谷氨酰胺酶2对肝内胆管细胞癌细胞增殖和侵袭能力的影响及机制

目的探讨谷氨酰胺酶2(GLS2)对肝内胆管细胞癌细胞增殖和侵袭能力的影响及其机制。方法将对数生长期人肝内胆管细胞癌RBE细胞随机分为空白对照组(Con组)、GLS2过表达阴性对照组(pcDNA-NC组)、pcDNA-GLS2组和pcDNA-GLS2+磷酸化蛋白酪氨酸激酶(p-JAK)组。Con组RBE细胞不转染任何质粒,pcDNA-NC组RBE细胞转染pcDNA-NC质粒,pcDNA-GLS2组RBE细胞转染pcDNA-GLS2质粒,pcDNA-GLS2+p-JAK组RBE细胞转染pcDNA-GLS2质粒并和p-JAK多肽共培养。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞中GLS2 mRNA的相对表达量,细胞计数试剂盒-8检测各组细胞增殖能力,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Transwell小室实验检测各组细胞侵袭能力,Western blot法检测细胞中蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)、p-JAK2、信号转导子与转录激活子3(STAT3)、磷酸化信号转导子与转录激活子3(p-STAT3)蛋白相对表达量。结果pcDNA-GLS2组细胞中GLS2 mRNA的相对表达量显著高于Con组和pcDNA-NC组(P<0.05);pcDNA-GLS2+p-JAK组细胞中GLS2 mRNA的相对表达量显著低于pcDNA-GLS2组(P<0.05)。pcDNA-GLS2组细胞存活率显著低于Con组(P<0.05);与pcDNA-GLS2组相比,pcDNA-GLS2+p-JAK组细胞存活率显著增加(P<0.05)。与Con组相比,pcDNA-GLS2组细胞凋亡率显著增加(P<0.05);pcDNA-GLS2+p-JAK组细胞凋亡率显著低于pcDNA-GLS2组(P<0.05)。pcDNA-GLS2组细胞迁移数显著低于Con组(P<0.05);与pcDNA-GLS2组相比,pcDNA-GLS2+p-JAK组细胞迁移数显著增加(P<0.05)。与Con组相比,pcDNA-GLS2组细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著降低(P<0.05);pcDNA-GLS2+p-JAK组细胞中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3比值显著高于pcDNA-GLS2组(P<0.05)。结论过表达GLS2可通过抑制JAK2/STAT3信号通路调控肝内胆管癌细胞生物学活性,抑制肝内胆管癌RBE细胞增殖、侵袭、迁移能力,诱导细胞凋亡。

转谷氨酰胺酶3(TGM3)促进肝细胞肝癌(HCC)增殖侵袭的潜在机制及其临床意义

目的研究转谷氨酰胺酶3(transglutaminase 3,TGM3)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生、发展过程中的作用及其预测HCC预后的临床价值。方法收集复旦大学附属中山医院HCC患者标本和临床资料进行分析,用qRT-PCR和Western blot方法检测28例HCC患者癌和癌旁TGM3表达差异,利用组织芯片染色结果及临床随访资料对92例HCC患者行Kaplan-Meier及Cox回归分析,探究TGM3不同表达水平对患者预后的影响。shRNA下调HCC细胞系Huh7和97H的TGM3表达水平,利用CCK-8法、克隆形成实验、Transwell小室实验、裸鼠皮下成瘤实验分析干扰后细胞增殖、迁移、侵袭及皮下成瘤能力的变化,Westernblot检测PI3K/AKT、MAPK/EPK、NF-κB信号通路、上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)及凋亡相关蛋白的变化。结果TGM3在HCC中高表达,Kaplan-Meier生存分析表明TGM3高表达组的中位复发时间和中位生存期均较低表达组显著缩短(15.00个月vs.49.25个月,P<0.05;38.63个月vs.未达到;P<0.05);多因素Cox回归分析发现TGM3表达水平是HCC患者术后复发和死亡的独立预后因素(HR=2.31,P=0.029;HR=2.78,P=0.009)。体内外实验表明TGM3表达下调可以抑制HCC细胞的增殖、侵袭及皮下成瘤能力。TGM3下调使AKT、ERK、p65蛋白磷酸化水平降低,cleavedcaspase3水平增高,EMT相关指标E-钙黏素表达增加,N-钙黏素、纤维连接蛋白及波形蛋白表达下降。结论TGM3可能通过影响多条信号通路和EMT过程促进HCC的增殖和侵袭,并可作为HCC患者潜在的预后指标及治疗靶点。

