2型转谷氨酰胺酶对人胶质母细胞瘤细胞U251放射敏感性的影响

为探讨2型转谷氨酰胺酶(transglutaminase 2,TG2)对胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)放射敏感性的影响。通过生信分析TG2表达与胶质瘤病人预后的关系,并分析了其在GBM放射抵抗细胞株U251中的水平;瞬时转染得到TG2过表达细胞(U251-TG2)或空载细胞(U251-EV);CCK8法绘制生长曲线;transwell检测细胞迁移能力;不同剂量X射线照射后,检测细胞克隆形成能力、ROS水平;并通过免疫荧光检测γ-H2AX水平;Western blot检测自噬关键分子Beclin-1、LC3及mTOR磷酸化水平。结果显示,TG2高表达胶质瘤患者具有更差的无进展间隔期及总生存期,TG2在放射抵抗型U251中的表达显著高于野生型U251;U251-TG2细胞增殖能力高于U251-EV,且前者迁移能力高于后者;经X射线照射后,U251-TG2细胞克隆形成率高于U251-EV,前者ROS水平及γ-H2AX荧光焦点数均低于后者;自噬关键蛋白Beclin-1及自噬活性指标LC3-Ⅱ/Ⅰ比值在U251-TG2的水平均高于U251-EV,且前者mTOR磷酸化水平低于后者。实验结果证明,X射线照射后,TG2可能通过抑制mTOR磷酸化的方式促进自噬,进而降低GBM细胞U251的放射敏感性。

基于转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶的心肌细胞体外培养

目的研究微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,mTG)交联明胶水凝胶对新生大鼠心肌细胞活力和增殖的影响,并探究该水凝胶在心肌组织工程应用中的适用性。方法采用微生物转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶作为基质材料,进行新生大鼠心肌细胞的体外培养。通过倒置光学显微镜观测心肌细胞生长状况,并选取培养一周内的心肌细胞进行细胞相容性评估:采用钙绿黄素-AM/碘化丙啶进行活/死染色,表征了在明胶水凝胶表面培养的心肌细胞的细胞活性;采用MTT法分析细胞在水凝胶表面的增殖情况。使用DAPI和心肌细胞标志蛋白cTnI、cTnT免疫荧光染色法,检测体外培养的心肌细胞在明胶水凝胶基底上的心肌源性和成熟状态。结果在37℃下加入mTG溶液的明胶快速凝胶,接种后的心肌细胞在4 h内完全粘附。明场下可清楚观测到心肌细胞的增殖和随时间逐渐同步的自发搏动行为。活/死染色和MTT测定结果显示,mTG-GA水凝胶上心肌细胞具有良好的活性,并保持了相当的增殖潜力。cTnI和cTnT荧光染色结果说明,相较于培养板上传统培养的心肌细胞,mTG-GA水凝胶上生长的心肌细胞不仅保持了良好的细胞活力,而且具有相当的心肌细胞表型和更高的特征蛋白表达。结论mTG交联明胶水凝胶具有高细胞相容性,适合作为心肌细胞体外培养材料,用于工程化心肌组织构建和其他心肌组织工程应用。

微生物转谷氨酰胺酶的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究——(Ⅲ)MTGase催化多底物蛋白的聚合特性

采用SDS-PAGE研究并探讨了微生物转谷氨酰胺酶(Microbial Transglutaminase,MTGase)催化二种异源蛋白质的聚合情形,包括β-乳球蛋白(β-LG)/酪蛋白酸钠(SC)、牛血清白蛋白(BSA)/β-LG、BSA/SC、大豆球蛋白(glycinin)/β-LG、glycinin/SC以及glycinin/BSA。指出:①只有那些表面疏水性相仿的蛋白质才有可能聚合交联;②蛋白空间结构位阻也是不同蛋白交联的限制因素之一;③蛋白质的表面疏水性质或空间结构的改变,会影响MTGase的催化异源蛋白质交联的可能性。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究 (I)MTGase催化单底物蛋白质的聚合特性

