能力;通过DNA共沉淀试验检测不同电荷比下PAMAM对质粒pEGFP的包封率。②将不同电荷比的PAMAM-pEGFP复合物转染至小鼠胚胎成纤维细胞系,48 h后荧光显微镜下观察转染情况。③CCK-8实验检测转染后细胞的增殖活性。结果 PAMAM-pDNA复合物的粒径约10 nm。PAMAM在电荷比大于2时就能有效包裹质粒。随电荷比的增加,复合物的Zeta电位增加,在溶液中的稳定性和分散性也提高。包封率在电荷比为4:1时达95%。转染效率随电荷比的增加呈增高趋势,其中在4:1和6:1时转染效率达到最高。细胞毒性与电荷比有关,电荷比大于6:1时,PAMAM对细胞生长有毒性作用。结论 PAMAM纳米载体可安全有效地介导基因转染,是一种理想的基因递送系统。

超声介导微泡破裂增强体外基因转染的方法学研究

目的对超声促进基因转染的方法进行系统的优化研究,初步确定超声介导微泡破裂(UMMD)增强体外基因转染的最优参数。方法选用Ishikawa、Hela和MCF-73种细胞系为研究对象,用1MHz超声仪,超声强度为1.0W/cm2,系统研究不同参数下的细胞活力及两种DNA质粒[红色荧光蛋白质粒(DsRed)和荧光素酶质粒(pCMV-LUC)]的基因转染情况,优化UMMD的转染条件(质粒浓度、占空比及辐照时间),分析SonoVue微泡对基因转染的增强作用。结果基因转染率随着质粒浓度的增加而增高,当质粒浓度达到30μg/孔时转染率最高,两种DNA质粒的最佳转染浓度相同。与10%占空比的超声辐照相比,20%占空比的转染率显著提高(P<0.01)。辐照3min时基因表达率最高,但存活率无明显下降(89.03±2.01)%,为最佳辐照时间。无超声辐照时,单独应用质粒或微泡+质粒的样本几乎不表达红色荧光蛋白。与单纯超声辐照相比,超声辐照联合SonoVue微泡可显著提高基因转染效率(P<0.01)。结论UMMD的转染参数影响转染效率和细胞活力,优化的参数有利于促进基因转染。

BRD7基因转染对鼻咽癌细胞生长的抑制作用

目的：探讨鼻咽癌负相关基因ＢＲＤ７对鼻咽癌细胞系ＨＮＥＩ生长的影响。方法：构建ＢＲＤ７基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３.１（＋）／ＢＲＤ７重组体，采用脂质体介导转染技术，将ＢＲＤ７真核表达重组质粒和空载体质粒分别导入鼻咽癌细胞系ＨＮＥ１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和ＲＴ－ＰＣＲ分别检测外源性ＤＮＡ的整合和ＢＲＤ７基因的表达，并借助细胞生长曲线、软琼脂集落形成试验、流式细胞计数和裸鼠接种方法对转染细胞的生物学行为进行了检测。结果：转染ＢＲＤ７基因的 ＨＮＥ１生长倍增时间为５３ ｈ，较ＨＮＥ１（２３．９ｈ）和空载体转染 ＨＮＥ１（２４.１ｈ）明显延长，流式细胞仪表明，ＢＲＤ７表达升高延缓细胞由Ｇ０－Ｇ１期进人Ｓ期，ＢＲＤ７转染ＨＮＥ１在软琼脂中集落形成率较对照组显著下降（Ｐ＜０．０１），裸鼠接种试验显示ＢＲＤ７基因转染细胞ＨＮＥ１生长速度受到抑制。结论：ＢＲＤ７基因重表达有助于ＨＮＥ１的恶性表型的逆转；ＢＲＤ７是一个鼻咽癌相关的抑瘤基因良好的候选者。

硅纳米颗粒作为基因转染载体的研究

通过不同浓度的NaCl、NaI修饰硅纳米颗粒 ,用琼脂糖凝胶电泳分析硅纳米颗粒与DNA结合力及对DNA的保护作用 ,同时用绿色荧光蛋白基因作报告基因 ,以硅纳米颗粒作为基因转染的载体 ,转染HT10 80细胞。经电镜观察证实硅纳米颗粒进入细胞内 ;硅纳米颗粒与DNA结合后 ,能对DNA起保护作用 ;并且硅颗粒作为基因转染的载体 ,将绿色荧光蛋白基因导入HT10 80细胞 ,用荧光显微镜观察到发绿色荧光的细胞。结果表明 。

