转染血小板源生长因子和增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制移植血管狭窄的实验研究

目的 探讨联合应用血小板源生长因子(PDGF)和增殖细胞核抗原(PCNA)反义寡核苷酸(AODN)防止移植血管狭窄的作用。方法 将同一只兔的左、右髂外动脉(各1 0cm)对换移植,移植血管用PDGF- AODN和PCNA -AODN转染;移植血管病理切片后测量其内膜厚度、内膜面积和移植血管狭窄率,并分别用原位杂交组织化学和免疫组织化学染色计数PDGF和PCNA阳性细胞数。结果 PDGF- AODN加PCNA- AODN组的移植血管内膜厚度、内膜面积、管腔狭窄程度和PDGF阳性细胞及PCNA阳性细胞数均显著低于对照组(P<0 .01),而且亦明显低于单独转染PDGF- AODN组或PCNA -AODN组(P<0. 05 ),PDGF AODN组和PCNA AODN组间差异无显著意义(P>0. 05 )。结论 联合应用PDGF AODN和PCNA- AODN能有效抑制血管平滑肌细胞增殖,阻止内膜增生,防止移植血管狭窄。

人血小板源性生长因子-B基因转染犬牙龈成纤维细胞的瞬时表达检测

目的检测携带人血小板源性生长因子-B（hPDGF-B）基因的真核表达质粒在Beagle犬牙龈成纤维细胞内的表达。方法扩增和鉴定携带hPDGF-B基因的质粒EX-A0380-M03,脂质体介导的方法转染Bealge犬牙龈成纤维细胞,RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA以及Western blot检测hPDGF-BB的表达。结果 EX-A0380-M03所携带的目的基因为hPDGF-B基因,转染牙龈成纤维细胞24 h后可观察到细胞内的绿色荧光蛋白,48 h转染效率可达18%~38%。RT-PCR、免疫细胞化学、ELISA均能检测到细胞表达hPDGF-B。Western blot证实所表达的蛋白为融合蛋白。结论携带hPDGF-B基因的真核表达载体EX-A0380-M03能被转入牙龈成纤维细胞,并成功表达一种融合蛋白。

人血小板源性生长因子B基因转染对猫角膜内皮细胞增殖的影响

背景：许多研究显示外源性的人血小板源性生长B基因的转染可促进创伤的愈合。目的：用重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒转染和感染猫角膜内皮细胞，观察其对猫角膜内皮细胞增殖的影响。设计、时间及地点：分组对照观察细胞基因工程研究，于2007—01／11在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：健康足月幼猫，体质量250-300g，雌雄不限。重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒由青岛大学医学院附属医院中心实验室自行构建。方法：常规显微镜下撕取内皮培养法，培养出原代猫角膜内皮细胞，传2代的细胞用于实验。脂质体法将重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体转染到猫角膜内皮细胞中，重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒采用直接感染法。实验分正常对照组、质粒对照组、重组质粒组、腺相关病毒对照组和重组腺相关病毒组。转基因24h和48h后收集细胞，Trizol试剂提取其总RNA。主要观察指标：通过荧光定量聚合酶链反应检测目的基因在细胞中的表达。四甲基偶氮唑盐法检测转基因48h后细胞的增殖活性。结果：①撕取内皮法可方便获取到原代猫角膜内皮细胞。②自行设计的针对目的基因及内参基因的探针引物经扩增后电泳验证及序列测定证明特异性高。③转基因24h和48h后荧光定量聚合酶链反应检测人血小板源性生长因子B基因mRNA发现：正常对照组、真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组间差异无显著性意义（P〉0．05）；重组人血小板源性生长因子B基因真核表达质粒转染组和重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒实验组与正常对照组相比差异显著（P〈0．05）。④四甲基偶氮唑盐法检测显示重组质粒转染和重组病毒感染均可促进细胞增殖，真核表达质粒对照组和腺相关病毒对照组与正常对照组相比差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：重组人血小板源性生长因子B基因真核表达载体及重组人血小板源性生长因子B基因腺相关病毒可在角膜内皮细胞中高效表达并具有促进细胞增殖的活性。