采用SDS-PAGE结合凝胶成像技术比较了MTGase在还原状态下对酪蛋白酸钠(SC)、牛血清蛋白(BSA)、大豆球蛋白(glycinin)和β-伴豆球蛋白(β-conglycinin)、β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)等单底物蛋白的聚合效率。结果表明MTGase较易催化SC和BSA聚合,其次为大豆球蛋白,而β-伴豆球蛋白、β-LG和α-LA最不易。根据MTGase催化不同单底物蛋白质的聚合速率的差异,对MTGase催化单底物蛋白质的聚合特性进行了探讨,指出:①底物蛋白的分子结构对MTGase催化活性的重要性;②蛋白质表面疏水度对MTGase催化活性的重要性;③对蛋白质进行一定的预处理可增强MTGase对蛋白质(特别是球蛋白)的催化活性。

加工条件对微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)酶促豆腐凝胶质构性质的影响

采用质构与流变分析方法,研究了微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)酶促豆腐凝胶的物理性质。探讨了温度、pH值、酶浓度与豆浆热处理条件对酶促豆腐质构性质的影响,结果表明,1.温度为37℃,pH6.38时有利于形成较好的豆腐凝胶;2.固定加热温度和热处理时间不变(95℃,5min),豆浆的最佳加热速率为6.3℃/min;3.固定加热速率和热处理温度不变(95℃,6.3℃/min),豆浆热处理时间不同,酶促豆腐凝胶的硬度达到最大值所需的酶浓度也不相同,当豆浆热处理5min,酶与豆浆比至少须100U∶100ml,而当热处理15min(20min),酶与豆浆比只需40U∶100ml。

糯麦粉及转谷氨酰胺酶(TGase)在冷冻糯性糕团中的应用

以糯米粉和含10%(以粉质量计)糯麦粉的糯米-糯麦组合粉为研究对象,在研究不同添加量(0、0.5%、1%,以粉质量计)转谷氨酰胺酶(TGase)对其糊化特性影响的基础上,探讨TGase对这2种不同体系制得的糯性糕团样品所产生的影响,并对含TGase的糕团样品的冻藏特性进行研究。结果表明:与糯米粉相比,添加10%糯麦粉会使得组合粉的峰值黏度、低谷黏度和最终黏度相对降低。而经TGase处理后,组合粉的峰值黏度和最终黏度分别增加了15.19%和15.23%。在糯米粉中混入糯麦粉可降低糯性糕团的硬度,延缓样品老化。而添加TGase,可明显降低糯米粉和糯米-糯麦组合粉制作的糕团的塌陷度。此外,在用糯麦-糯米组合粉制作的糯性糕团中添加1%TGase,可使冻藏6周的糯性糕团仍保持90%的表面完好率。因此,通过糯麦粉和TGase的应用可制得抗老化的、弹性大且冻藏稳定性好的糯性糕团产品。

转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶可食性薄膜的制备

以转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶为基料、丙三醇为增塑剂制备可食性食品包装薄膜。研究了mTG、丙三醇的添加量以及膜的成型方法对产品的抗张强度、最大伸长率、韧性、水溶性、吸水性等物理机械性能的影响;筛选出了最佳工艺条件。

转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶的物理性质研究

用来源于微生物的转谷氨酰胺酶(mTG)对不同品级和不同类型的明胶进行改性,并考察了改性产物的物理性质与酶用量的关系。结果表明:随着酶用量的增加,低强度明胶改性产物的凝胶强度有所提高,而高强度明胶改性产物的凝胶强度保持不变甚至有所降低;所有改性明胶的熔点都随酶用量的增加而提高,有些甚至达到90℃;所有改性产物在60℃时的粘度都随酶用量的增加而提高;改性产物的凝胶温度不仅受酶用量的影响,而且与明胶的品级和种类有关。这一实验结果显示出源自微生物的转谷氨酰胺酶在提高低品级明胶的使用性能及更充分利用制革废弃物等方面都有广阔的应用前景。

