骨形成蛋白-2基因转染NIH3T3细胞诱导成骨的实验研究

目的 探讨骨形成蛋白 - 2 (bonemorphogeneticprotein - 2 ,BMP - 2 )基因转染NIH3T3细胞体内诱导新骨的能力。方法 用脂质体转染法将BMP - 2基因转染至NIH3T3细胞 ,将转染细胞悬液注入裸鼠股四头肌内 ,第 6周取材 ,观察肌肉组织内诱导新骨生成情况。结果 基因转染实验组裸鼠肌肉组织中有类骨组织形成 ,部分区域伴有钙盐沉着 ,未见明显炎症反应。结论 骨形成蛋白 -

IGF-1基因转染促进胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中IGF-1、肌球蛋白、肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白-T的表达

目的观察胰岛素样生长因子-T(IGF-1)基因转染对胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化的心肌细胞中IGF-1、肌球蛋白(myoglobulin)、肌动蛋白(actin)及心肌特异性肌钙蛋白-T(Troponin-T)表达的影响。方法将含有IGF-1基因的真核质粒转染入大鼠胚胎干细胞诱导分化的心肌细胞中,采用免疫组织化学方法对心肌细胞内上述4种蛋白的表达进行检测。利用HPIAS-2000图像分析系统测定4种蛋白在各组中表达的平均吸光度值和平均阳性面积率。结果IGF-1基因转染后的心肌细胞内上述4种蛋白的表达明显高于未转染的对照组(P<0.05)。结论IGF-1基因转染的心肌细胞较未转染的心肌细胞合成IGF-1、肌球蛋白、肌动蛋白及心肌特异性肌钙蛋白-T的能力增强,为IGF-1基因治疗心肌梗死提供了实验依据。

腺病毒介导的骨形态发生蛋白-2基因转染脂肪间充质干细胞的实验研究

目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-(2Ad-hBMP-2)基因转染大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)的可行性及其成骨特性。方法取4周龄SD大鼠腹股沟的脂肪组织,经体外分离培养的方法获得ADSCs,分别转染以腺病毒为载体的绿色荧光蛋白(Ad-GFP)基因和Ad-hBMP-2基因。用荧光显微镜每隔12h观察转染Ad-GFP的细胞,并确定转染率,观察其形态变化,绘制生长曲线;利用免疫细胞化学法对转染Ad-hBMP-2的细胞作碱性磷酸酶(ALP)染色,用免疫细胞化学法作骨钙素(OC)检测确定成骨活性,Westernblot法检测hBMP-2的表达。结果12h后荧光显微镜观察转染Ad-GFP的细胞,有52%的阳性表达细胞,48h后转染率达95%;转染Ad-hBMP-2后倍增时间延长,ALP、OC检测为阳性表达,hBMP-2蛋白转染后48h为阳性表达,并持续至第5代。结论ADSCs可以作为腺病毒转染的载体,转染Ad-hBMP-2基因后有明显的成骨作用,可以作为骨组织工程的种子细胞。

Megsin基因转染对小鼠肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1及细胞间黏附分子-1表达的影响

目的:观察megsin基因转染对高糖环境中肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)及细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:高糖环境中培养小鼠肾小球系膜细胞,分别培养12、24、48 h,采用MTT法检测细胞增殖程度,免疫细胞化学和Western blot法检测系膜细胞megsin、MCP-1、ICAM-1蛋白表达水平,ELISA检测细胞培养上清Ⅳ型胶原浓度。结果:高糖环境中肾小球系膜细胞megsin、MCP-1及ICAM-1表达增强,细胞增殖明显,细胞上清液中Ⅳ型胶原浓度升高,megsin基因转染后上述变化趋势更加显著,而megsin shRNA质粒转染可明显减弱上述变化。结论:Megsin可上调MCP-1及ICAM-1表达,促进系膜细胞增殖及系膜外基质积聚。

重组骨形态发生蛋白-7基因转染软骨细胞的实验研究

目的 :研究外源性人重组骨形态发生蛋白 - 7(rhBMP - 7)基因在转染的软骨细胞中的表达情况。方法 :用脂质体介导法将rhBMP - 7转入兔关节软骨细胞 ,分别用免疫组化染色和逆转录 -聚合酶链式反应 (RT -PCR)检测其表达 ,同时用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法 (MTT法 )检测了表达产物的活性。结果 :48h后转染的软骨细胞有明显的 pcDNA3-rhBMP7基因表达 ,转染细胞的表达产物对正常软骨细胞的增殖有显著的促进作用。结论 :外源性rhBMP - 7基因可在软骨细胞中获得高效表达 。

