人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的构建人MCHR2真核表达载体,转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR2基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,用RT-PCR、W estern b lot及免疫荧光法检测MCHR2的表达。结果成功构建了pcDNA3.1(+)/MCHR2真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。结论真核表达载体成功构建和稳定转染CHO细胞系的建立为进一步研究MCHR2的功能奠定良好的实验基础。

人透明质酸酶真核表达载体的构建及稳定转染CHO细胞系的建立

目的构建人透明质酸酶真核表达载体,并将其转染CHO细胞,建立稳定转染的CHO细胞系。方法根据已知的天然人透明质酸酶PH20的氨基酸序列,利用PCR技术,将其克隆至真核表达载体MO2中,得到表达质粒MO2/ph20。经酶切和测序鉴定后,用脂质体转染法转染CHO细胞,通过G418(800μg/mL)筛选,建立稳定转染的CHO细胞系,SDS-PAGE法检测重组人透明质酸酶的蛋白表达水平,利用3,5-二硝基水杨酸法检测筛选得到的4个阳性细胞克隆的生物活性。结果成功构建了MO2/ph20真核表达载体,并建立了稳定转染的CHO细胞系,成功地表达目的基因。重组人透明质酸酶表观相对分子质量约为70×103,4个阳性细胞克隆的酶活性均高于9000 U/L,其中MO2/ph20-4细胞株酶活性高达10 000 U/L以上。结论本研究成功构建了能够正确表达人透明质酸酶基因的真核表达载体MO2/ph20,并获得了有生物活性的重组人透明质酸酶,该体系的建立为进一步规模化生产重组人透明质酸酶奠定了基础。

人谷胱甘肽硫转移酶A1基因在CHO细胞中的表达

目的构建人谷胱甘肽硫转移酶A1(GSTA1)的CHO细胞表达体系。方法重组质粒pDNA3.1-GSTA1用lipofectamineTM2000转染CHO细胞,用G418筛选细胞的阳性克隆,并用PCR、RT-PCR和Western blot进行鉴定,测定GSTA1酶活性。结果将pDNA3.1-GSTA1转染CHO细胞,用G418筛选,用PCR、RT-PCR和Western blot进行鉴定,表明GSTA1基因已转染到CHO细胞的基因组,并转录表达,生成GSTA1蛋白质,经测定活性达到35mmol/(mg.min蛋白)。结论CHO-GSTA1细胞表达,为基因工程生产具有完整功能GSTA1的进一步纯化提供了材料。

CD80/IgG融合基因重组表达载体的构建及在CHO细胞中功能性表达的研究

目的构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国地仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovum,CHO)中功能性表达,寻找消除白血病细胞免疫逃逸的有效方法。方法采用定向分子克隆技术将小鼠CD80胞外段和IgG1Fc段的cDNA串联至真核表达载体pcDNA3.0中,运用脂质体将所得的重组子转染CHO细胞,经免疫印迹、斑点ELISA检测其表达,免疫亲和层析法纯化其表达产物,用流式细胞术、MTT比色法及ELISA在体外检测该产物的生物学活性。结果两段目的基因按预期设想克隆入空载体中并得到了表达,亲和层析纯化获得了高纯度目的蛋白,该蛋白能够将白血病细胞表面CD80分子密度提高5倍,并可显著增强同种异体小鼠淋巴细胞的增殖、对白血病细胞的杀伤以及IL-2的分泌。结论成功构建了融合基因真核表达载体,其表达产物在体外具有相应的生物学功能,有希望成为消除白血病细胞免疫逃逸的有力工具。

乙型肝炎表面抗原不同突变体对细胞免疫的影响

目的 研究乙型肝炎表面抗原(HBsAg)不同突变体对细胞免疫的影响。方法 将野生型和变异型HBsAg基因重组质粒NS2 Swt、NS2 S12 6、NS2 S133、NS2 S14 1、NS2 S14 5分别转染CHO细胞,72h收获细胞上清。采用ELISA法检测各组细胞上清preS2 蛋白的表达量。将这些细胞上清刺激PHA活化的人淋巴细胞,MTS法检测不同变异株抗原对淋巴细胞增殖活性以及淋巴细胞分泌IFN γ、IL 10和IL 2的影响。结果 变异和野毒株(wt)各组细胞上清preS2 蛋白的表达量基本一致。变异和wt重组HBsAg刺激T细胞后,其上清MTS显色后的A4 90 值均高于空白组和pCI neo组,说明HBsAg中的蛋白可以促进T细胞增殖;T12 6S氨基酸变异HBsAg能够刺激IFN γ分泌增加;M133T氨基酸变异刺激IL 10分泌增加。结论 这4种乙型肝炎病毒(HBV)变异株感染人体后,机体对它们的细胞免疫反应可能不会有明显的增强或减弱,但也不能忽视T12 6S和M133T变异抗原改变了某些细胞因子的表达,可能对机体细胞免疫造成的潜在影响。