转融合基因Cry1Ab/Ac水稻稻杆对泥鳅蛋白水解酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响

为探索转Bt抗虫水稻对泥鳅的毒性作用,采用水体中添加不同浓度(10、50、100、200 mg/L)的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻华恢1号(HH1)稻杆粉饲养泥鳅,非转基因亲本明恢63(MH63)作对照,不加稻杆粉为空白对照,分析了对泥鳅蛋白水解酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)的影响。研究发现:经4个浓度处理后,泥鳅的胃蛋白水解酶、肠蛋白水解酶和脑AChE、肝脏AChE、肌肉AChE与对照组泥鳅相比均无显著差异(n=3,P>0.05)。高浓度(200 mg/L)HH1、MH63组泥鳅胃蛋白水解酶与空白对照相比均显著降低(n=3,P<0.05);低浓度(10 mg/L)HH1组泥鳅肝脏AChE与空白对照差异显著(n=3,P<0.05);不同浓度HH1、MH63稻杆粉对泥鳅的肠蛋白水解酶、脑AChE和肌肉AChE均无显著影响(n=3,P>0.05)。结果表明:HH1水稻稻杆粉对泥鳅的消化道蛋白酶和乙酰胆碱酯酶没有影响,而水体中高剂量的HH1或MH63稻杆粉均会降低泥鳅胃的消化能力。

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM0304叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。

转cry1 Ab基因水稻中毒蛋白的表达、分泌及其在土壤中的残留

研究了转cry1Ab基因水稻 (克螟稻 )中Cry1Ab毒蛋白的表达、根系分泌及其在土壤中的残留规律 .结果表明 ,分蘖始期至成熟期 ,克螟稻地上部和根部中的Cry1Ab毒蛋白的表达量 (FW)分别为 3 2 3～ 8 2 2 μg/ g和 0 6 8～ 0 89μg/g .生育期间克螟稻根系分泌的Cry1Ab毒蛋白含量仅为 1 6 6～ 4 8 0 2ng/ (株·d) .试验证实 ,克螟稻根际土中的Cry1Ab毒蛋白残留含量低于检测限 (<0 5ng/ g干燥土 ) .生物测定还表明 ,克螟稻根际土及其提取液对棉铃虫初孵幼虫和 3龄幼虫不产生致死性效应 .相对于Cry1Ab毒蛋白的根系分泌转移 。

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。

转Btcry1Ab基因水稻对稻田弹尾虫种群数量的影响

以转Btcry1Ab基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)及其亲本非转基因水稻秀水11(XS11)为材料,于2003年9月和翌春4月,调查了KMD1和KMD2对水稻灌浆期和收割后休田期稻田土表落叶层中弹尾虫种群数量的影响.结果表明,KMD植株表达的cry1Ab杀虫蛋白可在稻田环境中残留160d以上;在水稻灌浆期采用吸虫器法在稻田落叶层中采集到灰橄榄长角跳虫(Entomobrya griseoolivata)和钩圆跳虫(Bourletiella christianseni)等2种弹尾虫,其中灰橄榄长角跳虫在KMD1和KMD2稻田中的种群密度显著高于XS11稻田;在水稻收割后休田期采用网袋法采集到灰橄榄长角跳虫、钩圆跳虫、球角跳虫(Hypogastrura matura)和等节跳虫(Isotoma monochaeta)等4种弹尾虫,其中转Bt基因水稻稻田中的灰橄榄长角跳虫和球角跳虫的种群密度显著高于XS11稻田,且其植株组织残体生物量损失率显著高于XS11.

转Bt基因抗虫玉米植株叶腋处花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

以表达Cry1Ab杀虫蛋白的两种转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法研究了玉米散粉时沉积在植株叶腋处Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态,比较了两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度.结果表明,Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白是逐渐降解的,且降解速度逐渐加快.但两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,MON810中的Bt杀虫蛋白降解较快,而Bt11中的降解较慢.d15时在MON810叶腋处的花粉中已经检测不到Bt杀虫蛋白,而在Bt11花粉中Bt杀虫蛋白到d18才完全降解.两种Bt玉米花粉中杀虫蛋白的初始含量差异显著,且在各个取样时间内Bt杀虫蛋白的残留量存在显著差异.玉米散粉时留在田间的Bt玉米花粉中的Cry1Ab杀虫蛋白不会在自然界累积.

