5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导转染人APP695基因的SH-SY5Y细胞应激损伤的保护作用

目的探究5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导转染人APP695基因的SH-SY5Y细胞(APPsw细胞)氧化应激损伤的保护作用。方法将APPsw细胞传代培养24 h后,加入不同浓度(0.01,0.1,1.0和10μmol·L^-1)的A7预处理24 h,再加入200μmol·L^-1过氧化氢(H 2 O 2)继续培养24 h,用MTT法检测细胞活性,用Hoechst染色法检测细胞凋亡,用Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率。结果5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7可剂量依赖性地增加过氧化氢处理后的细胞活力,经不同浓度的A7预处理后,加过氧化氢处理组的细胞活性明显低于对应单独A7处理组的细胞活性,但均高于单独过氧化氢处理组的细胞活性,差异具有统计学意义(P<0.05)。经不同浓度A7预处理后,加过氧化氢处理组与过氧化氢组比较细胞核中荧光显著变暗。过氧化氢组细胞早凋率为42.4%,A7(0.01,0.1,1.0和10μmol·L^-1)预处理24 h后加过氧化氢处理组细胞早凋率分别为22.7%,19.9%,16.4%和15.9%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论5-取代-1-氮杂蒽醌类衍生物A7对过氧化氢诱导APPsw细胞的氧化应激损伤具有保护作用,可抑制细胞凋亡。

人参二醇对APP-SH-SY5Y细胞中Tau蛋白磷酸化及Fyn/GluN2B信号通路的影响

目的:研究人参二醇(PD)对转染APP基因的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(APP-SH-SY5Y)中Tau蛋白磷酸化的影响及其作用机制。方法:采用分子对接技术验证PD与非受体酪氨酸激酶Fyn的靶向性。在体外培养SH-SY5Y细胞,构建APP-SH-SY5Y细胞模型和绿色荧光蛋白(GFP)-SH-SY5Y细胞模型(对照细胞),通过检测细胞中β淀粉样蛋白(Aβ1-42)的表达来验证APP-SH-SY5Y细胞模型是否构建成功。以GFP-SH-SY5Y细胞为对照,采用CCK-8法检测5、10、20、30、40μmol/L的PD和125、250、500、1000、2000 nmol/L的PP2(Fyn抑制剂,阳性对照)作用24 h对APP-SH-SY5Y细胞存活率的影响,以确定最佳给药浓度。以APP-SH-SY5Y细胞为对象,分别检测最佳浓度PD、PP2作用24后细胞中Ca2+浓度及磷酸化Tau蛋白(p-Tau)/Tau、磷酸化非受体酪氨酸激酶Src(p-Src)/Fyn、磷酸化谷氨酸受体2B(p-GluN2B)/GluN2B比值。结果:分子模拟对接结果显示,PD可靶向结合Fyn蛋白。与GFP-SH-SY5Y细胞比较,APP-SH-SY5Y细胞中Aβ1-42蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。PD和PP2的最佳作用浓度分别为20μmol/L和500 nmol/L。20μmol/L PD、500 nmol/L PP2均可显著升高细胞的存活率,显著降低细胞中Ca2+浓度以及p-Tau/Tau、p-Src/Fyn、p-GluN2B/GluN2B比值。结论:PD可通过抑制Fyn/GluN2B信号通路来降低APP-SH-SY5Y细胞中Ca2+浓度及Tau蛋白的磷酸化水平。

DHRS4基因簇缺失型神经母细胞瘤细胞株的克隆和鉴定

目的单克隆培养人神经母细胞瘤SH-SY5Y-细胞株,并鉴定其在基因水平缺失DHRS4基因簇,包括DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1的基因序列。方法有限稀释法培养实验室偶得的低表达DHRS4基因的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,相差显微镜观察细胞的生长和增殖,PCR、RT-PCR检测DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1基因的DNA和RNA含量,Westernblotting检测DHRS4蛋白的表达。结果筛选得到单克隆神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,在DNA、RNA和蛋白水平均未检测到DHRS4基因簇的DNA序列及表达产物。结论经过克隆低表达DHRS4基因簇的SH-SY5Y细胞,得到纯系的DHRS4基因簇缺失的SH-SY5Y-细胞株,该细胞对于进一步研究DHRS4基因簇的功能和表达调控都是难得的细胞模型。