缺氧诱导因子-1α基因转染对缺氧损伤HepG2细胞的保护作用

目的:观察缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因转染对HepG2细胞缺氧损伤的影响并初步探讨其作用机制。方法:腺病毒转染的人HepG2细胞常氧培养24h后分为4组:Ad-GFP转染常氧培养组(Ad-GFP transfected-normoxia组)、Ad-HIF转染常氧培养组(Ad-HIF transfected-normoxia组)、Ad-GFP转染低氧培养组(Ad-GFP transfected-hypoxia组)和Ad-HIF转染低氧培养组(Ad-HIF transfected-hypoxia组)。观察各组细胞的细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放率、细胞内活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)含量和诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)活力。结果:Ad-HIF转染的HepG2细胞可高效表达HIF-1α。Ad-GFP transfected-hypoxia组的细胞活力显著低于Ad-GFP transfected-normoxia组(P<0.05);Ad-HIF transfected-hypoxia组的细胞活力与Ad-HIF transfected-normoxia组比较无显著差异。Ad-GFP transfected-hypoxia组细胞内ROS含量显著高于Ad-GFP transfected-normoxia组(P<0.05);Ad-HIF transfected-hypoxia细胞内ROS含量与Ad-HIF transfected-normox-ia组或Ad-GFP transfected-hypoxia组比较均无显著差异。Ad-HIF transfected-normoxia组和Ad-GFP trans-fected-hypoxia组细胞内NO含量和iNOS活力均显著高于Ad-GFP transfected-normoxia组(P<0.05);Ad-HIFtransfected-hypoxia组细胞内NO含量和iNOS活力与Ad-GFP transfected-hypoxia组和Ad-HIF transfected-nor-moxia组比较无显著差异。结论:基础性HIF-1高表达可显著减轻缺氧时HepG2细胞的损伤程度,其机制可能与HIF-1高表达提高HIF-1调控的缺氧相关基因的基础表达水平和其产物含量有关;也可能与HIF-1高表达防止缺氧时ROS的过度增加有关。

腺病毒介导骨形态发生蛋白2基因转染诱导脂肪间充质干细胞向成骨细胞的定向分化

背景:在众多的骨生长因子中,骨形态发生蛋白2具有显著促进骨缺损修复和骨折愈合的效果。骨修复是一个阶段性过程,不需要转染的目的基因长久表达,因此利用腺病毒载体将目的基因导入脂肪间充质干细胞来促进骨愈合比较理想。目的:观察腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后大鼠脂肪间充质干细胞的分化情况。设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2008-01/10在北京大学第三医院中心实验室完成。材料:清洁级3周龄雄性Lewis大鼠24只,由北京大学实验动物学部提供。腺病毒载体Ad-BMP2、Ad-GFP由靳小兵博士构建扩增。方法:胶原酶消化法分离培养大鼠脂肪间充质干细胞,传至第3代分为Ad-BMP2转染组、Ad-GFP转染组和未转染组。各转染组分别向培养液中加入对应的腺病毒液,转染复数MOI=100。主要观察指标:转染后脂肪间充质干细胞碱性磷酸酶活性,vonKossa染色结果,Westernblotting法检测骨桥蛋白和骨形态发生蛋白2的表达。结果:与未转染组比较,转染后7,14,21dAd-GFP转染组细胞碱性磷酸酶活性无明显变化;Ad-BMP2转染组细胞碱性磷酸酶活性明显增高(P<0.01),且随时间延长碱性磷酸酶活性增加更为显著。Ad-BMP2转染组vonKossa染色出现黑色钙结节,免疫细胞化学染色结果示胞浆内有大量黄染颗粒,骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2均呈明显强阳性表达。Westernblotting检测结果显示Ad-BMP2转染组脂肪间充质干细胞骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2表达水平增高,Ad-GFP转染组中未检测到骨桥蛋白、骨形态发生蛋白2的表达。结论:大鼠脂肪间充质干细胞经腺病毒介导的骨形态发生蛋白2基因转染后,可定向分化为成骨细胞。