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。

泥鳅生长及抗氧化-解毒酶系统对水体中转Cry1Ab/Ac基因水稻残遗物的响应

在泥鳅养殖水体中添加稻秆粉模拟水稻残遗物生境,研究了泥鳅生长和肝胰脏抗氧化酶(SOD、CAT)与解毒酶(GST)活性对转Cry1Ab/Ac基因水稻‘华恢1号’(HH1)的响应。设计以HH1稻秆粉10 mg·L?1、50 mg·L?1、100 mg·L?1和200 mg·L?1 4个梯度浓度处理泥鳅为试验组,以非转Bt基因水稻‘明恢63’(MH63)稻秆粉处理组为阴性对照,不加稻秆粉的基础饲养组为空白对照。结果显示:在4种稻秆粉浓度下,HH1组与MH63对照组泥鳅的特定生长率、肥满度、内脏系数及SOD、CAT和GST酶活性均无显著差异(P>0.05);与空白对照比较,稻秆粉浓度升高对泥鳅生长的抑制逐渐增强,当浓度达到200 mg·L?1时,HH1组和MH63对照组泥鳅的特定生长率、内脏系数与CAT活性降低。研究结果表明,水体中低含量的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻HH1稻秆粉对泥鳅的生长与生理酶活性没有明显影响,高浓度HH1和MH63稻秆粉均使泥鳅的生长和生理酶活性显著降低,这可能与养殖水体中浓度较高的悬浮稻秆粉妨碍了泥鳅的呼吸和滤食,及稻秆粉的分解降低了水体p H和溶氧量有关。

转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎生长发育的影响

测定了转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎的致死作用及生长发育的影响。结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫具有一定程度的控制作用,但不理想;转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫的生长发育有较大的影响,表现为使各虫态发育历期延长,化蛹时间和羽化时间延长,幼虫虫体质量和蛹质量减轻,化蛹率和羽化率明显降低。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花对天敌生长发育的影响

以转Cry1Ac基因棉和常规棉品种为对照,系统研究了转Cry1Ac+Cry2Ab棉花对小花蝽、龟纹瓢虫和中华草蛉生长发育的影响。结果表明,和常规棉品种相比,饲喂取食转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉和转Cry1Ac基因棉品种叶片的棉铃虫初孵幼虫使各天敌不同龄期的生长发育历期均有所延长,前者延长的历期短,后者延长的历期长,但差异均未达显著水平。

转cry1 Ab基因水稻对二化螟幼虫血细胞的影响

研究了转cry1 Ab基因水稻“克螟稻1号”对二化螟Chilosuppressalis幼虫细胞免疫系统的影响。结果表明,转cry1 Ab基因水稻对二化螟幼虫的血细胞影响明显,取食转cry1 Ab基因水稻后,二化螟幼虫各类血细胞都明显低于取食非转基因水稻“秀水11”的对照组(原血细胞和囊血细胞在取食初期例外),随取食时间延长,各类血细胞数量及血细胞总数均呈递减的趋势。从各类血细胞所占血细胞总数的百分比来看,原血细胞在取食36h后锐减,而浆血细胞和粒血细胞则比例增加,其余珠血细胞、囊血细胞的变化不明显。另外,血细胞还出现空泡化、肿胀等病态变化,致使血细胞快速破裂。由此推测转cry1 Ab基因水稻自身表达的毒蛋白能严重干扰靶标昆虫二化螟幼虫的细胞免疫系统。

转Cry1Ab基因水稻种质杂交后代的标记辅助选择及抗虫性评价

以转Cry1Ab基因的水稻株系TS-9(后命名为克螟稻)为种质, 与优良亲本杂交, 在分离世代,通过与目标基因紧密连锁的潮霉素抗性作为筛选标记,结合田间农艺性状选择, 获得目标基因位点纯合的新品系。Cry1Ab蛋白含量检测结果表明大多数新品系携带的靶基因在经杂交重组、自交纯合后保留了原亲本高效表达的特性。抗虫鉴定结果表明,对二化螟(Chilosuppressalis)、稻纵卷叶螟等(Cnaphalocrocismedinalis)鳞翅目害虫表现高抗性能,同时,在株高、生育期、产量构成因子等重要农艺性状上也有显著改良。从而,对转基因水稻种质的育种利用途径和选择方法作了有益探索。