丙胺酰谷氨酰胺注射液对食管癌术后患者半乳糖凝集素-3、D-二聚体及环氧合酶-2的影响分析

目的分析丙胺酰谷氨酰胺注射液对食管癌术后患者半乳糖凝集素-3、D-二聚体及环氧合酶-2的影响。方法选择进行食管癌手术的患者148例,随机分为观察组和对照组,采用不同的营养方法,记录2组患者治疗前后的Gal-3,DD、COX-2水平和IgG、IgA、IgM。结果治疗前,2组患者的Gal-3(t=0.288)、DD(t=0.137)、COX-2(t=0.292)水平比较,P均>0.05,差异均无统计学意义。治疗后,2组患者的Gal-3(t=3.847)、DD(t=6.938)、COX-2(t=5.635)水平比较,P均<0.05,差异均具有统计学意义。2组患者治疗后Gal-3、DD、COX-2水平均较治疗前降低,但观察组较对照组降低程度高。治疗前,2组患者的IgG(t=0.109)、IgA(t=0.392)、IgM(t=0.112)水平比较,P均>0.05,差异均无统计学意义。治疗后,2组患者的IgG(t=4.762)、IgA(t=3.727)、IgM(t=3.822)水平比较,P均<0.05,差异均具有统计学意义。2组患者治疗后IgG较治疗前升高,IgA、IgM水平均较治疗前降低,且观察组较对照组变化程度高。结论丙胺酰谷氨酰胺注射液可改善食管癌患者术后体液免疫状况,而且治疗后可显著降低患者的Gal-3、DD、COX-2水平,因此其可用于食管癌患者术后营养治疗。

甲基化转移酶3对食管癌细胞增殖、迁移及谷氨酰胺代谢的影响

目的探讨甲基化转移酶3(methyltransferase like-3,METTL3)在食管癌中的表达及其对细胞增殖、凋亡、迁移和谷氨酰胺代谢的影响。方法采用qRT-PCR、Western blot和免疫组化法检测食管癌组织及其癌旁组织中METTL3基因的表达;CCK8试验、克隆形成试验、划痕试验和Transwell试验检测METTL3抑制剂STM2457对人食管鳞状癌细胞系Eca109和KYSE150增殖及迁移的影响;流式细胞术、TUNEL染色试验检测其对细胞周期及凋亡的影响;TMT/iTRAQ定量蛋白质组法分析其对下游相关信号通路的影响;谷氨酰胺和谷氨酸检测试验及Western blot法分析其对食管癌细胞谷氨酰胺代谢的影响。结果METTL3在食管癌组织中的表达显著上调(t=5.024,P<0.0001)。STM2457抑制Eca109和KYSE150细胞的METTL3表达后,显著抑制了细胞的增殖及迁移能力,细胞周期在G0/G1期发生阻滞,细胞凋亡率增加,同时降低了谷氨酰胺摄取量和谷氨酸生成量,并下调了谷氨酰胺代谢相关蛋白丙氨酸-丝氨酸-半胱氨酸转运载体2(alanine-serine-cysteine transporter 2,ASCT2)、谷氨酰胺酶(glutaminase,GLS)和谷氨酸脱氢酶1(glutamate dehydrogenase 1,GLUD1)的表达。METTL3敲低后,Eca109和KYSE150细胞中谷氨酰胺摄取量和谷氨酸生成量显著降低(谷氨酰胺摄取量:t为24.52~41.01,P均<0.01;谷氨酸生成量:t为8.431~11.83,P均<0.01);METTL3过表达后,Eca109和KYSE150细胞中谷氨酰胺摄取量和谷氨酸生成量显著升高(谷氨酰胺摄取量:t分别为5.803和56.13,P均<0.01;谷氨酸生成量:t分别为11.06和4.695;P均<0.01)。METTL3敲低后,Eca109和KYSE150细胞中谷氨酰胺代谢相关蛋白ASCT2、GLS和GLUD1表达水平显著下调,而METTL3过表达后,ASCT2、GLS和GLUD1蛋白表达水平显著上调。结论METTL3在食管癌中高表达,并可能通过介导食管癌细胞谷氨酰胺代谢促进细胞增殖。

