高表达转 C4型 PEPC 基因水稻在低氮下诱导碳氮酶稳定光合作用

为揭示高表达转玉米C4-PEPC基因水稻在低氮条件下的光合表现,采用高表达转玉米C4-PEPC基因水稻(PC)与原种Kitaake(WT)为试验材料,通过盆栽试验,分别测定不同的氮素条件下(中氮300 kg/hm2,低氮65 kg/hm2),开花后不同天数的SPAD值,光合参数以及碳氮关键酶活性。并在开花后50 d收获植株,记录产量因子。结果表明:低氮处理下的PC相对于WT来说,在开花后14,28 d,其净光合速率分别提高了13.10%(P<0.05)和29.29%(P<0.05)。同时,Rubisco羧化酶在开花后14,28 d时活性分别提高了67.86%和52.63%(P<0.05);硝酸还原酶在14,28 d时的活性分别提高79.49%(P<0.05)和17.96%;谷氨酰胺合成酶仅在开花后28 d时活性提高28.48%(P<0.05)。但是通过对产量进行分析,在低氮条件下,并未发现PC的产量与WT有明显差异。可见,PC通过诱导碳氮的关键酶活性的提高维持低氮条件下高净光合速率。

外源C_4二羧酸对转玉米PEPC基因水稻C_4光合途径的促进作用

以转PEPC基因水稻和野生型水稻Kitaake为材料 ,研究了不同基因型水稻叶片中的C4 光合微循环及其功能。通过测定与光合C4 途径有关的关键酶 ,如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)、NADP 苹果酸酶 (NADP ME)、NADP 苹果酸脱氢酶 (NADP MDH)和丙酮酸磷酸双激酶 (PPDK) ,说明野生型水稻叶片中具有完整的C4 光合酶体系 ;用外源草酰乙酸 (OAA)或苹果酸 (MA)饲喂叶切片或叶绿体后明显增加光合速率 ,证明野生型水稻中具有一个有限的光合C4 微循环。将玉米的PEPC基因导入原种水稻后 ,可大幅度提高光合C4 微循环的速率。测定不同基因型的CO2 交换速率 ,看出水稻中C4 光合微循环的增强有提高净光合速率 (Pn)和降低Pr/Pn 比值的作用。叶绿素荧光特性分析表明 ,C4 光合微循环的增强伴随着PSⅡ电子传递效率 (Fv/Fm)和光化学猝灭 (qp)的增加 ,以及非光化学猝灭 (qN)

C_4光合pepc基因转化水稻和小麦研究进展

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)作为C4途径的关键酶,一直是水稻、小麦转基因研究的热点。综述了PEPC基因工程现状,着重介绍了转C4光合pepc基因水稻、小麦的光合生理特性及高光效育种最新进展;并指出转基因高光效育种的分子作用机理尚需深入研究,有价值高光效种质有待进一步创制;将转基因高光效育种和常规育种相结合,开展水稻、小麦分子聚合育种,是培育优质、高产、多抗水稻、小麦新品种的有效途径。

干旱条件下DCMU对高表达转C4-pepc水稻的花青素合成基因及其相关信号的影响

为了揭示高表达转玉米C4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC,EC 4.1.1.31)基因水稻(PC)在耐旱中光合与花青素调节途径的内在联系,本研究以PC和未转基因野生型原种(WT)的水培苗为试验材料,在4~5叶期,通过50μmol·L-1光合抑制剂DCMU[3-(3’,4’-dich-lorophenyl)-1,1-dimethyl-urea]预处理1 h,观察其在12%PEG-6000模拟干旱处理下的表现。结果表明,在模拟干旱条件下,DCMU预处理使两种供试材料相对含水量显著下降,且PC相对含量显著高于WT;干旱处理下,两种材料的花青素含量显著升高,DCMU和干旱处理使两种材料的花青素含量下调,且PC水稻中始终伴随着较高的花青素含量。光合数据表明,与单独12%PEG-6000处理相比,DCMU联合12%PEG-6000处理显著抑制了两种水稻材料的净光合速率、气孔导度、胞间CO2含量及羧化效率,但PC的各指标显著高于WT。同时,DCMU联合12%PEG-6000处理显著下调两种供试材料的内源蔗糖含量,但PC中蔗糖含量显著高于WT。进一步研究发现PC中更高的蔗糖含量与花青素合成有关转录因子b HLH(Os B1,Os B2)、R2R3-MYB(Os C1)、COP1(constitutively photomorphogenic 1)、HY5(elongated hypocotyl 5)更高的转录水平同步,下游花青素合成相关基因Os PAL、Os CHI、Os CHS、Os F3H、Os F3’H、Os DFR、Os ANS的表达量增加。PC水稻可能通过诱导NO和Ca2(10)感受干旱信号,参与转录因子的调节,进而参与花青素合成基因的调控,合成较多的花青素,增强PC水稻对干旱逆境的响应,增强保水能力,最终表现耐旱。