转Bt基因植物表达产物Cry1Ab蛋白的制备纯化方法研究

以转Bt基因水稻为试材,研究其表达产物Cry1Ab蛋白的提取、分离及纯化的方法。实验结果表明,DEAE纤维素填料对Bt蛋白有较好捕获效果。根据生物信息学方法预测了目标蛋白和主要共存蛋白的等电点和疏水性差异。合理地选择了阴离子交换色谱与疏水作用色谱组合方法。提取液经DEAESephadexA50柱层析及PhenylSepharoseFastFlow疏水层析分离后,目标蛋白得到了显著的纯化。考察了疏水层析中用不同洗脱液洗脱Cry1Ab蛋白对活性回收率和纯度的影响,结果表明:以0.25mol/LKSCN作洗脱液对活性影响最小,HIC一步纯化倍数可达8倍,总纯化倍数达100倍。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前,需对其生态环境安全性进行评价;同时,经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢,进而导致一些综合的生态学效应,致使棉花生理上发生改变,这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势;SOD和POD活性在花铃期明显升高,CAT、APX和GR活性无显著变化;蛋白质、氨态氮含量无明显变化,脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势;棉酚含量在3个时期无显著变化,而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异;单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花>转Cry1Ac基因棉花>非转基因棉花,小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花<Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花<非转基因棉花;昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田<转Cry1Ac基因棉田<非转基因棉田,天敌亚群落昆虫个体总数无显著变化;3种棉田中昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的物种数均未发生显著变化。【结论】转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性在不同生长期表现不同,但上述参数在3种棉花之间无显著差异;且转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花具有较好的抗虫性,能有效降低棉田害虫数量。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉与转Cry1Ac+EPSPS基因棉在黄萎病菌压力环境下检测技术和生存竞争能力研究

旨在研究2种转双价基因棉在棉黄萎病菌压力环境下的生存竞争能力。以‘赣棉杂1号’和‘赣棉11号’为对照,在黄萎病圃检测转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉、转Cry1Ac+EPSPS基因棉发病情况、生长和产量竞争能力。2个转双价基因棉抗黄萎病性不显著的强于2个对照;转Cry1Ac+EPSPS基因棉株高、覆盖度增长竞争能力相对较强,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉相对较弱;转Cry1Ac+EPSPS基因棉的单株成铃和果枝层数较高,增长竞争能力也较强,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉较弱;2个转双价基因棉最后的脱落率与2个对照差异不显著;转Cry1Ac+EPSPS基因棉籽棉、皮棉产量介于2个对照之间,而转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉的产量低于2个对照。转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉推广种植可行性相对较差,转Cry1Ac+EPSPS基因棉推广种植可行性一般。

转cry1Ab基因玉米对瓢虫科天敌种群动态的影响

【背景】瓢虫科天敌昆虫是玉米田中重要的天敌类群,可捕食多种农业害虫,对害虫有很好的控制作用。为了明确转基因玉米对瓢虫科天敌的潜在效应。【方法】在田间条件下,采用系统调查结合吸虫器方法,研究了cry1Ab基因玉米对玉米田主要瓢虫科天敌种类丰富度和种群动态的影响。【结果】转cry1Ab基因玉米田与其对照田瓢虫类群和优势种群组成相同。春播时Bt玉米田与对照田以龟纹瓢虫为优势种,仅在玉米生长后期Bt玉米田中的龟纹瓢虫数量显著高于对照田,其他时期2种田间龟纹瓢虫的种群动态没有显著差异。夏播玉米田以龟纹瓢虫和异色瓢虫为主,在8月17日Bt玉米田中异色瓢虫数量显著高于对照田,在9月27日其异色瓢虫数量显著低于对照田,而其他时期Bt玉米田和对照田中异色瓢虫优势度以及田间种群动态没有显著差异。【结论与意义】转cry1Ab基因玉米对玉米田重要的瓢虫科天敌丰富度、优势度和种群数量没有不良影响。因此,该转基因玉米可用于农田生态系统的有害生物管理。