甘油-3磷酸转酰酶氨基酸与植物抗冷性关系初探

甘油 - 3磷酸转酰酶 (GPAT)与植物抗冷性密切相关。南瓜 (Cucurbitamoschata)与黑子南瓜 (Cucurbitaficifolia)同属不同种 ,亲缘关系较近 ,但却存在显著的抗冷性差异。南瓜及黑子南瓜GPAT基因的克隆 ,可以使我们从二者推导的有限氨基酸的差异中对GPAT氨基酸组成及其与植物抗冷性作一定的探讨。发现在南瓜与黑子南瓜 13个不同的氨基酸残基中有 3个与抗冷性植物拟南芥菜 (Arabidopsisthaliana)、豌豆 (Pisumsativum)、红花 (Carthamustincto rius)和菠菜 (Spinaciaoleracea)等相同 ,可能与黑子南瓜比南瓜更具抗冷性的原因有关。比较南瓜、黑子南瓜、豌豆、红花、拟南芥菜和菠菜等植物中GPAT基因推导的氨基酸序列发现 ,在比较抗冷的拟南芥菜、红花、豌豆和菠菜等植物中 ,虽然它们之间的亲缘关系都比较远 ,但某些位点上的氨基酸残基却完全相同 ,而与南瓜等抗冷性较差的植物不同 ,这些位点的氨基酸残基可能也与GPAT对底物酰基的选择性有关。

不同抗冷性水稻中编码甘油-3-磷酸转酰酶的部分cDNA的序列比较研究

采用RT -PCR技术 ,以根据国外报道的几种双子叶植物的甘油 - 3-磷酸转酰酶的相对保守的氨基酸序列而设计的简并引物作为扩增引物 ,从不同抗冷性水稻品种中均扩增到一段约 315bp的cDNA片段。测序结果表明它们都是编码GPAT的部分cDNA ,含有 315个核苷酸 ,编码 10 5个氨基酸。比较它们之间的核苷酸及推导氨基酸序列 ,发现有一定差异 ,且抗冷性相差越大的品种间差异越大。抗冷性的差异可能与脯氨酸的替换有关。

七种不同抗冷性植物甘油-3-磷酸转酰酶m RNA二级结构研究

对南瓜、豌豆、黄瓜、拟南芥菜、红花、菠菜、黑子南瓜等 7种不同抗冷性植物甘油- 3-磷酸酰基转移酶的mRNA序列作了三核苷酸碱基模式分析 ,并用Zuker方法对其mRNA序列的翻译区进行了二级结构分析 ,统计出发夹、内环、膨胀环、三分支环、四分支环等二级结构的基本结构单元数 ,通过对编码脯氨酸的密码子在mRNA二级结构中的分布位置的研究 ,发现这些密码子主要是分布在茎的末端、环的根部、膨胀环或分支环上 ,占到了序列中所有编码脯氨酸的密码子总数的 6 9%到 97%的比例 ,这与我们在研究其他物种的mRNA二级结构时的发现是一致的。

转Bt+CpTI基因棉对烟粉虱种群动态影响及其几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性变化

本研究调查了转Bt+CpTI基因棉SGK321棉田、其亲本常规棉SY321棉田以及间作棉田烟粉虱成虫种群的数量,测定了不同时期SGK321棉与SY321棉叶片中几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的活性及蛋白质的含量。结果表明:在整个生长期间,SGK321棉田烟粉虱的种群数量一直高于SY321棉田和间作棉田。烟粉虱取食的SGK321植株叶片几丁质酶活性呈下降-上升-下降-上升的趋势;SY321上部叶片中呈下降-上升-下降-上升的趋势,其下部叶片为先下降后上升趋势;SGK321叶片中β-1,3-葡聚糖酶活性变化呈下降-上升-下降-上升趋势,而SY321叶片基本上均呈先下降后上升趋势;SY321与SGK321上部叶片中蛋白质相对含量均呈先上升后逐渐下降趋势,下部叶片与上部叶片相似但略有不同。SGK321与SY321处理植株叶片几丁质酶活性之间没有明显差异;SGK321处理植株叶片β-1,3-葡聚糖酶的活性多数时期高于SY321。探讨了棉花防御反应与棉田烟粉虱种群数量差异的相关性,以利于揭示双价抗虫棉对烟粉虱的影响及其生理防御机制,为烟粉虱的综合治理以及棉花育种等提供理论依据。