血小板源性生长因子B基因转染抑制缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡

背景:血小板源性生长因子B(platelet-derived growth factor-B,PDGF-B)是一种有效的促血管生长因子,9型腺相关病毒(adeno-associated virus serotype,rAAV9)对心肌细胞具有良好的靶向亲和力,是目前缺血性心脏疾病基因治疗的理想载体。目的:探索rAAV9介导PDGF-B基因(rAAV9-PDGF-B)体外转染乳鼠心肌细胞,抵抗缺血缺氧诱导心肌细胞凋亡的作用。方法:分离培养原代乳鼠心肌细胞,分别将感染复数为1×105,1×106及1×107 MOI携带rAAV9-PDGF-B基因的重组9型腺相关病毒及空病毒(rAAV9-eGFP)转染乳鼠心肌细胞,逐日在荧光显微镜下观察eGFP的阳性表达,采用流式细胞仪测定rAAV9载体的转染效率,Western blot和免疫荧光鉴定PDGF-B蛋白表达情况;并于rAAV9-eGFP及rAAV9-PDGF-B(107感染复数)转染第5天时,建立体外心肌细胞缺血缺氧损伤模型,通过TUNEL法检测心肌细胞凋亡数目,Western Blot检测Bax及Caspase-3凋亡相关蛋白的表达,研究PDGF-B基因过表达抗心肌细胞凋亡的作用及可能机制。结果与结论:rAAV9载体可有效转染乳鼠心肌细胞,eGFP和PDGF-B蛋白可在心肌细胞中高效正确表达,其表达强度随着转染时间和转染复数的增加而逐渐增强,第5天趋于稳定,此时各组转染率相比差异均有显著性意义(P<0.01)。rAAV9-PDGF-B组心肌细胞凋亡率低于rAAV9-eGFP组(P<0.05),且rAAV9-PDGF-B组凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3的表达与rAAV9-eGFP组比均显著下调(P<0.05)。结果表明,PDGF-B基因过表达可有效减轻缺血缺氧诱导的心肌细胞凋亡,其机制通过抑制Bax和Caspase-3蛋白表达而发挥作用,为rAAV9-PDGF-B载体用于缺血性心脏疾病的基因治疗提供依据。

血小板衍化生长因子A基因转染成骨细胞生长特性的影响

背景:采用基因转染技术加强或改造种子细胞的功能是当今组织工程研究中的热点问题,用血小板衍化生长因子A转染成骨细胞用于牙周组织再生少见报道。目的:观察血小板衍化生长因子A基因转染成骨细胞后对其生长特性的影响。方法:构建血小板衍化生长因子A真核表达质粒,分离培养3T3细胞并进行不同方式的转染,RT-PCR检测血小板衍化生长因子A基因在成骨细胞中的表达;MTT法检测细胞的增殖活性;体外细胞划痕实验观察细胞的迁移情况。结果与结论:RT-PCR检测结果显示,血小板衍化生长因子A真核表达质粒转染的细胞表达量明显增加、生长、迁移速度明显增快(P<0.05)。说明脂质体介导血小板衍化生长因子A基因成功转染成骨细胞,并能促进细胞的增殖和迁移,为血小板衍化生长因子A基因在牙周组织中的治疗奠定基础。

血小板衍化生长因子-B基因转染对成纤维细胞生长增殖的影响

目的 研究血小板衍化生长因子 B(PDGF)基因转染成纤维细胞后对其生长增殖的影响。方法 构建PDGF B真核表达质粒 ,用脂质体LipofectAMINE介导转染成纤维细胞。相差显微镜观察成纤维细胞生长状况 ,MTT法测绘成纤维细胞生长曲线。结果 PDGF B基因转染的成纤维细胞生长良好 ,细胞生长曲线显示PDGF B基因转染 3d后的成纤维细胞较未转染的成纤维细胞生长明显增快 (P <0 0 5 )。结论 PDGF B基因转染后可显著加速成纤维细胞的生长增殖。

人源性肝细胞生长因子稳定转染细胞株的建立(英文)