人环氧合酶-2(hCOX-2)编码基因的克隆及其反义核酸转染胃癌细胞的初步研究

目的环氧合酶-2与肿瘤发生的关系已成为肿瘤研究的新热点之一,本研究旨在获得 hCOX-2编码基因序列,构建其正、反义真核表达载体,并用反义重组载体转染 COX-2高表达的胃癌细胞,以进一步研究其生物学作用及其在肿瘤发生中的作用机制。方法按文献报道的hCOX-2核苷酸序列设计合成 PCR 引物,利用总 RNA 抽取试剂盒从 COX-2高表达的培养的人胃癌细胞系 SHC7901中提取细胞总 RNA,反转录合成 cDNA,再用PCR 方法扩增目的基因序列,PCR 产物经 DNA 序列测定证实后,利用引物5端引入的 EcoRⅠ,Xba Ⅰ酶切位点,通过粘端连接,将所获目的基因分别按正、反两个方向定向克隆入真核表达载体 pcDNA3.1中,对两种重组质粒分别进行相应的酶切鉴定,采用脂质体介导的方法用 COX-2反义核酸转染 SGC7901细胞,经 G418筛选后,随机挑选细胞克隆,通过 RT-PCR 检测COX-2 mRNA 水平的变化。结果应用 RT-PCR 反应扩增获得大小约1.9kb 的特异性片段,经 DNA 序列分析,证实与文献报道的 hCOX-2编码区序列一致,重组正义表达载体 pcDNA3.1/hCOX2(+)用 EcoRⅠ,Xba Ⅰ双酶切后,产生大小约5.4kb,1.9kb 的片段;重组反义表达载体 pcDNA3.1/hCOX2(-)通过 PstⅠ酶切,产生大小约4.5kb,1.5kb 与1.3kb 的片段,与预期结果相符,转染细胞经筛选后,随机挑选、扩增了3个细胞克隆,其中1个克隆稳定表达 COX-2反义核酸,RT-PCR 提示其 COX-2 mRNA 水平显著下降.结论成功克隆了 hCOX-2编码基因序列,并构建了其正、反义真核表达载体.反转录 PCR 是克隆基因的简便、有效方法.为扩增高 GC 含量的 cDNA 模板,可在 PCR 反应体系中加入适量的 DMSO,并采用较高退火温度.在 PCR 引物中加入限制性内切酶位点,可以方便地实现基因的定向克隆.COX-2反义核酸在胃癌细胞系 SGC7901中得到稳定转染,转染细胞 COX-2mRNA 表达显著受抑制.

超声波与微泡声学造影剂增强体外培养肿瘤细胞基因转染实验研究

目的观察超声波与微泡声学造影剂能否增强体外培养肿瘤细胞基因转染及其转染效率,初步摸索适宜的超声辐照条件。方法将培养的HepG2细胞分为3组,第1组为单纯造影剂转染组:加入5μg绿色荧光蛋白质粒(PEGFP-C1)与微泡声学造影剂混合液进行转染;第2组为脂质体转染组:用相同浓度PEGFP-C1质粒进行常规脂质体转染;第3组为造影剂加超声辐照转染组:加入5μgPEGFP-C1质粒与微泡声学造影剂混合液,然后分别用0.25W/cm2、0.5W/cm2、1.0W/cm2超声波经培养板底部辐照10s。24h后用荧光显微镜观察各转染组细胞荧光蛋白表达情况,计录每高倍视野(400×)荧光蛋白表达阳性细胞数。结果单纯造影剂转染组未见荧光蛋白表达阳性细胞,造影剂加超声辐照转染组可见不同程度荧光蛋白表达,其中以0.5W/cm2超声辐照组表达最强,每高倍视野绿色荧光蛋白表达阳性细胞数为(20.7±3.2)个/HP,高于0.25W/cm2与1.0W/cm2超声辐照组[分别为(4.8±1.9)个/HP;(9.9±2.3)个/HP],与脂质体转染组[(22.1±3.5)个/HP]比较无显著差异(P>0.05)。结论微泡声学造影剂加一定强度的超声辐照能显著增强体外培养肿瘤细胞的基因转染与表达,超声辐照条件是影响转染率的重要因素,适宜条件时其转染效率与常规脂质体转染方法无显著差异。

结肠癌细胞转染IL-21基因抑瘤效应的实验研究

目的:初步探讨转染IL-21的结肠癌细胞抑制肿瘤生长的效应。方法:以逆转录病毒为载体将IL-21基因导入结肠癌细胞,筛选建立高表达细胞株,测定其生物学性状指标和抑制肿瘤生长的效果。结果:与原株相比,所建立的Colon26/IL-21细胞株可高质量的表达IL-21,在体内可刺激分泌大量的IFNγ,致使结肠肿瘤明显回缩。结论:IL-21是一种高效的抗肿瘤细胞因子,有望成为结肠癌基因治疗的的候选基因。