硫化氢/3-巯基丙酮酸转硫酶在癫痫患者颞叶中的表达

目的探讨硫化氢(H_2S)/3-巯基丙酮酸转硫酶(3-MST)在癫痫患者颞叶中的表达。方法难治性癫痫患者(实验组)外侧颞叶标本15例,高颅压患者(对照组)内减压切除的正常外侧颞叶脑组织标本15例。检测外侧颞叶脑组织中H_2S含量,采用免疫荧光及Western blotting技术检测3-MST表达,观察H_2S/3-MST在癫痫患者外侧颞叶及高颅压患者正常外侧颞叶脑组织中的表达变化。结果实验组外侧颞叶脑组织细胞中H_2S/3-MST表达显著高于对照组,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论在癫痫的病理生理过程中,H_2S/3-MST的高表达可能与其在癫痫中神经保护作用相关。

牛胎儿成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因

为利用核移植法获取转基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛胎儿成纤维细胞并进行了携带线虫ω-3脂肪酸去饱和酶cDNA的表达载体转染。首先采用组织块贴壁法分离培养牛胎儿成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染牛胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2～3次后利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明,组织块贴壁后7天可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9天即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶cDNA整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶mRNA在转基因传代细胞中得到有效转录,为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了基础。

转谷氨酰胺酶3对胃癌发展和预后的影响

目的探讨转谷氨酰胺酶3(TGM3)对胃癌发展和预后的影响。方法收集南通大学附属医院普外科手术治疗的2010年1月至2011年12月的150例及2020年8月10例患者的配对胃癌组织及癌旁组织。采用实时荧光定量聚合酶联反应及免疫组织化学(IHC)检测TGM3在胃癌组织及癌旁组织中的表达水平。分析TGM3蛋白水平与胃癌患者预后的关系。构建TGM3过表达胃癌细胞株,分为空载体组(NC)和TGM3过表达组(TGM3-1、TGM3-2)。利用克隆形成实验、划痕实验和侵袭实验检测TGM3表达对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。将购自南通大学动物中心的12只4周龄雄性BALB/c裸鼠随机分为3组构建皮下瘤模型,组间比较采用t检验。结果荧光定量聚合酶联反应和IHC结果表明胃癌组织中TGM3的mRNA和蛋白表达均显著低于癌旁组织(荧光定量聚合酶联反应:t=7.091 P<0.01;IHC:χ^(2)=7.061,P<0.01)。生存分析表明,TGM3高表达患者的总生存期长于低表达患者(风险比=0.576,95%可信区间=0.367~0.904,P<0.05)。实验证明TGM3升高可显著抑制胃癌细胞增殖(NC:1226.667±12.014;TGM3-1:311.333±7.024,t=113.900,P<0.01;TGM3-2:337.667±10.599,t=96.110,P<0.01)、迁移(NC:0.477±0.031;TGM3-1:0.260±0.028,t=9.016,P<0.01;TGM3-2:0.223±0.007,t=13.720,P<0.01)和侵袭能力(NC:583.667±13.577;TGM3-1:386.000±8.185,t=21.600,P<0.01;TGM3-2:365.333±10.599,t=21.960,P<0.01),以及抑制裸鼠皮下瘤生长[NC:(0.864±0.071)cm^(3);TGM3-1:(0.353±0.027)cm^(3),t=11.630,P<0.01;TGM3-2:(0.256±0.040)cm^(3),t=12.890,P<0.01]。结论TGM3在胃癌中发挥抑癌作用,可作为预测胃癌患者预后的分子标志物和潜在的治疗靶点。

牛耳皮肤成纤维细胞的分离培养及转染线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因研究

为了核移植法制作转线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因克隆牛提供供体细胞,体外分离培养牛耳成纤维细胞并进行了线虫-ω3脂肪酸去饱和酶基因。采用胰蛋白酶消化法分离培养牛耳皮肤成纤维细胞,线虫ω-3脂肪酸去饱和酶基因表达载体以脂质法介导转染细胞,通过G418筛选9 d获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,对阳性克隆进行传代2~3次后,利用RT-PCR检测外源基因的转录。结果表明：细胞贴壁后9 d可获取原代皮肤成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示CMV启动子和ω-3脂肪酸去饱和酶基因整合到细胞基因组中,RT-PCR检测显示ω-3脂肪酸去饱和酶基因在转基因传代细胞中得到有效转录。本研究为下一步通过核移植方法获得转基因肉牛提供了条件。

