副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的分段表达及其免疫原性分析

本研究旨在获得副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物(TbpA),并对其免疫原性进行分析鉴定。采用生物信息学方法预测HPS的TbpA抗原表位,根据GenBank上发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成3对引物,用PCR从安徽省HPS分离株(LJ3)tbpA中分段扩增出tbpA1、tbpA2和tbpA3,并连接到pET-32a(+)载体上,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。利用SDS-PAGE检测目的蛋白,Western blotting分析重组蛋白的免疫活性;通过小鼠免疫攻毒保护试验和血清杀菌力试验,鉴定重组蛋白的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力。结果表明,从HPS(LJ3)tbpA中扩增出与预期设计的1 140、897、666bp大小相符的3个片段(tbpA1、tbpA2、tbpA3),扩增产物连接载体得到重组质粒,在大肠杆菌中实现表达,获得大小为62、54、44ku的目的蛋白(rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3),均能与HPS阳性血清反应。rTbpA1与甲醛灭活菌体对小鼠免疫攻毒的保护率分别为20%和40%,但rTbpA1引起小鼠平均死亡时间显著延迟,兔抗rTbpA1与兔抗HPS(LJ3)血清具有同样显著的杀菌活性。结果显示,成功表达的rTbpA1、rTbpA2、rTbpA3均具有良好的反应原性,其中rTbpA1更具有良好的免疫原性以及诱导机体产生保护性免疫反应的能力,可望成为副猪嗜血杆菌病疫苗和血清学检测的候选成分。

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白研究进展

副猪嗜血杆菌是猪革拉泽氏病的病原体,该病是近年来严重危害养猪业的细菌性传染病之一,呈世界性分布。副猪嗜血杆菌相关致病性毒力因子的研究目前很少,关于转铁结合蛋白更是鲜为人知。在此对副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白的结构、形成机制、影响因素及其免疫原性进行综述,对阐明致病菌的慢性感染机理有一定的生物学意义。

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白B基因的克隆与表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)血清1型菌株,设计1对特异性引物,PCR扩增转铁结合蛋白B(tbpB)全基因,克隆到pMD19-T Simple载体中,经测序比较,与参考序列的核苷酸同源性达99.72%。试验将tbpB基因定向克隆到pET-32a(+)中,转化BL21(DE3),经诱导后,SDS-PAGE结果显示转铁结合蛋白B得到表达,Western blot检测呈阳性。

猪胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白B F190A突变及免疫原性

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是造成猪肺炎和胸膜炎的重要病原菌之一,其病死率高达80%~100%。为了寻找APP转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)与猪转铁蛋白(transferrin,Tf)相互作用的关键氨基酸,以达到为APP铁摄取机制研究及相关疫苗开发奠定基础的目的,本研究在对野生型TbpB进行序列分析、三维结构建模、克隆的基础上,通过GRAMM-X分子对接软件在线预测APP TbpB与猪Tf结合的关键氨基酸,利用重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建突变质粒,ZYM-5052半乳糖自诱导培养基诱导大肠杆菌表达该突变蛋白后与猪Tf进行斑点结合试验,野生型TbpB、突变TbpB以及PBS分别免疫小鼠,采用间接ELISA法检测不同阶段小鼠血清中特异性抗体的水平。分子对接结果显示,预测的关键氨基酸为第190位苯丙氨酸,质粒测序结果显示,已成功将编码190位苯丙氨酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子;斑点结合试验结果显示,突变TbpB与猪Tf不再发生结合反应;小鼠免疫试验结果表明与野生型TbpB相比,突变TbpB可诱导产生更高水平的抗体;APP TbpB 190位苯丙氨酸在与猪Tf反应中起着关键作用,突变TbpB具有良好的免疫原性,为进一步研究TbpB的功能、结构以及开发相关疫苗奠定了理论基础。

副猪嗜血杆菌转铁结合蛋白A基因的原核表达与鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A基因(tbpA)的表达产物,根据GenBank发表的HPS(SH0165株)tbpA的核苷酸序列设计合成1对特异性引物,以HPS血清13型安徽分离株(LJ3)的基因组DNA为模板,利用PCR扩增tbpA基因,然后将其克隆至pET-SUMO载体,构建重组原核表达质粒pET-SUMO-tbpA,通过PCR鉴定和测序确认,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,并进行IPTG诱导表达和His-Ni-resin纯化目的蛋白。经SDS-PAGE检测,获得了110ku的表达产物,与预期大小的转铁结合蛋白A(TbpA)的分子质量一致。Western-blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的免疫活性。结果表明,成功表达的TbpA为研制HPS新型疫苗和诊断试剂奠定了基础。