转谷氨酰胺酶交联对溶菌酶潜在致敏性的影响

目的 探讨转谷氨酰胺酶催化的交联对鸡蛋过敏原溶菌酶IgG和IgE结合能力的影响,为低敏鸡蛋制品加工提供理论依据和数据支撑。方法 首先利用离子交换层析分离制备溶菌酶纯品。将溶菌酶与转谷氨酰胺酶共孵育后,通过SDS-PAGE观察交联情况,利用兔抗溶菌酶特异性血清验证交联产物IgG结合能力的变化,利用鸡蛋过敏患者血清验证交联产物IgE结合能力,同时确定交联降低溶菌酶致敏性的最适反应条件。结果 转谷氨酰胺酶能够催化溶菌酶发生交联反应,在变换转谷氨酰胺酶添加量和交联时间后,能够形成不同分子量的交联产物。交联后的溶菌酶IgG结合能力显著降低,然而IgE结合能力仅在转谷氨酰胺酶与底物质量比为10 U/g、反应时间为6 h时较未加工溶菌酶降低,最低值下降32%。结论 转谷氨酰胺酶能够催化鸡蛋过敏原溶菌酶发生交联反应,然而交联后产物的IgE结合能力降低结果并不理想。

组织型转谷氨酰胺酶抑制剂对TGF-β_2诱导人LECs表达纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原的影响

目的观察组织型转谷氨酰胺酶(tTG)特异性抑制剂(MDC)对TGF-β2诱导人晶状体上皮细胞(LECs)表达纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)的影响。方法将含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养的LECs株HLE-B3传代后分为5组:无血清培养基培养的HLE-B3为正常对照组;加入10μg/L TGF-β2处理的HLE-B3为TGF-β2组;10μg/L TGF-β2与100、200、400μmol/L MDC共同处理的HLE-B3为不同浓度MDC组。用半定量RT-PCR检测tTG、FN、Col-Ⅳ在HLE-B3中的表达,计算A(tTG/β-actin)、A(FN/β-actin)、A(Col-Ⅳ/β-actin)值。结果正常体外培养的HLE-B3中可表达一定量的tTG、FN及Col-Ⅳ。与正常对照组相比,10μg/L TGF-β2组中tTG、FN、Col-Ⅳ的表达明显增加(t=33.95,P<0.01;t=38.24,P<0.01;t=13.48,P<0.01);与TGF-β2组相比,100、200、400μmol/L MDC组中FN和Col-Ⅳ的表达明显减少(P<0.01)。100、200、400μmol/L MDC组各组间FN和Col-Ⅳ的表达差异均有统计学意义(P<0.01)。结论MDC可剂量依赖性地抑制TGF-β2诱导的LECs中FN、Col-Ⅳ表达的增加。tTG可促进人LECs表达FN、Col-Ⅳ,并参与后囊膜混浊(PCO)的形成。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的蛋白质底物催化特性及其催化机理研究——(Ⅱ)MTGase催化球状蛋白质的聚合机理

首次提出微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)催化球状蛋白质的催化机理,同时显示MTGase聚合球蛋白存在一个“诱导期”,在该阶段底物蛋白的构象发生一定的变化,后者提高了MTGase对它们的催化活性。以β-乳球蛋白为例,采用紫外光谱(UVspectrum)和红外光谱(FT-IRspectrum)证实了MTGase催化球状蛋白,确实致使后者的空间结构发生了明显的变化。该论文所提出的MTGase催化球蛋白的聚合机理在一定程度上解释了MTGase改性蛋白质的机制,也为MTGase的进一步应用研究提供了理论指导。

微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)的AOT反胶束纯化研究

研究微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)反胶束纯化的工艺和条件,调节MTGase离心上清液等电点,除去部分杂蛋白,MTGase活力升高7.5倍;用截留分子量为10000的超滤膜除去小分子杂蛋白,MTGase活力升高1.33倍;用0.05mol/L的AOT/异辛烷反胶束进一步纯化MTGase,其最适萃取条件是粗MTGase蛋白质浓度20mg/mL,[Na+]0.12mol/L,水相pH4.80～5.20,相比1:1(v/v);荷载MTGase的AOT反胶束用2.0mol/LKCl进行反萃取,MTGase活力为14.2U/g,纯化8.875倍;冷冻干燥脱盐反萃取液,获得MTGase冻干粉,其活力为110.3U/g,与粗酶液相比较,纯化689.4倍。经过AOT/异辛烷反胶束萃取纯化的MTGase,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为一条带。Ca2+与表面活性剂非极性尾上丁二酰羰基氧、极性头磺酸基硫氧基氧及MTGase分子表面具有孤电子对的基团的配位结合放大了AOT反胶束的另一种萃取作用——配位萃取,致使其对MTGase的萃取率高于K+而接近Na+。