突变型APP基因转染对神经细胞尼古丁受体的影响

目的：探讨阿尔茨海默病（AD）发病机制中的重要物质淀粉样蛋白前体蛋白（APP）高表达对神经型尼古丁受体（nAChR）的影响。方法：将含有瑞典家庭性AD双突变的APP670/671基因（APPSWE）转入神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞和原代培养的大鼠神经细胞,

TSG101小干扰RNA对SH-SY5Y细胞生长和药物敏感性的作用

目的:探讨TSG101基因对人神经母细胞瘤细胞生长和药物敏感性的调节作用。方法:构建TSG101基因的小干扰RNA载体并将其转导入SH-SY5Y细胞,G418筛选后获得稳定转染的阳性克隆后,应用RT-PCR和Western blotting进行鉴定;MTT法和流式细胞仪检测细胞转染前后生长速度和细胞周期的变化;DNAlad-der法和流式细胞仪检测细胞转染前后对顺铂诱导的凋亡的变化;Western blotting检测细胞转染前后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax,耐药相关蛋白P-gp、MRP的表达变化。结果:成功构建了TSG101的小干扰RNA载体并将其转染SH-SY5Y细胞;筛选到稳定的TSG101低表达的神经母细胞瘤细胞模型;MTT和流式细胞仪检测结果显示,转染TSG101小干扰RNA后的细胞的生长速度显著减慢于对照组(P<0·05),且G1期的细胞比率显著高于对照组(P<0·05);DNAladder法和流式细胞仪检测结果显示,用10mg/LCDDP处理36h后,转染TSG101小干扰RNA后的细胞的凋亡数显著多于对照组(P<0·05),形成DNA条带;Western blotting显示,转染TSG101小干扰RNA后的细胞中Bcl-2和P-gp的表达明显低于对照组。结论:下调TSG101基因能抑制神经母细胞瘤细胞生长,增加细胞对化疗药物的敏感性,提示TSG101在基因治疗中具有较好的临床应用前景。

γ-氨基丁酸Rho2受体在神经母细胞瘤细胞中的稳定表达及其在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用

目的构建人γ-氨基丁酸(GABA) Rho2受体(GABRR2)真核表达载体,并转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞,建立稳定表达细胞株,探讨GABRR2在谷氨酸盐致细胞死亡中的作用。方法采用快速克隆方法将人脑组织GABRR2基因克隆至p IRES2-eGFP质粒,构建重组质粒p IRES2-eGFP-Rho2,利用X-fect试剂盒将其转染至SH-SY5Y细胞中,使用遗传霉素进行筛选,建立稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株。使用流式细胞术检测稳定转染过表达p IRES2-eGFP-Rho2的细胞,利用免疫荧光法鉴定稳定转染的SH-SY5Y细胞中p IRES2-eGFP-Rho2的表达。将野生型SH-SY5Y细胞分为A1、B1、C1组,稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞分为A2、B2、C2组,每组设3个平行孔,其中A1、A2组细胞使用达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)孵育,B1、B2组细胞使用含有谷氨酸盐的DMEM孵育,C1、C2组细胞使用含有谷氨酸盐和GABA的DMEM孵育,将各组细胞置于细胞培养箱中培养24 h,应用乳酸脱氢酶试剂盒检测各组细胞的存活率。结果重组真核表达载体构建正确,获得了稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的细胞株。A1、B1、C1组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=5. 542,P <0. 05);其中B1、C1组细胞存活率显著低于A1组(P <0. 05),C1组细胞存活率显著高于B1组(P <0. 05)。A2、B2、C2组细胞存活率比较差异有统计学意义(F=6. 588,P <0. 05);其中B2、C2组细胞存活率显著低于A2组(P <0. 05),C2组细胞存活率显著高于B2组(P <0. 01)。A2组细胞存活率与A1组比较差异无统计学意义(P> 0. 05),B2组细胞存活率显著低于B1组(P <0. 05),C2组细胞存活率显著低于C1组(P <0. 05)。结论成功构建p IRES2-eGFP-Rho2真核表达载体,建立了稳定表达p IRES2-eGFP-Rho2的SH-SY5Y细胞株,为体外研究GABRR2的功能提供了实验基础,并证明使用GABA可缓解谷氨酸盐对细胞的损伤,为缺血性脑损伤的分子生物学治疗提供了靶点。