多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的原核表达及免疫原性

为研究多杀性巴氏杆菌转铁结合蛋白TbpA的免疫原性,本试验利用PCR从牛源A型多杀性巴氏杆菌HB01基因组中扩增了TbpA的编码基因tbpA,并将其克隆至原核表达载体pET-30α(+)上,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,rTbpA蛋白成功表达。Western blot证实该蛋白能够与抗多杀性巴氏杆菌HB01血清发生阳性反应。将rTbpA免疫小鼠后,分别于免疫后14,28 d采血,利用ELISA试验检测血清中的抗体滴度,结果显示血清中的抗rTbpA蛋白的IgG抗体显著升高(P<0.05)。感染试验结果显示,免疫rTbpA蛋白能够保护70%的小鼠抵抗多杀性巴氏杆菌的致死性攻击,并且病理切片结果表明,免疫小鼠的肺部损伤相对于对照组小鼠显著降低。本试验为筛选新型的多杀性巴氏杆菌免疫原性蛋白提供依据。

山羊源海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)转铁结合蛋白B的克隆与功能鉴定

山羊海藻糖比伯斯坦杆菌(Bibersteinia trehalosi)是造成山羊肺炎重要病原菌之一,其转铁结合蛋白B(transferrin binding protein B,TbpB)结构与功能的研究对于阐明其致病机理有重要作用。本研究在前期分离鉴定菌株基础上,通过生物信息学分析结果显示,海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB包含氨基小叶(N-lobe)和羧基小叶(C-lobe)。分别对该菌TbpB^ 20-581 (In-tact)、N-lobe、C-lobe进行克隆、表达与纯化,对纯化的蛋白与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白进行特异性点阵杂交反应,发现山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB In-tact以及N-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白有特异结合反应,而与猪转铁蛋白、鸡转铁蛋白没有反应,山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB C-lobe与山羊转铁蛋白、绵羊转铁蛋白、猪转铁蛋白、牛转铁蛋白、鸡转铁蛋白均无反应。结果表明山羊海藻糖比伯斯坦杆菌TbpB与山羊转铁蛋白结合发生在N-lobe。

乳胶凝集试验快速检测副猪嗜血杆菌

利用原核表达并经过纯化的副猪嗜血杆菌TbpBN端蛋白及人工合成的特异性多肽制备单克隆抗体,经碳化二亚胺(EDC)将纯化后的单克隆抗体IgG与羧化乳胶共价偶联,并对偶联乳胶的IgG含量及偶联时间等条件进行合理选择,建立了快速检测副猪嗜血杆菌的乳胶凝集试验方法。利用LAT方法检测148株副猪嗜血杆菌疑似菌株,参考16S rRNA-PCR方法的结果,符合率为83.1%,且致敏乳胶不与临床常见菌株发生凝集反应。结果表明,此检测方法具有操作简便、快速、特异性高的特点,便于在基层推广使用,为副猪嗜血杆菌的诊断和有效防治提供了参考和依据。

副猪嗜血杆菌TbpA对仔猪的免疫效力评价

本研究旨在了解副猪嗜血杆菌(HPS)转铁结合蛋白A(TbpA)对仔猪的免疫保护性,从而为HPS新型疫苗的研发奠定基础。采用HPS血清型13型灭活全菌体以及浓度分别为0.5、0.25mg·4mL^(-1)的重组TbpA,经3次间隔期均为14d的免疫后,检测仔猪抗体(IgG)水平及细胞因子(IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α)水平;以相同血清型菌株7LD50剂量,腹腔攻毒,检查病理学变化及其免疫保护率。结果显示:HPS的重组TbpA能诱导仔猪产生较高水平的特异性抗体IgG,并使细胞因子显著升高。重组TbpA和灭活全菌体在免疫后均能使仔猪获得免疫保护,其中0.5mg·4mL^(-1) TbpA和灭活全菌体的免疫保护率均为100%,组织切片病理变化与攻毒对照组之间差异明显。HPS的TbpA能激发仔猪的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为一种新的疫苗候选抗原。

副猪嗜血杆菌外膜蛋白TbpB基因的克隆和表达

为了克隆和表达副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白TbpB基因,试验采用基因工程的方法对已发布的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计并合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得长为1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子质量约为41 ku,将该基因片段定向克隆至表达载体pGE X-6p-1中。结果表明:诱导表达后分子质量约为67 ku,与副猪嗜血杆菌阳性血清发生了特异性反应。说明该蛋白与抗体发生了反应,有一定免疫原性。

