转基因抗虫耐除草剂玉米瑞丰125 Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白的时空表达分析

玉米是我国最重要的粮食作物之一,虫害会造成严重的品质和产量损失,转Bacillus thuringiensis(Bt)基因抗虫玉米为玉米害虫的防治提供了新途径。转Bt基因抗虫玉米的抗虫性与外源杀虫蛋白表达量具有密切的关系,明确Bt杀虫蛋白在不同生育期和不同器官中的表达量,对害虫的综合防治和农业转基因生物安全管理具有重要意义。连续两年采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定了9个地点种植的瑞丰125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量,对比分析了玉米拔节期(V6-V8)叶片、抽雄期(VT)雄穗、吐丝期(R1)叶片和花丝、成熟期(R4)叶片和籽粒的Bt杀虫蛋白含量,结果表明Bt杀虫蛋白表达量在不同玉米器官中差异较大。2年9个地点的数据整体上呈现出叶片中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量较低的规律。9个地点种植的瑞丰125的Cry1Ab/Cry2Aj杀虫蛋白表达量有所差异,但差异整体较小。

转Bt-cry1 Ab玉米花粉对异色瓢虫生长发育及体内三种代谢酶活性的影响

用转Bt-cry1 Ab基因玉米花粉饲喂异色瓢虫,初步研究了转基因玉米花粉对瓢虫的影响。结果显示,异色瓢虫取食混有适量蚜虫的转Bt-cry1 Ab基因玉米花粉时与取食混有适量蚜虫的非转基因亲本玉米花粉时相比,各虫态发育历期没有显著差异;取食转Bt-cry1 Ab基因玉米花粉对异色瓢虫的体重增加无明显影响。多数龄期内取食转基因玉米花粉的异色瓢虫体内的α-乙酸萘酯酶活性、乙酰胆碱酯酶活性以及谷光甘肽-S-转移酶活性与对照组相比没有显著差异。用酶联免疫(ELISA)方法在取食转Bt-cry1Ab基因玉米花粉的瓢虫体内未检测到Bt杀虫蛋白。转Bt-cry1Ab玉米花粉对异色瓢虫生长发育没有显著负面影响,初步证明Bt玉米MON810花粉对异色瓢虫是安全的。

转基因玉米对田间节肢动物生物多样性及虫害发生的影响

【目的】明确转基因抗虫(cry1Ab)耐除草剂(epsps)玉米DBN9936对田间节肢动物生物多样性及虫害发生的影响,为转基因作物的生物安全提供数据支持。【方法】在田间隔离条件下,采用直接观察法对田间节肢动物种类和数量进行统计,采用剖杆法调查钻蛀类害虫的危害情况。分析比较转基因玉米宏硕1799转化体和远科105转化体及其非转基因玉米受体品种、非转基因玉米栽培品种先玉335的田间节肢动物功能群、丰富度指数、Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀性指数、优势集中性指数等相关参数。【结果】1)转基因玉米与非转基因玉米受体品种的田间节肢动物丰富度指数、多样性指数、均匀度指数、优势集中性指数随时间变化趋势基本一致;2)转基因玉米的叶片平均受害率、茎秆平均受害率和穗尖平均受害率均低于非转基因玉米;3)转基因玉米与喷施杀虫剂的非转基因玉米上玉米螟、棉铃虫和黏虫等鳞翅目害虫的危害程度均较非转基因玉米有不同程度的降低。【结论】与非转基因对照玉米相比,受试转基因玉米有降低鳞翅目靶标害虫发生的趋势,且对田间节肢动物生物多样性无明显影响。

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。

转Bt基因抗虫玉米植株叶腋处花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

以表达Cry1Ab杀虫蛋白的两种转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法研究了玉米散粉时沉积在植株叶腋处Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态,比较了两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度.结果表明,Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白是逐渐降解的,且降解速度逐渐加快.但两种Bt玉米花粉中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,MON810中的Bt杀虫蛋白降解较快,而Bt11中的降解较慢.d15时在MON810叶腋处的花粉中已经检测不到Bt杀虫蛋白,而在Bt11花粉中Bt杀虫蛋白到d18才完全降解.两种Bt玉米花粉中杀虫蛋白的初始含量差异显著,且在各个取样时间内Bt杀虫蛋白的残留量存在显著差异.玉米散粉时留在田间的Bt玉米花粉中的Cry1Ab杀虫蛋白不会在自然界累积.