细胞色素氧化酶P450 3A4基因联合环磷酰胺的体外抗肿瘤效应

目的克隆细胞色素氧化酶P4503A4(CYP3A4)基因,构建真核表达质粒并导入K562细胞进行表达,研究CYP3A4联合环磷酰胺(CPA)的体外抗肿瘤效应。方法利用RT-PCR从人肝细胞中克隆CYP3A4基因,构建重组真核表达载体。脂质体法导入K562细胞,RT-PCR和Western blot检测CYP3A4基因在K562细胞中的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。MTT法检测CYP3A4联合CPA对肿瘤细胞的抑制作用。结果成功克隆CYP3A4基因并构建了真核表达质粒pcDNA3.1/myc-HisA(+)-CYP3A4。RT-PCR和Western blot分别显示转基因组的CYP3A4 mRNA和蛋白质表达水平均显著高于转空载体组和对照组。MTT示转基因组IC50值为1.09016mmol/L,明显低于转空载体组和对照组。酶诱导剂和抑制剂分别能够减低和增高转基因组IC50。结论CYP3A4体外具有联合CPA的抗肿瘤作用,这种作用能够被CYP3A4相应的诱导剂和抑制剂增强或减低。

应用聚合酶链式反应快速特异鉴定假单胞菌和伯克霍尔德氏菌(R)-3-羟基酯酰载酯蛋白-辅酶A转酰基酶基因(英文)

聚羟基脂肪酸酯 (PHA)是一类具有广泛应用前景的可降解生物塑料。因其可以以葡萄糖等廉价底物直接发酵生产PHA而日益受到重视。目前的研究表明在积累中长链PHA的假单胞菌中 ,由phaG基因编码的 (R) 3 羟基酯酰载酯蛋白 辅酶A转酰基酶 (PhaG)起关键作用 ,但目前为止对该蛋白还知之甚少。通过聚合酶链式反应 (PCR)建立了一种快速、特异鉴定phaG基因的方法 ,应用该方法成功地从两株积累不同PHA的假单胞菌Pseudomonasstutzeri 1317和Pseudomonasnitroreducens0 80 2中分别克隆得到phaG基因 ,并在phaG基因突变株PseudomonasputidaPHAGN 2 1中表达成功。同时 ,还首次报道了从非假单胞菌菌株BurkholderiacaryophylliAS 1 2 74 1中鉴定得到phaG基因 ,提示PhaG介导的中长链PHA合成途径作为一种通用的代谢模式在细菌中广泛存在 ,为进一步实现从廉价的非相关底物合成中长链PHA提供了必要的分子生物学基础。

3-巯基丙酮酸转硫酶在非酒精性脂肪性肝病中对脂肪变性的影响研究

目的探讨3-巯基丙酮酸转硫酶(MPST)在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中对脂肪变性的影响。方法取20只C57BL/6小鼠,高脂饮食喂养,建立NAFLD模型,分为观察组和对照组(每组10只)。另以10只小鼠予以正常饮食用来参照NAFLD模型的成功建立。观察组小鼠注射重组腺病毒载体shRNA(AD-shRNA)对肝脏MPST进行干预,对照组小鼠注射重组腺病毒载体(AD-GFP)。小鼠处死后取肝组织进行HE染色,观察肝脏脂肪变性情况,并测定肝组织MPST、固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)、脂肪酸合成酶(FAS)、胱硫醚γ裂解酶(CSE)表达与肝脏中游离脂肪酸(FFA)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、硫化氢(H2S)的含量。结果观察组小鼠肝脏MPST的mRNA表达水平与对照组相比显著下调,FFA、TG、TC含量与对照组相比也显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。对照组小鼠肝脏内弥漫性肝细胞脂肪变性,且出现肝细胞炎性表现;观察组小鼠肝细胞脂肪变性的弥漫性减轻,炎性肝细胞减少。观察组小鼠肝脏SREBP-1、FAS的mRNA表达水平与对照组相比显著下调,CSE的mRNA表达水平及肝组织H2S含量较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 H2S在MPST对脂肪肝的调节过程中起主要介导作用,且与SREBP-1相关通路抑制有关。