大鼠免疫功能恢复与白细胞介素-10基因转染的关系

目的:通过建立实验性自身免疫性甲状腺炎(experimentalautoimmunethyroiditis,EAT)动物模型的基础上,探索通过基因转染方法,以纠正EAT大鼠免疫功能异常状态。方法:选用雌性Wistar大鼠建立EAT动物模型。成模大鼠分为4组:A组5只(PBS+PLL),B组5只(pORF质粒+PLL)、C组10只(pORFmIL10质粒+PLL)及D组5只(pORFmIL10质粒+MEM)。使用放射免疫方法测定TgAb,TmAb滴度。采用Charreive法计算甲状腺内淋巴细胞浸润指数。脾脏淋巴细胞培养,采用犤3H犦-TdR标记方法测定cpm值并计算淋巴细胞增殖指数。结果:C组与A,B,D组比较,第4,6,8周TgAb,TmAb滴度显著降低(P均<0.001,F=42.66,32.65,9.66;F=22.25,81.35,14.84)。C组甲状腺淋巴细胞浸润指数为1.10±0.18,显著低于其他各组(F=4.39,P<0.01)。此外,淋巴细胞增殖试验结果显示,C组PTg刺激的淋巴细胞增殖指数显著低于A,B组(F=2.78,P<0.05)。结论:通过大鼠甲状腺组织内局部注射pORFmIL10质粒使甲状腺滤泡上皮细胞表达白细胞介素10基因,并且能够清除甲状腺内浸润的淋巴细胞,降低自身抗体水平和针对抗原反应的T淋巴细胞增殖反应。多聚赖氨酸可以延长目的基因表达时间,更有效地治疗EAT。

人白介素-10基因转染对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中NO、SOD、MDA、GSH-Px的影响

目的观察人白介素-10(IL-10)基因转染对局灶脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织中一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物(GSH-Px)的影响,探讨其缺血脑保护的作用机制。方法实验分正常对照组、缺血对照组、人IL-10基因转染组和空质粒组,采用Longa法建立大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,采用立体定向脑室内注射的方式进行转染,然后分别用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测其转染效果,氯化三苯四氮唑(TTC)染色测定脑梗死体积,Longa 5分制进行神经行为学评分,同时按照试剂盒说明分别检测脑组织中NO、SOD、MDA、GSH-Px的含量。结果(1)人IL-10基因能有效整合到大鼠脑组织中并能高效分泌人IL-10,同时人IL-10基因转染能减少脑梗死体积和降低神经行为学评分;(2)正常对照组、缺血对照组、空质粒组和人IL-10基因转染组SOD的含量分别为214.28±13.73、170.69±12.26、175.20±13.76和195.77±13.20U/mgprot。GSH-Px的含量分别为25.73±1.72、19.91±1.81、19.32±1.37和22.70±2.22U/mgprot。与正常对照组相比,缺血对照组、空质粒组和人IL-10基因转染组SOD和GSH-Px的含量明显下降(P(0.01)。人IL-10基因转染组SOD和GSH-Px的含量则较缺血对照组、空质粒组明显升高(P(0.01)。缺血对照组和空质粒组之间无显著差异(P>0.05)。(3)正常对照组、缺血对照组、空质粒组和人IL-10基因转染组MDA的含量分别为6.29±0.33、8.75±0.44、8.66±0.51和7.70±0.31nmol/mgprot。NO的含量分别为1.07±0.11、1.87±0.18、1.93±0.33和1.44±0.10μmol/gprot。与正常对照组相比,缺血对照组、空质粒组和人IL-10基因转染组MDA和NO的含量明显升高(P(0.01)。人IL-10基因转染组MDA和NO的含量则较缺血对照组、空质粒组显著下降(P(0.01)。缺血对照组和空质粒组之间无显著差异(P>0.05)。结论人IL-10基因转染能降低大鼠局灶脑缺血再灌注损伤脑组织中MDA和NO的含量,同时能提升SOD和GSH-Px的含量,可能是其发挥缺血脑保护作用的机制之一。

骨形态发生蛋白-2基因转染对舌癌细胞增殖活性的影响

目的探讨腺病毒介导的人骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因转染舌癌Tca8113细胞后,对Tca8113细胞形态和增殖活性的影响。方法分别以感染复数(MOI)为0、50、100的腺病毒为载体的BMP-2基因转染体外培养的舌癌Tca8113细胞。采用荧光倒置显微镜观察转染前后Tca8113细胞形态的变化,Western blot法检测Tca8113细胞BMP-2的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测Tca8113细胞增殖能力,并绘制生长曲线。结果 MOI为100时转染率最高,转染前后Tca8113细胞形态变化不大,Western blot检测到Tca8113细胞BMP-2的表达,转染后Tca8113细胞的增殖活性降低。结论腺病毒介导的人BMP-2在体外能够抑制舌癌Tca8113细胞的增殖活性。