农杆菌介导Cry1 Ab/Ac抗虫转基因玉米植株的获得

转基因技术的迅速发展有效地打破了物种间的遗传壁垒,从而加快了优良基因定向聚合的进程,然而遗传转化率低及转基因安全问题成为制约其进一步发展的限制因素。基于此,本研究以玉米自交系H99为材料,将Ac/Ds双元表达载体(包含抗虫Cry1 Ab/Ac基因和gfp报告基因等)通过农杆菌介导法转入由110粒玉米幼胚诱导出的愈伤组织中,获得28株抗性转基因植株。经PCR及RT-PCR的验证结果显示,其中8株为含有Cry1 Ab/Ac目的基因且该基因有效表达的阳性植株,转化效率达7%。通过农杆菌介导法所获得的玉米转基因植株为今后剔除抗生素筛选标记,从而获得安全的玉米抗虫新种质提供了遗传材料。

转cry1Ab基因玉米对瓢虫科天敌种群动态的影响

【背景】瓢虫科天敌昆虫是玉米田中重要的天敌类群,可捕食多种农业害虫,对害虫有很好的控制作用。为了明确转基因玉米对瓢虫科天敌的潜在效应。【方法】在田间条件下,采用系统调查结合吸虫器方法,研究了cry1Ab基因玉米对玉米田主要瓢虫科天敌种类丰富度和种群动态的影响。【结果】转cry1Ab基因玉米田与其对照田瓢虫类群和优势种群组成相同。春播时Bt玉米田与对照田以龟纹瓢虫为优势种,仅在玉米生长后期Bt玉米田中的龟纹瓢虫数量显著高于对照田,其他时期2种田间龟纹瓢虫的种群动态没有显著差异。夏播玉米田以龟纹瓢虫和异色瓢虫为主,在8月17日Bt玉米田中异色瓢虫数量显著高于对照田,在9月27日其异色瓢虫数量显著低于对照田,而其他时期Bt玉米田和对照田中异色瓢虫优势度以及田间种群动态没有显著差异。【结论与意义】转cry1Ab基因玉米对玉米田重要的瓢虫科天敌丰富度、优势度和种群数量没有不良影响。因此,该转基因玉米可用于农田生态系统的有害生物管理。

Cry1Ab/1Ac基因在转基因玉米中的表达研究

本研究通过人工合成获得了密码子的优化Bt杀虫蛋白基因Cry1Ab/1Ac,并以草甘膦抗性基因epsps为标记基因,构建了高效表达载体pBAC174,并用基因枪法将表达载体pBAC174导入受体材料幼胚愈伤组织。对轰击后的愈伤组织进行筛选、分化和植株再生,获得40个草甘膦抗性的玉米再生植株。经PCR和Southern杂交检测表明,外源Cry1Ab/1Ac基因已经整合到玉米的基因组中。转基因植株叶片蛋白粗提物用BT-Cry1Ab/1Ac金标免疫检测试纸条检测,结果表明Bt基因在部分转基因植株后代获得了表达。本研究为进一步利用Cry1Ab/1Ac基因进行玉米抗虫育种奠定了基础。

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。

转cry1Ab/cry1Ac基因玉米Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白表达及对亚洲玉米螟的室内杀虫效果

