转鲑鱼降钙素基因酵母及RANKL对大鼠血管平滑肌细胞体外钙化的影响

观察核因子kB受体激活物配体(RANKL)对大鼠血管平滑肌细胞体外钙化的调节作用,以及转鲑鱼降钙素基因酵母对RANKL调节作用的影响。体外培养大鼠血管平滑肌细胞,建立体外血管平滑肌细胞钙化模型,在培养介质中分别加入RANKL及转鲑鱼降钙素基因酵母蛋白上清液,观察细胞钙沉积、细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的变化情况。结果表明,RANKL促进钙化培养的大鼠血管平滑肌细胞的钙沉积、细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达,而转鲑鱼降钙素基因酵母能够抑制RANKL的促钙化作用。RANKL可能通过增加细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素的表达从而促进血管平滑肌细胞向成骨细胞转化;转鲑鱼降钙素基因酵母可能通过OPG/RANKL/RANK途径抑制血管平滑肌细胞钙化。

多拷贝表达转鲑鱼降钙素基因酵母的急性、亚急性毒性

口服转鲑鱼降钙素基因酵母为鲑鱼降钙素的应用开辟了一条新的途径.为评价转鲑鱼降钙素基因酵母的安全性,将转基因酵母分别灌胃昆明种小鼠和Wistar大鼠进行急性毒性实验(7 d)、亚急性毒性实验(8周).急性毒性实验结果表明灌喂转基因酵母对小鼠无致死效应(LD50>10 000 mg/kg);亚急性毒性实验中高(2.0 g/kg)、低(0.5 g/kg)剂量组动物的一般状况、体重、主要脏器系数、血液学指标及血液生化指标与各对照组比较,均未见明显差异(P>0.05),组织病理切片检查未发现病理性变化.实验结果说明转鲑鱼降钙素基因酵母不会对实验动物造成不良影响,是安全无毒的.

鲑鱼降钙素与骨生长肽融合基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

降钙素 (Calcitonin ,CT)和骨生长肽 (Osteogenicgrowthpeptide ,OGP)是两种治疗骨质疏松症的药物 ,设想通过这两种基因的融合表达来达到治疗骨质疏松的目的。体外合成OGP和sCT的基因 ,经过DNA体外重组构建酵母表达质粒 ,实现了在毕赤酵母中的表达 ,通过纯化后进行氨基酸N端测序 ,证明表达的蛋白序列正确。

重组鲑鱼降钙素结肠黏附缓释微球的制备

为考察重组(酵母)鲑鱼降钙素结肠黏附缓释微球的制备工艺和最优处方,并对释药特性进行探讨。以阿拉伯胶、β-环糊精、可溶性淀粉、明胶为壁材,HPMC和卡波姆为生物黏附剂,运用正交试验确定喷雾干燥法制备微球的最佳工艺条件和处方。结果表明,微球的最佳制备工艺和处方为β-环糊精与阿拉伯胶以15∶1、HPMC与CP以4∶1配比为理想壁材,喷雾干燥进风温度160℃、进料速度10mL·min-1、雾化压力0.5MPa、壁材浓度15%、芯材比1∶3为最佳组合,所得微球能达到缓释12h的试验设计要求。本法工艺稳定、可行,所得鲑鱼降钙素结肠黏附缓释微球具有良好的缓释效果。

酵母表达鲑鱼降钙素的降血钙活性和药动学研究

目的:研究表达鲑鱼降钙素的转基因酵母(yAGA2-r-sCT)的降血钙活性及在大鼠体内的药动学特征。方法:Tsuruo-ka法制备高钙血大鼠模型,观察给药后血浆钙浓度的变化。随机分组单剂量给药试验设计单剂量灌胃yAGA2-r-sCT0.5g.kg-1和肌肉注射密钙息(Miacalcic,Mia)100IU.kg-1进行药物代谢动力学研究,酶联免疫吸附法测定各时间点血药浓度,DAS2.0药动学软件计算出相应的药动学参数,t检验比较2种制剂的药动学参数。结果:灌胃yAGA2-r-sCT0.5及1g.kg-1,静脉注射帕米磷酸二钠(pamidronate,Pam)5mg.kg-1,肌肉注射Mia100IU.kg-1均有明显降低血浆钙浓度的作用,经配对t检验,三者用药后1h的血钙变化率差异无显著性(P>0.05)。四参数回归方程为OD=-7×10-7C3+3×10-4C2+7.3×10-3C-0.0761(r=0.9985),检测范围为5～200μg.L-1,最低检测限为5μg.L-1,日内和日间RSD小于8.6%;单剂量灌胃yAGA2-r-sCT、肌肉注射Mia,Tmax分别为(3.00±0.58)和(1.00±0.29)h,Cmax分别为(106.00±21.17)和(132.00±27.15)μg.L-1,T1/2α分别为(2.29±0.39)和(0.08±0.21)h,T1/2β分别为(3.86±0.67)和(2.49±0.52)h,Ka分别为(0.43±0.22)和(13.99±0.43)h-1,AUC0-t分别为(797.13±134.13)和(598.0±116.33)μg.h.L-1,AUC0-∞分别为(858.56±160.18)和(621.84±125.60)μg.h.L-1,MRT0-t分别为(5.44±1.11)和(4.26±0.70)h,MRT0-∞分别为(6.59±1.17)和(4.89±1.11)h,说明yAGA2-r-sCT与市售Mia在大鼠体内的药动学特征差异具有显著性(P<0.05或0.01)。结论:yA-GA2-r-sCT可显著降低血钙。酶联免疫吸附法测定鲑鱼降钙素含量的方法稳定,结果准确可靠。yAGA2-r-sCT与市售Mia相比,yAGA2-r-sCT显著改善了鲑鱼降钙素的药动学性质,具有缓释和长效的作用。