骨形态发生蛋白-7基因转染骨髓基质细胞后的表达

为了观察重组人骨形态发生蛋白 - 7(rh BMP- 7)基因转染骨髓基质细胞 (BMSCs)后的表达及表达产物对 BM-SCs增殖的影响 ,用脂质体介导法将 rh BMP- 7基因转染 BMSCs,用逆转录 PCR技术和免疫组化 SABC法分别检测其瞬时表达和稳定表达 ;再用 3H- Td R掺入法检测基因表达产物对正常培养的 BMSCs增殖的影响。结果表明 :转基因细胞能高效表达外源基因 ,且表达时间长达 4周 ;基因表达产物能明显促进 BMSCs的增殖。

γ干扰素诱导蛋白-10的硫氧还基因融合表达、纯化及生物活性检测

γ干扰素诱导蛋白-10是由γ干扰素刺激单核细胞、内皮细胞等所诱导产生趋化T淋巴细胞的一类分泌性糖蛋白。本研究PCR扩增人与鼠γ干扰素诱导蛋白-10的成熟蛋白编码区,克隆到硫氧还载体pET-32(a)进行诱导表达。SDS-PAGE分析显示:在IPTG诱导下,人与鼠的γ干扰素诱导蛋白-10表达量约占目标总蛋白的25.3%,主要以包含体的形式存在,可溶性成分约占目标总蛋白的20%。将可溶性蛋白以S-Tag亲和层析柱进行纯化,纯化的蛋白质纯度约为90%的γ干扰素诱导蛋白-10。通过趋化性分析,证实重组表达的人与鼠γ干扰素诱导蛋白-10在100ng/ml浓度下对激活的T淋巴细胞具有趋化活性。

缺氧诱导因子-1α基因转染人间充质干细胞

目的 将HIF 1α基因转染人间充质干细胞(hMSCs) ,并检测该基因在hMSCs中的表达。方法 构建含人缺氧诱导因子 1α(HIF 1α)的重组逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒,感染hMSCs。采用RT PCR法检测HIF 1α基因的表达。结果 转基因hMSCs的HIF 1α表达水平较正常hMSCs明显增高。结论 HIF 1α基因成功转入hMSCs并被强制表达,为研究骨组织工程的血管化奠定了基础。

肿瘤靶向DNA载体——转铁蛋白-多聚乙烯亚胺体外介导小鼠IL-12基因转染小鼠骨肉瘤细胞的实验研究

目的 评价转铁蛋白 -多聚乙烯亚胺 (Transferrin -polyethylenimine ,Tf-PEI)靶向性转染小鼠骨肉瘤细胞的可行性。以Tf-PEI为载体 ,将小鼠IL -1 2基因导入小鼠骨肉瘤细胞。方法 以Tf-PEI为载体 ,将荧光素酶基因和小鼠IL -1 2基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞 ,并检测其转染效率。以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI,并观察其对转染效率的影响。结果 Tf-PEI可以高效的、靶向性的转染小鼠骨肉瘤细胞。当N/P比值为 5时 ,Tf-PEI的转染效率最高。游离转铁蛋白能够显著的拮抗Tf-PEI的转染。Tf-PEI还可以成功地将小鼠IL -1 2基因导入小鼠骨肉瘤细胞。结论 Tf-PEI是一种高效、低毒、肿瘤靶向性的基因转染载体 ,它能成功地将mIL -1 2基因导入骨肉瘤细胞 ,广泛应用于体内外恶性肿瘤基因治疗的实验。

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的观察转染人骨形成蛋白-7(Bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)与胶原膜(BME-10X)复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组(P<0.05)。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞。

转染骨形态发生蛋白-2基因的血管内皮祖细胞的构建

目的通过克隆、构建pEGFP-BMP-2表达质粒载体,观察骨形态发生蛋白-2(BMP-2)基因在血管内皮祖细胞(EPCs)中的表达与分布。方法采用密度梯度法分离兔骨髓的单个核细胞,应用细胞荧光化学法及DAPI染细胞核法鉴定培养的细胞;BMP-2重组于pEGFP-C3中,经酶切、测序分析鉴定后,将其转染入EPCs内并筛选稳定转染细胞。结果鉴定培养的细胞为EPCs;pEGFP-C3-BMP-2表达质粒载体经双酶切鉴定、测序分析证实其构建成功;成功转染的EPCs中绿色荧光弥散分布于细胞胞质内,表明pEGFP-C3-BMP-2蛋白高表达,表达率为46%。结论分离与培养出EPCs;构建的pEGFP-C3-BMP-2表达质粒载体转染后,BMP-2蛋白高效表达于EPCs胞质中。

