基于转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶的心肌细胞体外培养

目的研究微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,mTG)交联明胶水凝胶对新生大鼠心肌细胞活力和增殖的影响,并探究该水凝胶在心肌组织工程应用中的适用性。方法采用微生物转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶作为基质材料,进行新生大鼠心肌细胞的体外培养。通过倒置光学显微镜观测心肌细胞生长状况,并选取培养一周内的心肌细胞进行细胞相容性评估:采用钙绿黄素-AM/碘化丙啶进行活/死染色,表征了在明胶水凝胶表面培养的心肌细胞的细胞活性;采用MTT法分析细胞在水凝胶表面的增殖情况。使用DAPI和心肌细胞标志蛋白cTnI、cTnT免疫荧光染色法,检测体外培养的心肌细胞在明胶水凝胶基底上的心肌源性和成熟状态。结果在37℃下加入mTG溶液的明胶快速凝胶,接种后的心肌细胞在4 h内完全粘附。明场下可清楚观测到心肌细胞的增殖和随时间逐渐同步的自发搏动行为。活/死染色和MTT测定结果显示,mTG-GA水凝胶上心肌细胞具有良好的活性,并保持了相当的增殖潜力。cTnI和cTnT荧光染色结果说明,相较于培养板上传统培养的心肌细胞,mTG-GA水凝胶上生长的心肌细胞不仅保持了良好的细胞活力,而且具有相当的心肌细胞表型和更高的特征蛋白表达。结论mTG交联明胶水凝胶具有高细胞相容性,适合作为心肌细胞体外培养材料,用于工程化心肌组织构建和其他心肌组织工程应用。

基于转谷氨酰胺酶交联明胶水凝胶的脂肪干细胞培养研究

目的构建转谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase，mTG）交联明胶水凝胶的脂肪干细胞（adipose—derived stemcells，ADSCs）三维培养体系，观察ADSCs在该水凝胶中生长情况。方法取SD大鼠腹股沟皮下脂肪组织，采用胶原酶消化及离心分离获取ADSCs，并培养传代。定量称取明胶及mTG，分别置于PBS中溶解后，按照一定比例混匀制备mTG交联明胶水凝胶。取P3～P4代ADSCs分别于水凝胶表面二维培养及包埋于水凝胶中进行三维培养。培养期间，采用倒置相差显微镜观察ADSCs的生长形态，并进行HE染色和Masson染色，观察细胞在材料中的分布形态；采用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察ADSCs在材料中存活状况；扫描电镜观察ADSCs在水凝胶表面黏附性；采用Alamar—Blue法检测ADSCs在水凝胶中增殖情况，以培养皿中常规培养细胞作为对照。结果二维培养观察示，ADSCs在水凝胶表面生长良好、细胞功能正常，贴壁良好。三维培养观察示，ADSCs在mTG交联明胶水凝胶中生长良好，呈三维立体形态，细胞向各方向伸展；细胞死活染色显示凋亡细胞非常少。各时间点三维培养的细胞数量显著低于常规培养细胞，比较差异有统计学意义（P〈0．05）；但第8天开始，三维培养的细胞增殖明显加快，但常规培养细胞增殖开始减慢。结论基于mTG交联明胶水凝胶三维培养的ADSCs黏附性强，生长状况良好，成活率高。

肌原纤维蛋白转谷氨酰胺酶交联程度对鱼糜凝胶及其风味释放影响的研究进展

转谷氨酰胺酶可以催化肌原纤维蛋白发生交联反应。随着交联程度的增加,鱼糜凝胶从弹黏体变为弹脆体,风味也随之改变。风味物质的扩散、释放与凝胶网络的交联程度密切相关,因此深入了解交联程度与食品品质的关系及风味物质在凝胶网络中的扩散行为显得尤为重要。本文总结转谷氨酰胺酶催化肌原纤维蛋白的交联机理,归纳了国内外对肌原纤维蛋白交联程郭彩霞度的测定方法与影响因素,探讨交联程度对鱼糜蛋白的凝胶特性与风味释放的影响,并对今后的研究方向提出思考与展望。

转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶可食性薄膜的制备

以转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶为基料、丙三醇为增塑剂制备可食性食品包装薄膜。研究了mTG、丙三醇的添加量以及膜的成型方法对产品的抗张强度、最大伸长率、韧性、水溶性、吸水性等物理机械性能的影响;筛选出了最佳工艺条件。