【目的】室内抗螟性评价是转Bt基因抗虫玉米研发和安全性评价的重要环节。【方法】采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量;采用室内生测法测定了分别取食转基因玉米ZZM030和非转基因玉米X249心叶后亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis敏感品系ACB-BtS、Cry1Ab抗性品系ACB-AbR和Cry1Ac抗性品系ACB-AcR初孵幼虫的存活率。【结果】转基因抗虫玉米ZZM0304叶期和8叶期心叶中Cry1Ab/Cry1Ac融合杀虫蛋白的表达量分别是10.62和2.94μg/g FW。敏感品系亚洲玉米螟初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶2 d的存活率仅为23.6%,4 d后存活率为0,而取食非转基因对照玉米X249心叶4 d的存活率高达93.1%。Cry1Ab抗性品系和Cry1Ac抗性品系初孵幼虫取食转基因玉米ZZM030心叶6 d后的存活率分别为11.1%和12.5%,而取食非转基因玉米X249心叶6 d后的存活率分别为81.9%和77.8%。【结论】转cry1Ab/cry1Ac基因玉米ZZM030心叶中高表达的Cry1Ab/Cry1Ac融合蛋白对亚洲玉米螟初孵幼虫具有极高的杀虫效果。

转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5对土壤古菌丰度和多样性的影响

为探讨转基因玉米的生态安全问题,2015年分别于玉米拔节期、抽雄期、乳熟期和完熟期采集土壤样品,并采用荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)和末端限制性片段长度多态性分析(Terminal restriction fragment length polymorphism,TRFLP)技术,研究了转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5种植对土壤古菌丰度和多样性的影响。结果表明:转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5(TM)和受体玉米DBN318(PM)的根际土和非根际土古菌数量为1.41×10~9~4.04×10~9copies·g^(-1)土,随生长时期的推进均呈现先升高后降低的变化趋势,同一生长时期和土壤样品采集区域,2种玉米古菌16S rRNA基因丰度间无显著差异。T-RFLP分析共获得15种不同长度的T-RFs,其中89 bp和184 bp片段为优势种群,同一生长时期和土壤样品采集区域每种优势种群在TM和PM间均无显著差异。土壤古菌Shannon指数除PM非根际土呈现先降低后升高的变化趋势外,其他均表现为先降低后升高再降低;TM和PM根际土古菌Evenness指数的变化趋势均为先降低后升高,而非根际土古菌Evenness指数表现为先降低后升高再降低。同一生长时期和土壤样品采集区域TM和PM的Shannon指数间及Evenness指数间差异均不显著。冗余分析(Redundancy analysis,RDA)显示土壤总氮和硝态氮含量对古菌群落结构有显著影响。主成分分析(Principal component analysis,PCA)表明,TM和PM土壤古菌群落在根际土和非根际土中均未发生明显分离,说明TM和PM土壤古菌群落组成无显著差异。上述结果表明:转cry1Ab和epsps基因玉米C0030.3.5土壤古菌丰度和群落结构组成与受体玉米DBN318无显著差异,古菌丰度和多样性主要受生长时期的影响,受土壤样品采集区域的影响不显著,土壤总氮和硝态氮是调控土壤古菌群落变化的关键因子。

转cry1Ab/cry2Aj基因玉米双抗12-5对意大利蜜蜂成虫的影响

转cry1Ab/cry2Aj基因玉米双抗12-5是我国自主研发的抗虫耐除草剂玉米品系,目前已获批准进入生产性试验阶段。蜜蜂是具有重要生态和经济意义的昆虫,是转基因植物环境安全评价中主要的非靶标节肢动物。在转基因抗虫植物种植过程中,蜜蜂可能通过采集花粉暴露于转基因抗虫植物表达的杀虫蛋白。本实验采用室内生测的方法评价了转基因玉米双抗12-5花粉和Cry1Ab杀虫蛋白对意大利蜜蜂(Apis mellifera)的影响。结果显示,喂食转基因玉米花粉处理组的意大利蜜蜂体内能检测到Cry1Ab杀虫蛋白;与对照相比,饲喂转基因玉米花粉和8μg·mL^-1纯化的Cry1Ab杀虫蛋白对意大利蜜蜂的存活率没有显著影响,吡虫啉处理组意大利蜜蜂存活率显著低于花粉和蔗糖处理组。以上结果表明,转基因玉米双抗12-5或Cry1Ab杀虫蛋白对意大利蜜蜂的风险较小。