转谷氨酰胺酶TGase对羊毛的吸附性分析

转谷氨酰胺酶TGase对羊毛的催化转移反应是一个固液多相反应,羊毛纤维对TGase的可及性是促成酶催化的关键.通过考马斯亮蓝比色法分析了TGase在羊毛纤维底物上的吸附性能.结果表明,随着TGase用量的增加、处理温度的提高、处理液酸碱性的增强及浴比的增大,TGase在羊毛上的吸附率不断增加;经振荡处理,TGase与羊毛之间的吸附作用最大,超声波次之;预处理提高了TGase对羊毛的吸附,其中等离子预处理使吸附率大幅提高.

转谷氨酰胺酶TGase催化外源蛋白对羊毛的外接枝改性

选用羊毛水解蛋白、丝素水解蛋白、丝胶等作为外源蛋白,通过TGase的催化作用,对羊毛纤维进行外接枝改性.结果表明:TGase与羊毛水解蛋白、丝素水解蛋白、丝胶协同整理羊毛织物,降低了羊毛织物的毡缩率,提高了抗皱性和强力.

粘虫谷氨酰胺转胺酶(MsTGase)活力测定条件的正交优化及其在幼虫体内的分布

【目的】本研究旨在优化Grossowicz氧肟酸比色法测定粘虫Mythimna separata谷氨酰胺转胺酶(Ms TGase)活力的组合条件,以Ms TGase酶活力为依据分析其在不同龄期幼虫体内的分布规律。【方法】取4龄粘虫幼虫,通过组织匀浆和沉析纯化制备Ms TGase,采用Grossowicz比色法测定Ms TGase酶活力,并对Grossowicz比色法的多重实验因素进行正交优化,进一步结合差速离心法分析不同龄期幼虫体内和亚细胞组分(细胞核和细胞碎片,线粒体,微粒体以及胞质溶胶)中Ms TGase酶活力。【结果】结果表明,酶浓度、底物浓度、反应体系pH值、反应温度及钙离子浓度等实验因素都对Ms TGase酶活力测定结果产生显著影响,其影响大小顺序为:酶浓度>温度> p H>底物浓度>Ca2+浓度。Ms TGase酶比活力测定的最优化条件:酶浓度20 mg/m L、底物浓度0. 04 mol/L、反应体系pH值6. 5、测定温度37℃,不添加钙离子。在1-5龄幼虫中以4龄幼虫的Ms TGase酶活力最高,其比活力也显著高于其他龄期的,且在1-5龄幼虫胞质溶胶中Ms TGase酶活力分别占各亚细胞组分酶活力总和的39%,25%,48%,60%和61%。【结论】所获得的最优化条件适用于粘虫Ms TGase酶活力测定。Ms TGase在粘虫体内呈显著的龄期表达特征和亚细胞分布规律。