基于TbpA蛋白的副猪嗜血杆菌抗体间接酶联免疫吸附试验检测方法的建立及应用

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Glasser’s Disease)的病原体,抗生素治疗和疫苗接种对于防控该病效果不明显,建立快速、准确的抗体检测方法尤为重要。【目的】利用表达纯化的HPS转铁结合蛋白A(TbpA)建立检测HPS抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。【方法】PCR扩增HPS的tbpA基因并与原核表达载体pET-SUMO连接,通过PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入Escherichia coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定产物。以纯化的TbpA蛋白作包被抗原,通过各种反应条件优化,建立检测HPS抗体的间接ELISA方法,并进行临床应用与评价。【结果】该方法的最佳条件:包被抗原浓度为5μg/mL,4℃过夜;5%脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:1600,37℃孵育45 min;酶标二抗稀释度为1:5000,37℃作用30 min;显色时间为37℃ 5 min。该方法可特异性检测HPS抗体,阳性血清稀释至1:12800仍可检出,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应,批内及批间变异系数均小于10%,与全菌体包被间接ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western Blot比较,该方法总符合率分别为90.00%、86.67%和90.00%,其中阳性符合率分别为90.38%、88.46%和92.00%,阴性符合率分别为87.50%、75.00%和80.00%。该方法检测免疫抗体阳性率为80.00%,感染抗体阳性率为19.50%。【结论】基于TbpA蛋白建立的HPS抗体间接ELISA检测方法,具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为HPS的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段。

副猪嗜血杆菌毒力因子的研究进展

副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的一种常在条件性致病菌,以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征,该菌引起的革拉氏病流行和危害日渐严重,严重危害了仔猪和青年猪的健康。本文对副猪嗜血杆菌的主要毒力因子包括荚膜多糖、脂多糖、脂寡糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、神经氨酸酶、生物被摸、cAMP依赖性自然转化系统和毒力相关活性酶进行了综述,对新技术运用于其毒力因子的研究作了简要介绍,并对今后的相关研究提出展望。

副猪嗜血杆菌血清4、13和14型TbpA对豚鼠的交互免疫保护性

【背景】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪革拉瑟氏病(Gl?sser?sdisease)的病原体,目前在对该病的防控中,由于长期使用抗生素产生的耐药性以及灭活疫苗缺乏交互免疫保护力,亟待寻求新的方法来解决这一问题。【目的】探究不同血清型HPS转铁结合蛋白A(TbpA)对豚鼠的交互免疫保护性,为进一步用仔猪开展相关研究奠定基础。【方法】采用HPS血清型4、13和14型重组TbpA以0.1mg/只、经2次间隔期为20d的免疫后,检测豚鼠血清IgG抗体和细胞因子(IL-2、IL-5、IL-8、IFN-γ、MCP-1、TNF-α)水平;以HPS血清型4、13和14型菌株5 LD50剂量腹腔攻毒,检查病理组织学变化及其免疫保护率。【结果】HPS血清型4、13和14型重组TbpA均能诱导豚鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使细胞因子显著升高。HPS血清型4、13和14型重组TbpA在免疫后均能对豚鼠产生交互免疫保护,其中HPS血清型13型TbpA免疫组的交互免疫保护率最高,对血清型4、14型HPS均为50.0%,对相同血清型HPS的免疫保护率也最高,达到83.3%,病理组织学检查显示与HPS血清型4、14型TbpA免疫组相比,13型TbpA免疫组的组织切片病理变化与攻毒对照组之间差异更明显。【结论】HPS血清型4、13和14型TbpA均能诱导豚鼠的体液免疫和相关细胞因子的分泌,产生交互免疫保护力,其中HPS血清型13型Tbp A的交互免疫保护力最强,可作为一种新的疫苗候选抗原。

山西太原地区淋球菌NG-MAST基因分型

目的采用淋球菌多抗原序列分型(NG-MAST)进行淋球菌基因分型,了解山西太原地区淋球菌流行株的菌株基因分型。方法收集山西太原地区淋球菌菌株41例,提取所有菌株的DNA,扩增por和tbpB基因片段,进行测序,在NG-MAST基因数据库里进行比对,用MEGA-X对其进行进化树分析。结果研究41株菌的NG-MAST基因分型,发现新的基因分型共15株(36.59%)。NG-MAST进化图显示NG-MAST3305和NG-MAST2083是山西地区的优势菌株。por1132、por2001、por6993是山西地区por的优势基因型,tbpB4是山西地区的优势基因型。por等位基因号90和5692可能为短链上同一来源基因型;淋球菌的tbpB的进化图可以发现tbpB4、1601、1971、907、75、446的等位基因号亲缘关系比较近,它们可能是短链上来源相同的基因型;淋球菌的NG-MAST的进化图可以发现ST4022和ST New4的亲缘关系比较近,它们可能是短链上来源相同的菌株。结论 NG-MAST可以持续监测山西太原地区淋球菌的基因分型,了解本地区淋球菌流行状况。