目的通过实验获得人源性肝细胞生长因子(hHDSSF)稳定转染细胞株,为重组产品的获得奠定基础。方法通过脂质体包裹重组质粒pcDNA3。1hisB-HDSSF转染Hela细胞,以G418筛选转染细胞;进而通过RT-PCR和NorthernBlot鉴定G418筛选后的单克隆抗性细胞株。结果重组质粒pcDNA3.1hisB-HDSSF转染Hela细胞后,第20天可见G418单克隆抗性细胞株的形成。G418抗性Hela细胞株RT-PCR扩增出600bp左右的目的条带;NorthernBlot获得了明显的阳性杂交影。结论我们的实验证实HDSSF表达重组体被成功转入Hela细胞,并稳定表达;从而获得了HDSSF稳定表达细胞株,为进一步研究HDSSF表达、蛋白纯化和测定其生物学活性奠定了基础。

血小板衍生内皮细胞生长因子转染脂肪间充质干细胞促进移植脂肪血管化

背景:血小板衍生内皮细胞生长因子在脂肪移植中可促进血运重建。目的:探索血小板衍生内皮细胞生长因子和脂肪间充质干细胞的双重促进脂肪移植成活率的作用。方法:1从新西兰大白兔腹股沟皮下脂肪中获取脂肪间充质干细胞,将第3代脂肪间充质干细胞分为实验组、对照组和空白组。实验组以Lenti-PD-ECGF-EGFP转染脂肪间充质干细胞,对照组以Lenti-EGFP转染脂肪间充质干细胞,空白组脂肪间充质干细胞未转染任何病毒。2取已被Lenti-PD-ECGF转染的脂肪间充质干细胞与DMEM完全培养基混合,然后与脂肪组织混合,作为A组;同样的方法用未转染任何病毒液的脂肪间充质干细胞制备B组,单独应用DMEM完全培养基而没有任何细胞成分的为C组。3组移植物注射于大白兔背部左上(A组)、左下(B组)、右上(C组)部皮下组织中。结果与结论:1实验组脂肪间充质干细胞中血小板衍生内皮细胞生长因子mR NA与蛋白的表达水平高于对照组和空白组,且细胞增殖速度也比对照组和空白组快。2A组移植物质量及毛细血管数量大于B组和C组。提示血小板衍生内皮细胞生长因子基因转染脂肪间充质干细胞后不仅可以持续的表达该蛋白,同时也能促进脂肪间充质干细胞的增殖。

人血管内皮生长因子转染人脐带源间充质干细胞的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)转染到人脐带源间充质干细胞(hUC-MSCs)后VEGF表达量变化及其向神经细胞诱导能力的变化。方法用Lipofectamin法,将克隆入真核表达载体pEGFP-N3中的VEGF基因转染入hUC-MSCs,观察VEGF基因的表达对hUC-MSCs的影响。结果 VEGF基因克隆入真核表达载体,转染后经Real-time PCR和Western blot证实,在mRNA和蛋白质水平均有VEGF基因的表达,不影响hUC-MSCs的生长。结论 VEGF基因导入hUC-MSCs可以稳定表达,不影响hUC-MSC的功能。

人胰岛素样生长因子1基因转染脂肪源性干细胞的效应

背景:人胰岛素样生长因子1基因对脂肪源性干细胞的增殖和分化也可能会产生有效作用。目的:验证人胰岛素样生长因子1基因转染对体外培养的脂肪源性干细胞的效应。方法:构建含人胰岛素样生长因子1基因的双顺反子真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1,利用阳离子脂质体Lipofectamine2000介导转染体外培养的人脂肪源性干细胞。观察基因转染后细胞增殖及形态的变化,倒置荧光显微镜观测标记基因增强绿色荧光蛋白的表达并计算转染效率,酶联免疫吸附试验检测培养上清中人胰岛素样生长因子1的浓度,免疫组织化学染色及RT-PCR检测人胰岛素样生长因子1的表达,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化。结果与结论:测序及酶切证实真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-1构建正确。体外培养的脂肪源性干细胞为多种形态并存,转染后6h检测到有EGFP的表达,至60h达到高峰,转染效率为(16±3)%。细胞上清中人胰岛素样生长因子1的浓度在60h达到22.65μg/L。免疫组织化学染色及RT-PCR均检测到人胰岛素样生长因子1的表达。转染后的细胞分裂增殖加快,细胞群体倍增时间缩短,S期细胞比例增多。证实人胰岛素样生长因子1基因可有效转染脂肪源性干细胞并表达人胰岛素样生长因子1蛋白质,同时可促进细胞增殖。