喉癌中转谷氨酰胺酶3基因杂合性丢失和表达研究

目的 探讨转谷氨酰胺酶 3(transglutaminase3,TGM3)基因在喉癌发生中的作用。方法 在 TGM3基因内部及附近选择微卫星标记进行杂合性丢失 (loss of heterozygosity,L OH)分析 ,于 DNA水平间接检测 72例喉癌患者中该基因的缺失 ;并进一步应用 Northern杂交检测 8例喉癌患者配对肿瘤及癌旁正常组织中 TGM3基因的表达差异。结果 4个短串联重复序列 (shorttandem repeats,STR)位点均存在 L OH,其中 D2 0 S17、D2 0 S6 0 7、D2 0 S99和 D2 0 S841位点的 L OH频率分别为 2 5 .76 %、2 0 .0 0 %、38.10 %和 18.75 % ,至少 1个位点出现 L OH的病例占 6 1.11% ,杂合性丢失与临床分期、淋巴结转移和分化程度无显著相关性 ;Northern杂交结果显示 8例喉癌患者 TGM3基因在正常组织中的表达比肿瘤组织显著增强。结论 TGM3基因在喉癌的发生中具有重要作用 ,具体机理有待进一步研究。

FLT3基因3′-非翻译区-荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

为分析FMS样酪氨酸激酶3(FMS-liketyrosine kinase3,FLT3)基因3′-非翻译区(3′-untranslated region,3′-UTR)可能的微小RNA(miRNA)调控位点,构建FLT3基因3′-UTR-荧光素酶报告载体,与miRNA共转染293T细胞,分析miRNA对其调控作用。采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增FLT3基因3′-UTR区序列,插入经PstI和EcoRI双酶切的经过改造的荧光素酶报告载体pGL3-control(pGL3-control-m);通过Target Scan5.1软件预测可能与FLT3基因3′-UTR作用的miRNA;采用FuGENEHD转染试剂包裹荧光素酶报告重组子和miRNA真核表达载体共转染293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果表明,成功构建了含有804bp的FLT3基因3′-UTR序列的荧光素酶报告重组子,通过酶切和基因测序的方法鉴定正确;miRNA靶位点预测显示,FLT3基因3′-UTR可能是miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-16、miRNA-195、miRNA-424、miRNA-497的作用靶点;与对照组相比,miRNA-15a、15b、195可使荧光素酶报告重组子的荧光素酶活性降低20%左右。结论:成功构建了FLT3基因3′-UTR-荧光素酶报告载体,而miRNA-15a、miRNA-15b、miRNA-195可抑制其荧光素酶活性。

稳定表达野生型和突变型DNA聚合酶β的NIH3T3细胞系的建立及其生长特性

目的:建立稳定表达野生型及突变型DNA聚合酶β(polβ)的NIH3T3细胞系。方法:用脂质体转染法分别将野生型和突变型polβ真核表达载体pcDNA3.1-PW和pcDNA3.1-PM3转染入NIH3T3细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系。用RT-PCR、免疫印迹法检测转染细胞polβmRNA和POLB蛋白的表达水平,MTT法测转染细胞生长曲线,免疫组化法测增殖细胞核抗原(PCNA),并用流式细胞仪测细胞周期。结果与结论:成功建立了稳定表达野生型及突变型polβ的NIH3T3细胞系。野生型polβ对NIH3T3细胞生长无明显影响,突变型polβ则使NIH3T3细胞生长速度加快,细胞周期发生改变,细胞多被阻滞在S期。

逆转录病毒载体介导iNOS基因转染人CD3AK细胞的初步研究

目的 构建免疫细胞性一氧化氮供体CD3AK/iNOS细胞。方法 用脂质体介导重组逆转录病毒质粒 pLNC iNOS转染入包装细胞PA317中 ,经G4 18筛选出抗性克隆。用NIH3T3细胞测定病毒上清滴度。用病毒上清感染人CD3AK细胞。测定CD3AK/iNOS细胞培养上清中iNOS活性及NO含量。结果 脂质体转染后G4 18筛选出 38个抗性克隆 ,能稳定合成并分泌重组逆转录病毒颗粒。NIH3T3细胞测定病毒滴度为 1 2× 10 5cfu/ml。CD3AK/iNOS细胞合成并分泌的NO含量及iNOS活性比CD3AK细胞明显增高。结论 成功构建CD3AK/iNOS细胞 ,并能分泌高浓度NO。

NOTCH1基因3＇-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的:构建含NOTCH1基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体,并验证其活性。方法:使用PCR方法扩增含NOTCH1基因3'-UTR区序列,插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中;使用生物信息学方法预测可能与NOTCH1基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒或空质粒和miR-34a inhibitor或control真核表达载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果:得到含NOTCH1基因3'-UTR(1 648 bp)序列的双荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证。NOTCH1基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点;用重组质粒和miR-34a inhibitor共转染的HEK293T组的荧光素酶活性比空质粒组高45%。结论:含NOTCH1基因3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功,miR-34a对NOTCH1基因有调控作用。