转cry1 Ab基因水稻中毒蛋白的表达、分泌及其在土壤中的残留

研究了转cry1Ab基因水稻 (克螟稻 )中Cry1Ab毒蛋白的表达、根系分泌及其在土壤中的残留规律 .结果表明 ,分蘖始期至成熟期 ,克螟稻地上部和根部中的Cry1Ab毒蛋白的表达量 (FW)分别为 3 2 3～ 8 2 2 μg/ g和 0 6 8～ 0 89μg/g .生育期间克螟稻根系分泌的Cry1Ab毒蛋白含量仅为 1 6 6～ 4 8 0 2ng/ (株·d) .试验证实 ,克螟稻根际土中的Cry1Ab毒蛋白残留含量低于检测限 (<0 5ng/ g干燥土 ) .生物测定还表明 ,克螟稻根际土及其提取液对棉铃虫初孵幼虫和 3龄幼虫不产生致死性效应 .相对于Cry1Ab毒蛋白的根系分泌转移 。

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

采用ELISA 方法研究了Bt 棉花叶片中Cry1Ac 杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明,不同环境下Bt 杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中,Bt 杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快,经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态(含量50 ng·g-1左右)。高温低湿条件下,Bt 杀虫蛋白降解较快,达到稳定水平的时间短。Bt 杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac 蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速,30 d 后降解了85%左右。随着冬季的到来,杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后,杀虫蛋白的降解加快,至4 月下旬检测不到Bt 杀虫蛋白。

国产Bt-Cry1Ab和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾的抗性测定

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J.E.Smith)是世界性重大农业害虫。种植转基因Bt作物是主要的防治手段之一。我们利用室内生物测定方法评价了国产Bt-Cry1Ab玉米(转化体C0030.3.5)和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米(转化体DBN3601和DBN3608)对草地贪夜蛾1~4龄幼虫的毒力。结果显示,供试两种转基因玉米共6个品种皆可高效表达目标杀虫蛋白并对草地贪夜蛾具有很强的毒杀作用,对1龄幼虫的致死率达到59%~100%,存活幼虫的生长发育亦受到显著抑制。表明国内研发的Bt-Cry1Ab玉米和Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米对草地贪夜蛾具有良好的控制效果,其中Bt-(Cry1Ab+Vip3Aa)玉米的防治效果显著优于Bt-Cry1Ab玉米,两种转基因玉米皆具有较好的商业化应用前景。

转Btcry1Ab基因水稻对稻田弹尾虫种群数量的影响

以转Btcry1Ab基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)及其亲本非转基因水稻秀水11(XS11)为材料,于2003年9月和翌春4月,调查了KMD1和KMD2对水稻灌浆期和收割后休田期稻田土表落叶层中弹尾虫种群数量的影响.结果表明,KMD植株表达的cry1Ab杀虫蛋白可在稻田环境中残留160d以上;在水稻灌浆期采用吸虫器法在稻田落叶层中采集到灰橄榄长角跳虫(Entomobrya griseoolivata)和钩圆跳虫(Bourletiella christianseni)等2种弹尾虫,其中灰橄榄长角跳虫在KMD1和KMD2稻田中的种群密度显著高于XS11稻田;在水稻收割后休田期采用网袋法采集到灰橄榄长角跳虫、钩圆跳虫、球角跳虫(Hypogastrura matura)和等节跳虫(Isotoma monochaeta)等4种弹尾虫,其中转Bt基因水稻稻田中的灰橄榄长角跳虫和球角跳虫的种群密度显著高于XS11稻田,且其植株组织残体生物量损失率显著高于XS11.