血小板源性生长因子-α受体沉默对人晶状体上皮细胞增生的抑制作用

背景 血小板源性生长因子（PDGF）可以影响人晶状体上皮细胞（LECs）的增生过程,而LECs可终生表达PDGF-α受体（PDGFR-α）,PDGFR-α活化后与PDGF结合能促进细胞的DNA合成.反义寡核苷酸（ASODN）技术沉默PDGFR-α基因表达可抑制增生性玻璃体视网膜病变（PVR）过程中视网膜色素上皮（RPE）细胞的增生,并诱导细胞凋亡,但通过该技术是否能够抑制LECs的增生鲜见报道. 目的 研究PDGFR-α沉默对LECs增生的影响,为防治晶状体后囊膜混浊（PCO）提供实验依据.方法 用含胎牛血清的改良型α-MEM培养液体外培养人LECs系SRA01/04细胞株并传代,转染前1d用无抗生素的培养基培养细胞至30％ ～ 50％融合后将细胞以5×104个/孔的密度接种于6孔板,接种24 h后采用脂质体进行LECs转染,按照转染物的不同分为空白对照组（不加PDGFR-α ASODN的空白脂质体）、PDGFR-α错义寡核苷酸（MSODN）组（含PDGFR-α ASODN和脂质体）、0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组（含0.5 μmol/L PDGFR-αASODN和脂质体）和1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组（含1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN和脂质体）.转染24 h后倒置显微镜下观察各组人LECs的形态学变化,采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测各组LECs中PDGFR-αmRNA的表达；用MTT比色法检测各组细胞的增生（A490）值,计算转染物对LECs的抑制率；采用流式细胞仪分析各组LECs的细胞周期. 结果 转染后24 h,空白对照组及PDGFR-α MSODN组LECs生长良好,细胞呈多边形,数目多；而PDGFR-α ASODN组细胞呈圆形,细胞数目明显减少.RT-PCR检测表明,空白对照组及PDGFR-α MSODN组PDGFR-α mRNA在LECs中的表达较强,而在PDGFR-α ASODN组中的表达强度明显减弱,以1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组更为明显.空白对照组、PDGFR-α MSODN组、0.5μmol/L PDGFR-αASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值分别为0.661±0.036、0.655 ±40.016、0.529±0.030和0.441 ±0.039,其中0.5μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0μmol/L PDGFR-α ASODN组的A490值明显低于空白对照组和PDGFR-α MSODN组,总体比较差异有统计学意义（F=34.08,P＜0.01）.空白对照组、PDGFR-αMSODN组、0.5 μmol/L PDGFR-α ASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数分别为（47.73±1.18）％、（49.48±1.09）％、（53.31±1.30）％和（59.98±0.95）％,总体比较差异有统计学意义（F=68.41,P＜0.01）,其中0.5 μmoL/L PDGFR-αASODN组及1.0 μmol/L PDGFR-α ASODN组G1期细胞百分数明显高于空白对照组,差异均有统计学意义（P＜0.05）. 结论 PDGFR-α沉默能抑制人LECs的增生.

