前白蛋白cDNA的克隆及稳定转染细胞株的建立

建立真核表达重组体 pCDNA3 1(+) -PA的稳定转染细胞株。以人胚肝组织总RNA为模板通过RT-PCR获取全长PAcDNA。先将该序列克隆到 pGEM -TEasy载体 ,再亚克隆转入pCDNA3 1(+) ,限制性内切酶消化及DNA序列分析鉴定重组体构建正确后 ,用脂质体转染技术把它导入Hela细胞 ,经G4 18筛选建立稳定转染细胞株 ,真核表达重组体 pCDNA3 1(+) -PA构建成功 ,稳定转染细胞株中有PAcDNA表达。

人LGR5基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的克隆人LGR5分子并构建其稳定表达的基因转染细胞株.方法提取人宫颈癌细胞株HeLa细胞总RNA,通过RT-PCR克隆获得人LGR5全长cDNA,将人LGR5全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体,收集培养上清感染L929细胞,筛选构建稳定表达人LGR5分子的基因转染细胞株.结果成功克隆人LGR5全长cDNA和构建pEGZ/LGR5逆转录病毒表达载体,成功获得稳定表达人LGR5的基因转染细胞株L/LGR5.结论成功克隆了人LGR5基因并构建了稳定表达LGR5分子的基因转染细胞株,为进一步研究LGR5分子的生物学功能奠定了基础.

人PD-L1基因转染细胞株的构建及其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响

目的:构建稳定表达人PD-L1分子的基因转染细胞株,观察其对活化的Jurkat细胞增殖和凋亡的影响。方法:将编码人PD-L1分子的全长c DNA重组入反转录病毒表达载体p EGZ-Term-R,将重组载体p EGZ-Term-R/PD-L1和辅助病毒载体用脂质体法共转染293T细胞,包装具有感染能力的完整病毒;收集含有完整重组反转录病毒的293T细胞培养上清,感染L929细胞,筛选并获得G418抗性的基因转染细胞。采用流式细胞术检测表达PDL1的基因转染细胞,命名为L929/PD-L1。采用PHA活化T细胞系来源的细胞株Jurkat,并将其与丝裂霉素预处理的L929/PD-L1细胞共培养,用细胞计数法观察L929/PD-L1细胞株对活化的Jurkat细胞增殖能力的影响,并检测其凋亡情况。结果:成功获得了稳定表达人PD-L1基因的转染细胞株L929/PD-L1。PHA可诱导Jurkat细胞活化并表达PD-1分子;L929/PD-L1与PHA刺激后的Jurkat细胞共培养,可抑制Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。结论:成功构建了稳定表达人PD-L1的细胞株,PD-L1分子抑制活化的Jurkat细胞增殖,促进其凋亡。

人CD13基因克隆及其基因转染细胞株的构建

目的克隆人CD13全长cDNA，构建稳定表达人CD13分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细胞总RNA，通过RT-PCR克隆人CD13基因，将人CD13基因重组入逆转录病毒表达载体pEGZ-Term。将重组逆转录病毒载体pEGZ-Term／CD13和辅助病毒载体用脂质体法共转染包装细胞293T，收集含有完整重组逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清感染L929细胞，筛选获得Zeocin抗性的基因转染细胞。结果成功克隆人CD13基因和构建逆转录病毒载体pEGZ。Term／CD13，并成功获得稳定表达人CD13的基因转染细胞株L929／CD13。结论成功克隆了人CD13基因及其逆转录表达载体，成功制备了稳定表达人CD13的基因转染细胞株，为研究CD13生物学功能奠定了基础。

人CD48基因转染细胞株的构建

目的克隆人CD48基因,构建稳定表达CD48分子的基因转染细胞株。方法提取人外周血单个核细胞总RNA,通过RT-PCR克隆获得人CD48基因,将人CD48基因重组入逆转录病毒载体pEGZ-term,通过293T细胞的包装获得具有感染力的完整重组病毒载体,进而感染L929细胞,构建稳定表达人CD48分子的基因转染细胞株。结果成功克隆人CD48基因和构建PGEZ/CD48逆转录病毒表达载体,进而成功获得稳定表达人CD48的基因转染细胞株L/CD48。结论成功克隆了人CD48基因及其逆转录表达载体,并构建了稳定表达CD48分子的基因转染细胞株,为探讨CD48生物学功能的研究奠定了物质基础。

雌二醇依赖性细胞稳定转染克隆株的研究

利用已经构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的表达载体和一个含有鸡溶菌酶基因超敏感位点4(hypersensitivity site 4)的载体pBS-HS4,采用Polybrene的方法进行稳定共转染T47D细胞得到稳定转染细胞株,结果得到了87株稳定转染细胞株。用10-9mol/L 17β-雌二醇诱导筛选,结果标号为EGFP-T47D 74的克隆细胞株在诱导后72 h及96 h表现出非常强的诱导荧光,而且诱导倍数较大,为3.63倍。结果表明,试验筛选出的稳定转染重组细胞株可供进一步建立细胞表达系统来筛选EEDCs。