转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶的物理性质研究

用来源于微生物的转谷氨酰胺酶(mTG)对不同品级和不同类型的明胶进行改性,并考察了改性产物的物理性质与酶用量的关系。结果表明:随着酶用量的增加,低强度明胶改性产物的凝胶强度有所提高,而高强度明胶改性产物的凝胶强度保持不变甚至有所降低;所有改性明胶的熔点都随酶用量的增加而提高,有些甚至达到90℃;所有改性产物在60℃时的粘度都随酶用量的增加而提高;改性产物的凝胶温度不仅受酶用量的影响,而且与明胶的品级和种类有关。这一实验结果显示出源自微生物的转谷氨酰胺酶在提高低品级明胶的使用性能及更充分利用制革废弃物等方面都有广阔的应用前景。

转谷氨酰胺酶交联大豆分离蛋白结构表征

为研究转谷氨酰胺酶(transglutaminase,TGase)交联大豆分离蛋白(soy protein isolate,SPI)对SPI分子结构的影响,采用差示扫描量热仪、扫描电镜、X-射线衍射、红外光谱、圆二色谱等对TGase交联SPI前后二级结构的变化进行分析。结果表明:交联后SPI表面疏水性增强,自由氨基含量降低,结构和微观晶体结构均发生变化,结构由球形结构变成凹陷孔状,多肽链充分伸展,空间结构改变,结晶度降低;β-折叠含量升高,有序度更高,无规卷曲结构含量相对较低;利用氨基酸全自动分析仪测定氨基酸含量,交联后必需氨基酸含量提高了5.5%,疏水性氨基酸含量提高了14.5%,表明交联后提高了SPI营养价值,改善SPI的表面疏水性。

转谷氨酰胺酶交联作用对乳蛋白功能特性的影响

转谷氨酰胺酶可用于蛋白交联,改性蛋白质的组织结构和功能特性,在食品工业中具有广阔的应用前景。本文介绍了转谷氨酰胺酶的作用机制、对乳蛋白功能特性的影响以及在酸奶生产中的应用等。

转谷氨酰胺酶改性对明胶耐酶解性的影响

以转谷氨酰胺酶改性明胶的耐酶解性为关注点,通过单因素试验和均匀设计试验研究转谷氨酰胺酶浓度、改性pH值、改性温度和改性时间等因素对改性明胶耐酶解性的影响。通过均匀试验得到的最优改性条件为:转谷氨酰胺酶质量浓度为0.20 g/L,改性pH 6.0,改性温度44℃,改性时间35 min。与未改性明胶相比较,改性明胶的耐酶解能力提高了14.44%。本研究结果表明转谷氨酰胺酶改性可以显著提高明胶的耐酶解能力。

变性对转谷氨酰胺酶在乳蛋白间交联影响初探

利用SDS-PAGE电泳结合凝胶成像分析技术,比较了在非变性、加入还原剂变性和加热后再加入还原剂变性三种条件下转谷氨酰胺酶对酪蛋白和乳清蛋白之间的交联情况。结果表明:在非变性条件下,酪蛋白质量分数下降96%,乳清蛋白下降15%,酪蛋白和乳清蛋白几乎不能交联,超分子量聚合物是酪蛋白单一聚合物,α乳白蛋白形成部分低聚体;在加入还原剂时,酪蛋白质量分数下降86%,乳清蛋白下降30%,反应4h后有少量乳清蛋白和酪蛋白中某一组分交联;预热更有助于酪蛋白和乳清蛋白聚合,在第三种条件下,反应24h后乳清蛋白下降60%。

转谷氨酰胺酶交联酶晶体的制备及其酶学性质研究

对转谷氨酰胺酶晶体进行了交联,研究了交联酶的基本酶学性质。结果表明,交联后,酶的耐高温性增强,在酸性、碱性条件下均比原酶更稳定,具有明显抵抗Fe3+、Zn2+及Cu2+的能力,而Ca2+、Mg2+及Ba2+对交联酶晶体没有明显的影响,在有机溶剂中的酶活力损失较小。与游离酶相比较,交联酶晶体在常温下贮存15d后的酶活力保留80%以上,远远地大于游离酶的剩余酶活。