重组大鼠质粒pEGFP-GDNF的构建及真核细胞转染

目的 构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的真核细胞表达载体,为应用GDNF进行如帕金森综合征之类的神经元退化性疾病的基因治疗打基础。方法 采用RT- PCR方法从大鼠胎脑组织总RNA中扩增出该基因的c DNA序列,并克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的真核表达载体p EGFP- C1中,对重组质粒p EGFP- GDNF进一步鉴定。采用电转及阳离子脂质体将重组质粒p EGFP- GDNF转染至SH- SY5 Y细胞。结果 大鼠GDNF c DNA已正确地克隆到真核表达载体p EGFP- C1中,而构建成重组大鼠质粒p EGFP-GDNF。GDNF基因可稳定表达在细胞中。结论 真核细胞表达载体p EGFP- GDNF以及表达GDNF工程细胞SH-SY5 Y的成功构建,为进一步开展GDNF基因治疗PD等中枢神经系统疾病奠定了基础。

TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立

神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是儿童最常见且致死性极高的实体肿瘤之一[1]。由NB所致死亡人数占所有儿童肿瘤死亡总数的15%[2]。分子靶向治疗是近年肿瘤领域研究的热点[3]。TAZ是一个包含WW-domain结构域的转录共激活子,参与多种肿瘤细胞的增殖、调控肿瘤转移,并能预测部分肿瘤患者的预后情况[4]。针对Oncomine肿瘤数据库NB肿瘤组织的生物信息学分析发现,TAZ基因在NB肿瘤组织中呈高表达,且随着NB的恶化,表达逐渐升高。而TAZ是否参与NB的形成及恶化尚未完全明确。

他米巴罗汀对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖及酪氨酸激酶受体A、N-myc表达的影响

目的研究他米巴罗汀(Tamibarotene,Am80)对神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖抑制能力及酪氨酸激酶受体A(TrkA)、N-myc (即MYCN) mRNA和蛋白表达的影响,为治疗神经母细胞瘤提供实验依据。方法采用不同浓度(0、10、20、40、80、160 μmol/L)Am80作用SH-SY5Y细胞48 h。采用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)检测细胞增殖情况。采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot法检测48 h时SH-SY5Y细胞中TrkA、MYCN mRNA和蛋白的表达情况。结果当Am80浓度为10 μmol/L时,Am80对SH-SY5Y细胞无显著抑制作用[(3.51±1.68)%,抑制率<5%];当Am80浓度为20 μmol/L时,显示弱抑制作用[(9.60±1.97)%,抑制率<10%];Am80浓度为80 μmol/L时,对SH-SY5Y细胞增殖的抑制率显著增强[(57.43±4.95)%];TrkA随着Am80浓度增加,表达量增加;Am80能显著降低SH-SY5Y细胞MYCN的表达(10 μmol/L:0.65±0.05比20 μmol/L:0.36±0.06),差异有统计学意义(P<0.05)。结论Am80可抑制SH-SY5Y细胞的增殖,随着Am80浓度的增加,对细胞的抑制作用逐渐增强,Am80浓度越高对肿瘤细胞的抑制作用越显著。其机制可能与通过下调MYCN来提升TrkA的表达有关。

质粒介导的RNAi对神经母细胞瘤细胞Survivin基因表达的抑制作用

目的构建Survivin的短发夹RNA表达质粒并通过由其介导的RNA干扰来下调神经母细胞瘤细胞株SH-SY5Y细胞中Survivin的表达。方法针对人Survivin的mRNA序列设计合成两对寡核苷酸序列,退火后将其连入pBSHH1,对重组质粒pBSHH1-S1和pBSHH1-S2进行酶切和测序鉴定,然后将质粒转染SH-SY5Y细胞,运用RT-PCR和Western印迹检测Survivin基因的表达。结果酶切和测序证实目的寡核苷酸片段已被克隆到pBSHH1,pBSHH1-S1和pBSHH1-S2转染SH-SY5Y细胞后,Survivin基因的mRNA以及蛋白水平的表达量均受到明显抑制。结论成功构建了人Survivin基因的短发夹RNA表达质粒,并在SH-SY5Y细胞中验证了它们对Survivin基因的表达抑制作用,为神经母细胞瘤等肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。