锌带蛋白(ZNRD1)小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究

为探讨以锌带蛋白(ZNRD1)基因作为靶分子进行白血病多药耐药基因治疗的可行性,以Western blot检测ZNRD1在白血病细胞中的表达;构建ZNRD1基因的小干扰RNA载体并将其转导入HL-60/VCR细胞,G418筛选稳定转染细胞株;MTT法检测细胞转染前后生长速度和药物敏感性的变化;western blot检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和耐药相关蛋白P-gp,MRP的表达变化。结果表明,ZNRD1在HL-60/ VCR细胞中的表达明显高于HL-60细胞;转染后的细胞对长春新碱和阿霉素的敏感性增强,且低表达P-gp 和Bcl-2。结论:该小干扰RNA真核表达载体能在一定程度上逆转白血病细胞的耐药性。

DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用

基于细胞划痕实验研究了DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用。首先采用实时定量PCR检测人胃粘膜细胞GES、胃癌细胞MGC803、SGC7901和MKN74中DDX20基因的表达水平,确定DDX20基因高表达和低表达细胞株;进而针对DDX20基因设计、包被过表达并干扰慢病毒,基于实时定量PCR和Western Blot筛选稳定转染细胞株;基于稳定转染细胞株进行细胞划痕实验并采集图片。结果显示,与正常的胃粘膜细胞GES相比,DDX20基因在MGC803胃癌细胞中表达水平最高、MKN74胃癌细胞中表达水平次之、SGC7901胃癌细胞中表达水平最低。转染DDX20过表达慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著增加;转染DDX20干扰慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著降低,特别是转染干扰组2干扰慢病毒。过表达DDX20基因能显著促进胃癌细胞的迁移,抑制DDX20基因的表达可显著降低胃癌细胞的迁移。结果表明,DDX20基因是一个肿瘤转移相关基因,通过抑制该基因的表达能有效降低肿瘤细胞的迁移,为胃癌的临床治疗提供了一个潜在靶点,具有一定的临床应用价值。

DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用

目的:基于细胞划痕实验研究DDX20基因对胃癌细胞迁移能力的调控作用。方法:首先采用实时定量PCR检测人胃黏膜细胞GES,胃癌细胞MGC803、SGC7901和MKN74中DDX20基因的表达水平,确定DDX20基因高表达和低表达细胞株;进而针对DDX20基因设计并包装过表达及干扰慢病毒,基于实时定量PCR和Western印迹筛选稳定转染细胞株;基于稳定转染细胞株进行细胞划痕实验并采集图片。结果:与正常的胃黏膜细胞GES相比,DDX20基因在MGC803胃癌细胞中表达水平最高,在MKN74胃癌细胞中表达水平次之,在SGC7901胃癌细胞中表达水平最低。转染DDX20过表达慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著增加;转染DDX20干扰慢病毒,特别是sh-RNA-02干扰慢病毒后,DDX20基因及蛋白表达水平显著降低。过表达DDX20基因能显著促进胃癌细胞的迁移,抑制DDX20基因的表达可显著降低胃癌细胞的迁移。结论:DDX20基因是一个肿瘤转移相关基因,通过抑制该基因的表达能有效降低细胞的迁移,为胃癌的临床治疗提供了一个潜在靶点,具有一定的临床应用价值。

表达人CD36基因的293T细胞株的建立

目的 建立一种表达人类CD36基因的293T细胞株,用于CD36抗原的研究及CD36抗体检测.方法 采用RT-PCR技术,从人血小板中获取CD36基因的cDNA,克隆至表达载体pEGFP-C1中,对重组质粒测序鉴定后将质粒转染至293T细胞,该转基因的产物在293T细胞中的表达被观察超过1年.与CD36单克隆抗体及CD36阳性血清反应的流式细胞术试验评估这个细胞株的敏感性和特异性.结果 重组表达载体pEGFP-C1-CD36被成功构建,流式细胞术验证其转染效率达90％以上,实时荧光定量PCR和Western blot证明CD36基因在293T细胞中过表达.流式细胞试验结果为CD36单克隆抗体及CD36阳性血清为阳性,而其他所有的血清样本,包括CD36抗体阴性血清、含有HLA或HPA-3a抗体血清均为阴性.结论 建立的pEGFP-C1-CD36-293T细胞株能成功高效表达CD36抗原,并能特异快速、成功地检测CD36抗体,并且不受其他血型抗体的干扰,有一定的运用前景.

Effects of transfecting Bcl-2 shRNA and celecoxb on the SGC-7901 cell line

Objective:The aim of this study was to study the changes of SGC-7901 cells transfecting small hairpin RNA(shRNA) targeted Bcl-2 and celecoxib in vitro.Methods:To use the effective siRNA targeted to Bcl-2 by Lipofectamine 2000,the rate of cell growth inhibition of all groups was detected by multiply-table tournament(MTT) method,apoptosis rate was examined by flow cytometry and the expression of Bcl-2 was assayed by Elisa.Results:After siRNA was transfected to SGC-7901 cells,the rate of cell growth inhibition was increased,the joint group was higher by flow cytometry and the expression of Bcl-2 was lower by Elisa.Conclusion:The growth of SGC-7901 cells which was transfected siRNA has been inhibited,and the sensitivity to celecoxib has been increased.