转谷氨酰胺酶改性明胶高强度薄膜的制备

在研究制备转谷氨酰胺酶(mTG)改性明胶可食性薄膜工作的基础上,通过在成型工艺中进一步采用室温干燥和湿态二次定向处理的方法,获得了抗张强度达18.3MPa,韧度达8.4J/cm2的可食性明胶薄膜。在配料中添加质量分数2%的聚乙烯醇(PVA)并采用相同的成型工艺,所制备明胶薄膜的机械性能得到进一步提高。生物降解性实验表明,在被质量分数0.5%的Al-calase碱性蛋白酶作用4h后,不含PVA的可食性明胶薄膜的降解率可达99.2%,含PVA明胶薄膜的降解率也达到了97.5%。

转谷氨酰胺酶为交联剂固定化漆酶及其在苹果汁澄清中的应用

果汁中残留的多酚类物质会造成其在贮藏期间的混浊,影响产品的质量,采用漆酶处理可以有效地解决这一难题。该文以AB-8大孔吸附树脂为载体,转谷氨酰胺酶为交联剂对漆酶进行固定化,研究了固定化酶的制备条件、酶学性质以及对苹果汁的澄清作用。结果表明,当吸附pH值4.0、吸附温度30℃、吸附时间4 h、漆酶的用量为10 mL/g树脂;转谷氨酰胺酶用量为200 U/g树脂、交联pH值4.0、交联温度30℃、交联时间2 h时,所制备的固定化酶酶活力为210 U/g,酶活力回收率为82.5%,固定化漆酶对苹果汁的总酚去除率达到78.1%。果汁贮藏14 d后,没有经过酶处理的苹果汁的浊度上升20多倍,而经过固定化酶处理后的苹果汁浊度仅上升1倍多,果汁基本保持澄清。该研究为食品加工行业提供了一种有效地保持果汁澄清的新方法,具有实际应用价值。

转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶构建三维角膜基质

目的检测转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶对三维培养的角膜基质细胞的影响,探讨可提高机械性能的组织工程角膜基质层新途径。方法胶原酶消化法获取原代兔角膜基质细胞,以加入转谷氨酰胺酶与胶原凝胶交联为实验组,不加酶交联为对照组。倒置显微镜下每日观察细胞生长情况、Alamar-Blue试剂检测细胞增生、免疫荧光法检测凝胶内细胞波形蛋白、检测透光度、酶消化法检测胶原凝胶抗消化能力。结果实验组细胞胶原凝胶内附着和生长优于对照组,细胞在凝胶内呈树枝状生长。2组细胞均随培养时间延长明显增生(P=0.000)。共焦显微镜下见2组细胞胞浆波形蛋白均阳性表达,实验组细胞伪足更丰富。实验组透光度稍差于对照组。实验组抵抗胶原酶消化的能力显著增强。结论酶交联的胶原凝胶对角膜基质细胞无毒性作用,重构的基质层结构更加稳定,有利于组织工程角膜基质层的构建。

采用激光光散射技术研究转谷氨酰胺酶催化的β-乳球蛋白交联反应

采用体积排阻色谱(SEC)联合多角度激光光散射法(MALLS)技术研究了由微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)诱导的β-乳球蛋白的体外交联反应。结果表明,在20mM二硫苏糖醇(DTT)的存在时,用MTGase处理大约11h,会逐渐形成高分子量的高聚物或寡聚体,同时β-乳球蛋白会由二聚体向单体转变。在DTT不存在时,同样有这种转变。上述结果表明,MTGase处理可作为一种很有潜力的技术,可于调控许多球蛋白的热稳定性。

超声处理对转谷氨酰胺酶交联乳清分离蛋白的结构特性和凝胶保水性的影响

本文研究了超声处理(20 k Hz,400 W,0、10、20、30、40 min)对转谷氨酰胺酶(TGase)交联乳清分离蛋白(WPI)的分子量分布、粒径分布、荧光强度、表面疏水性和凝胶保水性的影响。结果表明,TGase交联WPI后生成了分子量约为120 k Da的大分子聚合物,且聚合物的量随着超声处理时间的增加而逐渐增加; TGase交联WPI后的荧光强度高于未交联的WPI,且荧光强度随着超声处理时间的增加而增大; TGase交联后WPI的表面疏水性增大,且随着超声处理时间的延长,表面疏水性逐渐升高。此外,WPI的粒径随着超声处理而减小,但TGase交联后WPI的粒径明显高于未交联的WPI。TGase交联后WPI的凝胶保水性呈上升趋势,并且随着超声时间的延长而逐渐升高。因此,TGase交联WPI可以改变WPI的结构,增强其凝胶保水性。

