体外建立dsRNA结合甲基化转移酶抑制剂转染猪肾细胞的模型

猪病毒性疾病对现代养猪业造成了巨大的经济损失。猪RNA病毒基因组在复制过程中形成双链RNA(ds RNA)的复制型中间体,并诱导I型干扰素的产生,从而对病毒的增殖起抑制作用,这是宿主抗RNA病毒感染的重要天然防线。猪许多病毒的ds RNA对上皮细胞有明显的趋化作用,而DNA甲基化转移酶抑制剂Aza-Cd R可诱导感染细胞凋亡并发挥抗病毒作用。本实验结合荧光定量PCR,计算干扰素相关基因(TLR3、IRF、IFNA)的相对表达量。同时,通过设计剂量和时间依赖实验,利用CCK8实验方法,计算细胞生存比率,最终确定ds RNA模拟物Poly I:C体外转染PK15细胞后,Aza-Cd R处理的理想细胞转染模型。此模型能有效地在体外模拟活病毒感染细胞的效果,更便于在常规实验室使用,是研究猪宿主与病毒感染关系的理想细胞模型。

利用高压水动力法建立乙型肝炎病毒转染小鼠模型及初步评价

目的利用高压水动力法建立C57BL／6小鼠乙型肝炎病毒（HBV）转染模型，并对其进行初步的观察及药物评价。方法将10μg腺病毒相关病毒载体（pAAV）-HBVl．2质粒采用高压水动力法尾静脉注入C57BL／6小鼠体内，连续5周观察小鼠血清中的HBsAg、HBVDNA等表达情况，并利用该模型初步评价拉米夫定的抗病毒效果。结果pAAV-HBVl．2质粒高压水动力法注射C57BL／6小鼠后，在小鼠体内分泌HBV的抗原及病毒颗粒。尾静脉注射2周内小鼠血清中HBsAg阳性率为100％，连续观察至第5周，22．2％小鼠血清中HBsAg有持续表达。小鼠血清中HBVDNA水平在1～4周时含量明显高于≥10^3拷贝／mL（临床患者阳性标准）。肝组织病理学观察（HE染色）可见不同程度肝细胞炎性改变，肝组织免疫组化可见到HBsAg和HBcAg表达。另外，使用抗病毒药物拉米夫定干预该小鼠模型，其血清中HBVDNA水平明显下降。结论初步建立的C57BL／6小鼠HBV转染模型，是一个适用于药物筛选及疫苗研究的有效模型，为抗病毒治疗研究奠定了一定基础。

乙型肝炎病毒L02细胞转染模型的建立与鉴定

我们以L02细胞为基础,利用基因重组技术构建含1.3倍加长乙型肝炎病毒(HBV)全基因组的表达质粒pcDNA-HBV,进行基因转染,获得了类似HepG2 2.2.15(简称2.2.15细胞)(HepG2转染HBV DNA后所得)具有复制和分泌HBV能力的HBV转染细胞模型.

微管相关蛋白tau转基因细胞和动物模型的建立及tau蛋白病变表征

目的构建并表征tau及突变tau蛋白细胞和动物模型,检测模型tau蛋白及磷酸化tau蛋白表达情况及微管的形态,为tau蛋白及相关疾病的研究提供疾病模型。方法将不同的质粒分别转染到HEK293细胞中,构建过表达野生型tau以及P301L/P301S突变tau的细胞模型。引进并繁育rTg4510小鼠(P301L突变tau转基因小鼠)以及PS19小鼠(P301S突变tau转基因小鼠)。通过Western blotting法检测总tau及磷酸化tau蛋白的表达,应用免疫组织化学的方法检测转基因小鼠脑内磷酸化tau蛋白的表达情况,应用免疫荧光的方法检测HEK293细胞微管形态的变化。结果本研究成功构建过表达tau蛋白的细胞模型,繁育了两种tau转基因小鼠,在这些模型中tau蛋白表达及tau蛋白的磷酸化水平显著高于对照组。在不同突变类型的细胞和动物模型中,tau蛋白不同位点的磷酸化水平变化以及微管形态变化略有差异。结论本研究成功构建了P301L/P301S突变tau蛋白的细胞和动物模型,这些模型均表现了显著的tau蛋白过度磷酸化的病变,并引起了细胞微管形态或tau蛋白病理的变化,进而为包括AD在内的tau蛋白病变提供了实验模型。

应用转染细胞研究ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线所致DNA损伤修复的关联

目的探讨ERCC2/XPD基因多态与短波紫外线(UVC)所致细胞DNA损伤与修复的关联。方法构建稳定表达ERCC2/XPD rs13181 AA(Lys751)和ERCC2/XPD rs13181 CC(Gln751)2种基因型的质粒,转染中国仓鼠卵巢细胞缺陷型UV5,获得稳定表达ERCC2转染细胞系。应用MTT法比较2种不同基因型转染细胞经不同照射强度UVC处理后细胞抑制率的差别;应用改良彗星试验检测各转染细胞经UVC处理后1、3、6、24 h DNA损伤修复能力的差异。结果与UV5ERCC2(AA)相比,突变型细胞UV5^(ERCC2(CC))对UVC所致DNA损伤更加敏感,细胞存活率降低(P<0.05)。改良彗星试验结果显示,UV5^(ERCC2(CC))细胞DNA损伤程度较UV5ERCC2(AA)严重,且修复UVC所致DNA损伤的能力降低,在20 J/m2UVC处理3、6 h时点的差异有统计学意义(P<0.05)。结论 ERCC2/XPD rs13181多态C等位基因与UVC所致DNA损伤修复能力下降相关,提示ERCC2/XPD rs13181基因多态性可能在UVC所致DNA损伤修复中具有一定意义。

ERCC1密码子118单核苷酸多态性转染细胞模型建立

目的建立切除修复交叉互补集团1(ERCC1)基因单核苷酸多态性(SNP)转染细胞模型,为体外研究基因多态性功能提供平台。方法 Gateway定向克隆技术构建ERCC1表达载体,包含不同ERCC1 codon 118 SNP表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)缺陷型UV20细胞,蛋白免疫印迹法(western blot)检测ERCC1蛋白表达,焦磷酸短序列测序PSQ检测ERCC1 118 SNP基因型。结果酶切鉴定及测序分析表明ERCC1表达载体构建正确,各转染细胞表达绿色荧光蛋白并可在G418培养基选择生长;ERCC1在UV20细胞中表达分子量为38 kDa蛋白,ERCC1 SNP基因型正确,2种转染细胞ERCC1的SNP基因型不同,分别为C/C或T/T。结论 ERCC1 codon 118 SNP细胞转染模型构建成功,为体外研究ERCC1 codon 118 SNP不同基因型提供了实验技术平台。