胰岛素样生长因子-1基因转染对人尿源干细胞生物活性的影响

目的分离、培养并鉴定尿源干细胞(USCs),评估慢病毒载体介导胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因感染USCs的安全性及有效性,探究IGF-1对USCs增殖、迁移能力的影响,为后续USCs-基因联合移植治疗勃起功能障碍(ED)动物模型提供可靠的体外实验证据。方法采用差速贴壁法分离培养原代USCs并鉴定。慢病毒载体介导IGF-1转染USCs,采用Western blot和PCR检测IGF-1表达情况,采用CCK-8实验、Transwell小室分析IGF-1对USCs的增殖及迁移能力影响。结果成功分离人USCs并传代培养。成骨、成脂分化后,茜素红S、油红O染色阳性;流式细胞技术检测结果显示,USCs表达间充质干细胞标志物CD44、CD73、CD90、CD146,不表达造血干细胞标志物CD31、CD45。重组USCs能稳定持续高表达IGF-1蛋白;重组USCs增殖、迁移能力显著高于对照组USCs(P<0.05),而转染慢病毒空载体USCs与对照组USCs比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论USCs取材简便且无创,分化和增殖能力强;慢病毒载体介导IGF-1转染USCs安全有效,IGF-1能够促进USCs增殖、迁移,为后续USCs-基因联合移植治疗ED奠定基础。

脑源性神经生长因子基因体外转染鼠雪旺细胞的生物活性

目的探讨应用重组腺病毒栽体携带脑源性神经生长因子（BDNF）基因转染雪旺细胞（SCs）的可行性及促进外周神经损伤恢复的有效途径。方法采取6～7天SD乳鼠坐骨神经，利用酶消化法、差速贴壁法分离获得雪旺细胞，阿糖胞苷与Geneticin联合应用纯化、BPE促进雪旺细胞增殖，获取大量高纯度的雪旺细胞。使用含BDNF基因的重纽腺病毒（Ad-BDNF），经不同感染复数（MOI）病毒量感染体外培养的大鼠源性SCs。逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测感染后72h的BDNFmRNA，ELISA定量分析感染后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d时感染后SCs培养液上清中BDNF的表达，

纳米羟基磷灰石复合基因转染生长因子修复牙槽骨缺损

背景:研究发现成骨细胞可促进牙槽骨的形成,而血小板衍生生长因子A因子转染成骨细胞对于牙槽骨形成的作用尚不清楚。目的:将基因转染的血小板衍生生长因子A重组质粒与纳米羟基磷灰石复合移植到骨缺损处,观察其对骨缺损修复的影响。方法:将 24 只新西兰大白兔随机分成实验组与对照组,制作双侧下颌下缘 10 mm×6 mm×4 mm 骨质缺损,实验组植入血小板衍生生长因子A转染成骨细胞与纳米羟基磷灰石的复合材料,对照组单纯植入纳米羟基磷灰石。术后 4,8,12周取材行大体标本、锥形束 CT、组织学观察及扫描电镜观察。结果与结论:术后不同时间点,实验组缺损处新骨生成,成骨细胞、骨小梁、骨陷窝及新生血管修复情况,以及材料与牙槽骨连接处的骨结合均明显优于对照组(P < 0.05)。表明血小板衍生生长因子A转染成骨细胞与纳米羟基磷灰石复合生成的新型材料,有较好的生物相容性,可加速骨组织再生,促进骨组织缺损修复。

大鼠血小板衍生生长因子C重组腺病毒载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

目的构建含大鼠血小板衍生生长因子C(PDGF-C)基因的pAD-EGFP-PDGF-C的重组腺病毒表达载体,体外转染骨髓源性内皮祖细胞(EPCs)并观察目的基因蛋白及mRNA表达情况。方法通过逆转录聚合酶链式反应技术(RT-PCR)法从pIRES2-EGFP-PDGF-C真核表达载体中获得PDGF-C目的片段,经BP重组与LR重组插入到pAD/CMV/V5-DEST,构建pAD-PDGF-C-IRES2-EGFP腺病毒载体。酶切及DNA测序鉴定后转染HEK293A包装、纯化,测定病毒滴度后转染大鼠骨髓源性EPCs,应用Real-time qPCR、蛋白免疫印迹法(Western blotting)等方法检测PDGF-C蛋白及mRNA的表达。结果核酸内切酶消化及PCR分析证实PDGF-C基因成功插入pAD/CMV/V5-DEST腺病毒载体,转染后荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达,转染48h后实时定量酵素聚合反应技术(Real-time qPCR)测定EPCs中PDGF-C含量明显提高(P<0.05),Wester blotting检测证实在46×103存在特异性条带。结论成功构建了大鼠PDGF-C基因的腺病毒表达载体pAD-EGFP-PDGF-C,体外转染大鼠骨髓源性EPCs能高效表达目的基因产物,为后续研究PDGF-C基因功能以及进一步开展基因治疗奠定了基础。