IL－3基因转染的肿瘤细胞增强机体免疫功能的实验研究

建立了ＩＬ－３基因转染的Ｂ１６小鼠黑素瘤细胞株（Ｂ１６－ＩＬ－３），发现其体内的致瘤性和肺转移能力明显下降。对其免疫机理作一探讨。结果发现接种Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的小鼠脾细胞体外所诱生的ＬＡＫ活性和ＣＴＬ活性显著升高，外周血和脾细胞的ＣＤ４￣＋／ＣＤ８￣＋比值都有所升高；此外，在裸鼠体内，Ｂ１６－ＩＬ－３细胞的致瘤性也有一定程度的降低。结果表明ＩＬ－３基因转染的肿瘤细胞能诱导机体的特异性和非特异性免疫功能，参与机体的抗肿瘤作用。

重组腺病毒介导IFN-γ基因转染的巨噬细胞的体外免疫效应功能分析

巨噬细胞既是免疫效应细胞又是抗原提呈细胞，为研究ＩＦＮ－γ基因转染的巨噬细胞过继回输疗法，以重组腺病毒为载体将小鼠ＩＦＮ－γｃＤＮＡ转染入小鼠腹腔巨噬细胞，观察了对其体外免疫功能的影响，结果表明，ＩＦＮ－γ基因转染１８ｈ后巨噬细胞上清中存在高水平ＩＦＮ－γ，ＩＦＮ－γ基因转染的巨噬细胞杀伤活性显著增高，其分泌ＴＮＦ、ＩＬ－１、ＮＯ的水平均有不同程度的升高，表明重组腺病毒载体能将ＩＦＮ－γ基因成功地转染入巨噬细胞并增强巨噬细胞免疫效应功能。

应用基因转染方法调节HSP70在人胃癌细胞株SGC7901中的表达

目的 为探讨 ＨＳＰ７０ 在人胃癌中过度表达的意义， 调节ＨＳＰ７０ 在人胃癌细胞系ＳＧＣ７９０１ 中的表达．方法 应用脂质体介导的基因转染方法，将表达针对ＨＳＰ７０的反义ＲＮＡ 表达载体及ＨＳＰ７０ 表达载体转入ＳＧＣ７９０１ 细胞，通过ｈｙｇｒｏ ｍ ｙｃｉｎｅ 抗性筛选， 挑选阳性克隆；对阳性克隆从ＲＮＡ 水平（ 点杂交及ＲＮａｓｅ 保护试验） 及蛋白质水平（ Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ 及免疫组化） 进行研究．结果 ＨＳＰ７０ 在转染细胞中的表达得到了调节． 为进一步研究ＨＳＰ７０ 对胃癌形成与发展的作用创造了条件．结论 经过ＨＳＰ 反义或正义ＲＮＡ 转染的ＳＧＣ７９０１ 细胞具有不同的ＨＳＰ７０ 表达水平可用于胃癌发生机制的研究．

血管内皮生长因子基因转染促进骨折愈合的实验研究

目的 :(1)寻找外源性血管内皮生长因子 (VEGF)体内转染的有效途径 ;(2 )了解外源性VEGF基因表达对于骨折愈合的促进作用。方法 :建立大鼠股骨干骨折模型 ,将Lipofectamine、pBLAST49 mVEGF质粒混合物局部注射于骨折断端的骨膜下 ,在术后不同时间点观察大体标本 ,X线摄片和HE染色比较 ,观察外源性VEGF基因在体内表达对于骨折愈合的影响。结果 :大鼠股骨骨折术后 ,pBLAST49 mVEGF基因转染组骨折愈合及重新塑形时间较对照组缩短 2周。结论 :(1)局部注射阳离子脂质体Lipofectamine、质粒混合物是一种有效的体内转染途径 ;(2 )pBLAST49 VEGF基因转染能有效促进骨折的愈合。

NAG7基因转染对鼻咽癌细胞生长的影响

为了探讨鼻咽癌表达下调基因NAG7对鼻咽癌细胞系HNE1生长的影响 ,构建了NAG7基因的真核表达载体pcDNA3 1(+) /NAG7,并采用脂质体转染技术将真核重组体pcDNA3 1(+) /NAG7质粒和真核空载体pcDNA3 1(+)质粒分别导入HNE1细胞 ,经G4 18筛选后获得稳定转染细胞克隆 ,RT PCR和RNA印迹检测NAG7基因的表达 ,并通过细胞生长曲线、裸鼠接种和流式细胞等方法对转染细胞的生物学行为进行检测 .结果显示 :转染NAG7基因后 ,基因表达增加 ,细胞生长倍增时间较空载体转染和HNE1明显延长 ,流式细胞技术检测表明 ,NAG7可延缓细胞由G0～G1期进入S期 ;裸鼠接种实验显示转染NAG7基因后的HNE1细胞致瘤性受到抑制 .上述结果表明 :NAG7基因转染后鼻咽癌细胞生长受到抑制 。