重组鼠骨形态发生蛋白-7基因转染心肌细胞及其表达

为探讨重组鼠骨形态发生蛋白-7(rrBMP-7)真核表达载体在心肌细胞获得稳定高效表达的可行性,采用PCR技术扩增BMP-7基因,将其插入真核表达载体pCDNA3·1(+)中;利用差速法分离培养心肌细胞,将构建的BMP-7表达质粒转染心肌细胞,检测其表达效率。结果表明,经过PCR及酶切鉴定证明获得了真核表达质粒pCDNA3·1-rrBMP7;通过逆转录PCR和免疫细胞化学鉴定证明BMP-7在转染后的心肌细胞中得到了稳定高效表达。结论:应用本文介绍的方法,成功构建了BMP-7真核表达质粒并在心肌细胞中稳定高效的表达,为应用于抗缺血再灌注损伤的研究创造了条件。

不同重复序列缺失的极低密度脂蛋白受体基因转染的中国仓鼠卵巢细胞与β-极低密度脂蛋白的结合效应

为了探索极低密度脂蛋白受体配体结合域中 8个重复序列在结合脂蛋白中的作用 ,利用基因缺失诱变的方法 ,构建了不同重复序列缺失的极低密度脂蛋白受体缺失突变真核表达载体 ,并将各重组体转移至体外培养的中国仓鼠卵巢细胞。通过逆转录—聚合酶链反应检测到外源基因的表达。转染细胞与DiI标记的 β 极低密度脂蛋白结合实验发现 :重复序列 1,2缺失的极低密度脂蛋白受体结合 β 极低密度脂蛋白的能力明显降低。为进一步研究极低密度脂蛋白受体结构与功能的关系奠定了基础。

HSP70基因转染对缺氧-再复氧肠上皮细胞生长能力影响的研究

目的 :研究重组腺病毒介导的热休克蛋白 70转染对缺氧再复氧损伤后肠上皮细胞生长能力的影响。方法 :将重组含人全长 HSP70基因的腺病毒转染体外培养的肠上皮细胞株 IEC 6 ,检测转染细胞 HSP70的 m RNA表达水平。 IEC 6细胞经缺氧再复氧处理后 ,对未转染组 ,转染 2 4 h、4 8h及 72 h组细胞的细胞活力、生长曲线、增殖能力进行检测分析。结果 :腺病毒转染组细胞 HSP70 m RNA表达呈阳性。经缺氧再复氧处理后 ,IEC 6转染细胞活力较未转染组活力明显增强 (P<0 .0 1) ,生长能力提高 (P<0 .0 5 ) ,分裂指数增高(P<0 .0 5 )。结论 :重组腺病毒介导的 HSP70转染可增强肠上皮细胞生长及增殖能力 ,从而保护其抵抗缺氧再复氧损伤。

BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞修复羊股骨头坏死的生物力学研究

目的观察BMP-2基因转染的自体骨髓间充质干细胞(MSCs)修复羊股骨头坏死后的局部生物力学变化。方法11只羊共22侧后肢,其中3只(6侧)作为正常对照,8只(16侧)通过结扎旋股内外侧动脉和液氮灌注等方法建立股骨头无菌性坏死动物模型。8只模型羊中,3只(6侧)不处理作为空白对照;5只共10侧植入分别复合BMP-2基因或β-gal基因转染的自体MSCs的β-磷酸三钙多孔材料,其中左侧为BMP-2治疗组,右侧为β-gal对照组,植入后第16周将所有动物处死,取植入区松质骨标本和软骨下骨进行压缩试验。结果BMP-2组植入区松质骨标本的最大抗压强度为(38.35±4.16)MPa,弹性模量为(86.85±7.28)MPa;软骨下骨的最大抗压强度为(80.76±5.32)MPa,弹性模量为(126.65±10.88)MPa。这些参数均与正常骨接近,显著大于未治疗组和β-gal组(均为P<0.05)。结论BMP-2基因转染自体干细胞可促进坏死股骨头修复,改善植入区松质骨和软骨下骨的力性能,防止股骨头软骨面的塌陷。