血小板衍生生长因子BB对牙周膜干细胞生物学特性的影响

目的:观察血小板衍生生长因子BB(platelet derived growth factor BB,PDGFBB)基因修饰人牙周膜干细胞(human periodontal stem cells,h PDLSCs)的生物学特性,探讨PDGFBB对hPDLSCs细胞增殖、迁移及诱导成骨的影响。方法:分离并扩增h PDLSCs,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志和成骨诱导分化能力。通过慢病毒载体介导PDGFBB基因转染hPDLSCs,转染后,采用CCK-8及划痕实验检测其对细胞增殖、迁移的影响。利用实时荧光定量PCR分析PDGFBB基因转染后hPDLSCs细胞内成骨相关基因和成血管相关基因VEGF mRNA的表达水平。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:采用组织块培养及有限稀释法成功获得hPDLSCs。PDGFBB转染hPDLSCs后,细胞形态良好,与空病毒组和未转染组相比,转染组细胞增殖及迁移能力显著上升,OPN、COL-1和VEGF mRNA表达水平显著上调(P<0.05)。结论:慢病毒载体能在体外将PDGFBB基因转入hPDLSCs,获得持续、稳定表达。PDGFBB可促进hPDLSCs细胞的增殖和迁移,上调成骨和成血管相关基因的表达。

人血管内皮生长因子基因修饰的肌源性干细胞的构建及表达

目的:构建携带人血管内皮生长因子基因(VEGF)的慢病毒载体,转染肌源性干细胞(MDSCs)并检测VEGF的表达。方法:体外培养兔肌源性干细胞,细胞免疫荧光检测MDSCs的CD34、CD45、Bcl-2和Desmin表达。构建p CDH-CMV-MCS-EF1-cop GFP-VEGF慢病毒载体,双酶切及测序鉴定。转染MDSCs,流式细胞仪(FCM)检测转染率。Real-time PCR,Western blot及ELISA检测VEGF在MDSCs的表达情况。结果:测序结果显示成功构建p CDH--VEGF慢病毒载体。FCM检测各组MDSCs的转染率,MOI值分别为1、5、15时转染率分别达到16.7%、45.6%、66.3%和85.6%。MOI值为20时,更达到90.1%。Real-time PCR,Western blot及ELISA均显示VEGF在MDSCs内稳定表达。结论:成功构建携带VEGF的慢病毒载体,转染MDSCs并稳定表达。

人胶质源性神经生长因子真核表达载体构建及在大鼠脊髓组织中的表达

目的探索人胶质源性神经生长因子(human glial derived neurotrophic factor,hGDNF)真核表达载体,体内直接转染SD大鼠脊髓组织治疗急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)的可能性。方法基因重组和限制性内切酶酶切构建真核表达载体pcDNA3-hGDNF,经脂质体DOTAP介导质粒转染SD大鼠脊髓组织,作为实验组;对照组大鼠直接注射空载体脂质体混合物。14d后取材,RT-PCR及Western blot检测hGDNF mRNA及蛋白表达。结果重组真核表达载体pcDNA3-hGDNF经限制性内切酶Hind III和Xba-酶切后,电泳显示400bp hGDNF目的片段和5400bp pcDNA3载体片段。转染大鼠脊髓组织后14d,RT-PCR检测出目的基因mRNA,Western blot检测出hGDNF的蛋白表达。结论构建的真核表达载体pcDNA3-hGDNF能在转染的大鼠脊髓组织中表达,可为基因治疗修复急性SCI奠定基础。

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定（英文）

背景:人胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF)和血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)在细胞分化过程中有重要作用。目的:构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-VEGF165并对其进行鉴定。方法:采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点(IRES)的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论:DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。

脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

目的:构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting法及MTT法检测其转录和表达活性;荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况;并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能。结果:成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165;RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性;绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能。结论:成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用;HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能。