谷氨酰胺转移酶对明胶纺丝原液及其纤维的影响

本论文通过向明胶纺丝原液中添加谷氨酰胺转移酶(TG酶)的方法,制备了环保型明胶纤维,研究了TG酶添加量对明胶纺丝原液及其纤维结构和性能的影响。红外光谱测试结果表明TG酶与明胶分子氨基发生了交联反应;流变结果表明加入TG酶后明胶溶液粘度明显增加;SEM结果表明加入TG酶所制得的纤维结构较为致密;热重分析结果表明TG酶的加入使得明胶热稳定性提高。

基于转谷氨酰胺酶交联胶原凝胶的结构与性能研究

采用微生物来源的转谷氨酰胺酶(MTG)对胶原凝胶进行交联改性,考察不同浓度的MTG(0.02~0.28U/mL)对胶原凝胶结构和性能的影响,通过测量比较胶原凝胶的外观、红外光谱图、耐热稳定性、耐体外酶解能力、凝胶强度、吸水膨胀率,来表征改性前后胶原凝胶结构和性能的变化。结果表明:当MTG浓度为0.04U/mL时,改性后胶原凝胶的性能最优。改性后的凝胶外观变化不明显,红外光谱分析表明胶原的三股螺旋结构未被破坏。当MTG浓度为0.04U/mL时,比未改性的样品的耐热分解能力提高了11.79%,抗体外酶降解率提高了10.21%、凝胶强度提高了324g,吸水膨胀率提高了1.65×103%,热变性温度略有增加。

转谷氨酰胺酶交联对食物蛋白改性作用的研究进展

简要介绍转谷氨酰胺酶来源、性质以及在食品工业中的应用,重点阐述了转谷氨酰胺酶交联蛋白的最新国内外研究动态。

转谷氨酰胺酶催化的花生过敏原Ara h 2交联反应位点分析

酶催化交联是蛋白质改性的常用加工手段,交联方式和交联位点不同,对蛋白质性质的影响也不同。采用转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase,MTG)催化Ara h 2发生交联反应。通过液相-质谱联用对交联后的蛋白产物进行分析,再利用StavroX软件分析质谱数据,寻找不同反应条件下,蛋白质交联反应的发生位点。结果显示,在MTG的催化下,K142、K52均参与交联反应。还原后的Ara h 2的交联反应较未还原蛋白更为活跃,未还原蛋白中仅发现3对分子内交联肽段,而还原后的蛋白中找到16对交联肽段(既包括分子内交联也包括分子间交联),但还原蛋白中仅K142参与了分子内交联反应。研究揭示的Ara h 2交联方式和交联位点,为交联反应对蛋白质改性机制研究奠定了基础。

微生物转谷氨酰胺酶诱导下鲢鱼糜凝胶的结构演化规律

以鲢鱼糜为对象,通过检测微生物转谷氨酰胺酶（microbial transglutaminase,MTGase）诱导下不同凝胶化时间形成的鱼糜凝胶的质地特性、交联程度及网络微观结构,探讨鲢鱼糜凝胶的结构演化规律。力学特性结果表明,未添加MTGase（对照组）的鱼糜凝胶的破断力、凹陷深度、硬度、咀嚼性等随凝胶化时间延长显著增大（P〈0.05）,破断力在3~6 h达到平衡（约1 100 g）,凹陷深度在1~2 h达到最大值（约17 mm）,随着凝胶时间延长呈下降趋势;添加MTGase的鱼糜凝胶破断力在3 h时就达到最大值（P〈0.05）,硬度和咀嚼性随时间增加到3 h后趋于平衡,凹陷深度随时间延长逐渐降低（P〈0.05）。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）结果显示,鲢鱼糜凝胶中肌球蛋白重链含量随凝胶化时间延长显著下降,添加MTGase组肌球蛋白重链含量明显低于对照组。两组鱼糜凝胶的网络孔隙当量直径均随凝胶化时间延长先减小后增大,在3 h时分别达到最致密的网络结构（P〈0.05）。对照组和添加MTGase的鲢鱼糜凝胶分别在40℃凝胶化3~6 h或2~4 h时凝胶特性较好,通过凝胶化时间的调节可控制鱼糜凝胶的结构演化方向,获得高品质鱼糜制品。