转谷氨酰胺酶对鳙鱼糜热诱导胶凝特性的影响

以鳙鱼糜为对象,测定添加不同转谷氨酰胺酶(TGase)量的鱼糜在热加工过程中凝胶动态流变特性、胶凝温度、凝胶形成活化能、分子质量分布、凝胶强度和溶解性的变化,以研究TGase对鳙鱼糜热诱导胶凝特性的影响。结果表明:鳙鱼糜在热诱导凝胶形成过程中,其胶凝温度(Tgel)和胶凝活化能(Ea)随着TGase添加量的增大而降低,而溶解度和肌球蛋白重链(MHC)条带百分比随着TGase添加量的增大而降低后趋于稳定。添加TGase可降低鱼糜发生胶凝所需的能垒,使MHC之间更易形成ε-(γ-谷氨酰)赖氨酸共价键。而鱼糜凝胶的破断强度、凝胶强度、持水性和储能模量(G′)则随TGase添加量的增加呈现先上升后下降的趋势,当TGase添加量为28.08U/100g鱼糜时,其凝胶强度最高、失水率最小。与对照组相比,添加TGase 28.08U/100g鱼糜的鳙鱼糜凝胶强度提高2.7倍,失水率减少46%,G′提高2.5倍。当TGase添加量超过28.08U/100g鱼糜,鳙鱼糜凝胶的G′、破断强度、凝胶强度和持水性下降。适当添加TGase可降低Ea和Tgel,明显提高鳙鱼糜的凝胶强度和持水性。

转谷氨酰胺酶对鳙鱼鱼糜凝胶特性的影响

研究了不同浓度的转谷氨酰胺酶 (简称TGase)对鳙鱼鱼糜凝胶特性的影响。结果表明 ,在鳙鱼鱼糜中添加不同浓度的TGase ,均可使其凝胶的破断强度、凹陷深度、凝胶强度及持水性增加 ,而对其颜色、白度无影响 ;酶的最佳浓度为 0 5 % ,在此浓度下 ,鱼糜的凝胶强度为 2 13 0 9g·cm ,是对照样的 4倍多 ;通过对SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳及溶解度的分析表明 ,TGase可催化鳙鱼鱼糜中的肌球蛋白重链 (MHC)形成共价交联键。电镜分析则表明 ,TGase的加入可使鳙鱼鱼糜形成致密。

磷酸盐和转谷氨酰胺酶对鸡肉肠出品率和硬度的影响

本文主要研究了焦磷酸钠(SPP)、三聚磷酸钠(STP)和六偏磷酸钠(SHMP)对鸡肉肠出品率的影响,并采用L9(34)正交试验设计确定了鸡肉肠中添加复合磷酸盐的最佳配比;通过复合磷酸盐(0.2%、0.3%、0.4%)与转谷氨酰胺酶(0.4%、0.6%、0.8%)析因实验,分析了复合磷酸盐与转谷氨酰胺酶对鸡肉肠质构特性的影响。结果显示,复合磷酸盐的最优配比为STP:SPP:SHMP为4:2:3;复合磷酸盐能显著提高鸡肉肠出品率;转谷氨酰胺酶能显著提高鸡肉肠硬度;二者之间对肉制品出品率及硬度均无显著性交互作用。

微生物转谷氨酰胺酶催化大豆11S球蛋白聚合研究

研究了微生物转谷氨酰胺酶(MtGase)催化大豆11S球蛋白的聚合反应条件。研究显示,TGase对11S的不同亚基反应不一样,它只能催化11S酸性亚基聚合,而碱性亚基几乎不受影响。离子强度Ⅰ=0.1时TGase催化活性要高于Ⅰ=0.5,这可能是酶活性受离子强度的影响。酶浓度范围为10～40U/g对TGase催化11S酸性亚基影响不大。TGase催化11S聚合的最适pH为7.0～8.0,pH过高或过低都不利于该酶反应。而在低于50℃范围内,温度越高TGase催化11S聚合越快达到平衡,37℃反应4h与50℃反应2h聚合效果差不多,而60℃已使TGase几乎完全失活。

转谷氨酰胺酶对蛋白质凝胶性能的影响

本文研究了转谷氨酰胺酶浓度、反应温度、pH、时间对非肉蛋白质凝胶硬度的影响。结果表明转谷氨酰胺酶添加浓度在10～40U/g蛋白质,反应温度4～60℃,pH6～7,反应时间50～300min范围内,对于大豆分离蛋白、酪蛋白、乳清浓缩蛋白、卵清蛋白、明胶蛋白5种非肉蛋白质作用,均可以获得蛋白质凝胶能力以及凝胶性能的提高,表现在形成凝胶蛋白质极限浓度的降低以及凝胶硬度的提高。