转cry1F基因玉米花粉对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响

腰带长体茧蜂(Macrocentrus cingulum)是亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫的主要寄生蜂,对亚洲玉米螟种群具有重要的控制作用。玉米花粉可以作为腰带长体茧蜂的补充营养。本研究利用转cry1F基因抗虫玉米花粉作为补充食物饲喂腰带长体茧蜂寄生亚洲玉米螟幼虫,研究其对腰带长体茧蜂存活和繁殖的影响,为转基因抗虫玉米的环境安全评价提供科学依据。结果表明,饲喂转cry1F基因抗虫玉米花粉后腰带长体茧蜂的寄生率、茧块重量、每茧块茧数、羽化率与饲喂对照玉米花粉相比无显著差异;在蜂蜜水+Bt玉米花粉处理中虽然与对照玉米花粉处理相比雌蜂的寿命并没有显著差异,但雄蜂的寿命差异显著;在取食转cry1F基因抗虫玉米花粉的腰带长体茧蜂体内未检测到Bt蛋白成分。说明转cry1F基因抗虫玉米花粉对腰带长体茧蜂的存活和繁殖没有显著影响。

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。

泥鳅生长及抗氧化-解毒酶系统对水体中转Cry1Ab/Ac基因水稻残遗物的响应

在泥鳅养殖水体中添加稻秆粉模拟水稻残遗物生境,研究了泥鳅生长和肝胰脏抗氧化酶(SOD、CAT)与解毒酶(GST)活性对转Cry1Ab/Ac基因水稻‘华恢1号’(HH1)的响应。设计以HH1稻秆粉10 mg·L?1、50 mg·L?1、100 mg·L?1和200 mg·L?1 4个梯度浓度处理泥鳅为试验组,以非转Bt基因水稻‘明恢63’(MH63)稻秆粉处理组为阴性对照,不加稻秆粉的基础饲养组为空白对照。结果显示:在4种稻秆粉浓度下,HH1组与MH63对照组泥鳅的特定生长率、肥满度、内脏系数及SOD、CAT和GST酶活性均无显著差异(P>0.05);与空白对照比较,稻秆粉浓度升高对泥鳅生长的抑制逐渐增强,当浓度达到200 mg·L?1时,HH1组和MH63对照组泥鳅的特定生长率、内脏系数与CAT活性降低。研究结果表明,水体中低含量的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻HH1稻秆粉对泥鳅的生长与生理酶活性没有明显影响,高浓度HH1和MH63稻秆粉均使泥鳅的生长和生理酶活性显著降低,这可能与养殖水体中浓度较高的悬浮稻秆粉妨碍了泥鳅的呼吸和滤食,及稻秆粉的分解降低了水体p H和溶氧量有关。

转cry1Ie基因玉米残体对赤子爱胜蚓的生长发育及体内酶活性的影响

转Bt基因抗虫玉米通过根系分泌物或植株残体降解等方式将植株表达的Bt杀虫蛋白释放到土壤中。本文通过在人工土壤中添加磨碎的转cry1Ie基因玉米植株残体来饲养赤子爱胜蚓Eisenia foetida,研究了转cry1Ie基因玉米植株残体对赤子爱胜蚓生长发育及体内酶活性的影响。结果显示,在63 d的试验中,添加转cry1Ie基因玉米植株残体处理组没有引起赤子爱胜蚓的死亡。5个处理组与对照组中每7 d的蚯蚓体重、产茧数量、茧孵化数量均没有显著差异。SOD酶和POD酶活力随Bt玉米植株残体组织含量的增加而增加,50B+0N(50 g Bt/500 g土壤)处理组中SOD酶和POD酶活力要显著高于0B+50N(50 g non-Bt/500 g土壤)对照组。因此,Bt玉米植株残体可以在7 d时诱导赤子爱胜蚓SOD酶和POD酶活性。但5个处理组与对照组中赤子爱胜蚓的总蛋白含量、AChE和CAT酶活力没有显著的差异。