我国3个主产棉区转Bt/CpTI基因棉田根际土壤中Cry1Ab蛋白的降解动态

于2009—2010年棉花种植期,在长江流域、黄河流域和西北内陆3个主产棉区分别选择代表地———江西九江、河南新乡和新疆喀什,采集长期种植转Bt/CpTI棉SGK321及其亲本石远321棉(对照)的棉田根际土壤样品,采用酶联免疫吸附法对根际土壤中Cry1Ab蛋白含量进行残留动态监测。结果显示,在各产棉区棉花蕾期、花期和铃期,转Bt/CpTI棉田根际土壤Cry1Ab蛋白含量大多显著高于对照棉田;而在棉花成熟期,转Bt/CpTI棉田根际土壤Cry1Ab蛋白含量与对照棉田大多无显著差异。长期种植转Bt/CpTI基因棉花不会造成Cry1Ab蛋白在棉花根际土壤中的累积。

转cry1Ab基因棉花质粒标准分子的构建与分析

为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状,本研究构建了含转基因棉花cry1Ab基因序列及棉花fsACP(fiber-specific acyl carrier protein)内标基因序列的质粒标准分子,经PCR、酶切、测序等方法的验证,证明了所构建质粒的正确性。利用荧光定量PCR技术系统地分析了所建质粒的重复性、特异性、均匀性、均一性和不同温度下处理不同时间的质粒标准分子的稳定性。结果表明,所构建质粒的重复性、特异性、均匀性及均一性良好,质粒溶液在低温条件(70℃、20℃和4℃)下可稳定储存6个月,且具有稳定的质粒量值,不宜高温(20℃和40℃)保存。本研究为质粒标准分子的制备、性状分析及保存环境等相关研究提供了试验依据。

多年连续种植转基因Bt汕优63稻田水体和土壤中Cry1Ab/c蛋白残留调查

以湖北武汉、随州、武穴和孝感以及山东德州5个多年转基因水稻种植区为试验地,在水稻生育期采集转cry1 Ab/c基因水稻Bt汕优63（Bt-SY63）和对照非转基因汕优63（SY63）稻田水体和土壤,使用酶联免疫吸附测定（ELISA）方法对稻田水体和土壤Cry1Ab/c蛋白残留量进行动态监测。结果显示,与SY63稻田相比,连续种植2-4 a后,不同生育期Bt-SY63稻田水体Cry1Ab/c蛋白残留量大多与同一生育期SY63样品间差异未达显著水平（P〉0.05）,最高残留量为0.373 ng·mL^-1。与水体Cry1Ab/c蛋白残留情况相似,不同生育期Bt-SY63稻田土壤Cry1Ab/c蛋白残留量大都低于试剂盒检测限（0.25 ng·g^-1）,仅随州苗期、德州拔节期和开花期样品有微量残留,鲜土残留量分别为0.261、0.540和0.361 ng·g^-1,并分别与SY63样品间差异显著（P〈0.05）。另外,多年连续种植Bt-SY63水稻后,2、3和4 a种植年限的Bt-SY63稻田水体和土壤中Cry1Ab/c蛋白残留量之间大都没有显著差异（P〉0.05）。认为连续种植2、3和4 a的Bt-SY63水稻稻田水体和土壤仅存在微量Cry1Ab/c蛋白残留,不会造成Cry1Ab/c蛋白在稻田水体和土壤中的累积。

转cry1Ac+cry2Ab基因棉对土壤细菌群落结构和功能多样性的影响

以不同生育期转cry1 Ac+cry2Ab基因棉和常规棉田土壤为对象,采用传统平板培养、Biolog分析和变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,研究了该新型转基因材料对土壤细菌群落结构和功能多样性的影响。可培养细菌数量测定结果表明,在棉花整个生育期,2种棉田土壤可培养细菌数量具有相同的变化趋势;与常规棉相比,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉田可培养土壤细菌数量在蕾期存在显著差异(P<0.05),其他生育期则无显著差异。Biolog分析结果显示,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉和常规棉田土壤细菌活性和碳源利用能力在苗期和蕾期存在明显差异,其他生育期则无明显不同。PCR-DGGE图谱的聚类分析结果表明,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉与常规棉田土壤细菌群落结构均随着生育期的不同而发生改变,且两者仅在花铃期出现明显差异。对PCR-DGGE条带的序列分析表明,转cry1 Ac+cry2 Ab基因棉与常规棉田土壤细菌之间的差异具有随机性,可能与采样时期或采样点的差异有关。综上所述,2种棉田土壤细菌群落结构和功能多样性在整个棉花生育期的变化趋势基本一致,转cry1Ac+cry2Ab基因棉仅在某些时期对其产生短暂影响,大部分时期无明显影响。