转玉米PEPC基因水稻中有限的C4光合微循环及其生理作用

用转PEPC基因水稻(Oryza．sativa L．subsp．japonica，Kitaake)和原种水稻Kitaake为材料，研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能。通过测定与光合C4途径有关的关键酶，如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP^+-苹果酸酶(NADP^+-ME)、NADP^+-苹果酸脱氢酶(NADP^+-MDH)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)，说明原种水稻叶片中具有完整的C4光合酶体系；用外源OAA或MA饲喂叶切片或叶绿体后明显增加光合速率，证明原种水稻中具有一个有限的光合C4微循环。将玉米自PEPC基因导入原种水稻后，可大幅度提高光合C4微循环的速率。测定不同基因型的CO2交换速率，看出水稻中C4光合微循环的增强有提高净光合速率(Pn)和降低光呼吸速率／净光合速率(Pr/Pn)比值的作用。叶绿素荧光特性分析表明，C4光合微循环的增强伴随着PSⅡ电子传递效率(Fv／Fm)和光化学猝灭(qP)的增加以及非光化学猝灭(qN)的降低；这些结果为通过基因工程手段提高作物光合效率的遗传育种提供了科学根据。

转玉米C_4型pepc水稻成熟胚为外植体的水稻悬浮细胞系的优化

为了研究外源玉米光合作用关键酶C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)基因在C3植物水稻中提高光合效率的分子机理,本研究以高表达玉米C4型pepc水稻(PC)和未转基因野生型Kitaake(WT)为材料,探索高效且稳定水稻悬浮细胞系建立的方法。结果表明:PC成熟胚愈伤组织的诱导培养基中添加2mg/L2,4-D和1mg/L6-BA,可出诱导出高频的愈伤组织;再通过3次继代培养(2～0.5mg/L2,4-D,2～0.2mg/L6-BA,1mg/LABA),逐步降低2,4-D和6-BA的浓度,可获得了疏松、颗粒状且分散的愈伤组织块;然后转接到水稻悬浮细胞液体培养基中(0.5mg/L2,4-D,0.2mg/L6-BA和1mg/LABA),在28℃下培养,新原液的比例为3:1,经42d,可建立稳定且高效的供试水稻悬浮细胞系。

转C4型PEPC基因水稻非生物胁迫耐受性研究进展

作物在生长过程中会遇到很多非生物胁迫,如高温、高光强、干旱以及土壤盐碱化等,严重影响着作物产量潜力的发挥。水稻作为一半以上人类的主食以及模式植物,其对逆境信号分子的感受和响应作用机制一直是植物科学研究的热点之一。而高表达转玉米C 4型PEPC基因水稻显著增强了水稻的耐逆特性,作为表现耐逆优势的植物材料,在不同非生物胁迫有系列报道。文章对该水稻材料在形态、产量、生理生化及分子方面的变化特点以及其在响应非生物逆境下信号分子、转录因子、靶基因以及激素的作用机制等方面进行了总结,以期为进一步阐明水稻的耐旱机理提供参考依据。

5-氮杂胞苷对高表达转玉米C_(4)-PEPC基因水稻耐旱性的影响

为了揭示DNA甲基化在高表达转C4-PEPC基因水稻植株对干旱耐性的作用,以高表达转玉米C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因(C4-PEPC)水稻(PC)和受体Kitaake(WT)为材料,通过发芽、水培和盆栽试验,研究了施用不同浓度的DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷(5-azaC)联合干旱处理下,水稻芽期、苗期和生育后期,种子发芽率,苗期叶片的相对含水量、丙二醛、脯氨酸、总可溶性糖及其组分及总可溶性蛋白含量、PEPC酶活性以及C4-PEPC、与蔗糖非发酵1(SNF1)相关蛋白激酶(SNF1-related protein kinase 1s,SnRK1s)基因以及甲基转移酶基因表达的变化、剑叶的光合参数,并最后考察产量构成因子的变化,结果表明:5-azaC对水稻芽期和苗期干旱胁迫作用浓度呈现剂量效应,即低浓度促进,而高浓度抑制,其中作用浓度:芽期<苗期;而对芽期和苗期有促进和抑制的2个浓度外施于水稻生育后期的水稻植株后,则出现恶化的效应,表现为矮化、剑叶的净光合速率和单株产量下降。在缓解干旱抑制的浓度下,PC苗期的缓解效果好于WT,这种差异的表现与其内源蔗糖、SnRK1s基因以及OsMET1b的表达差异同步,而且PC叶片C4-PEPC表达对不同浓度的5-azaC处理也呈现剂量效应。综上,DNA甲基化参与了水稻干旱响应,但不同生育期表现不同,其中糖信号在调节DNA甲基化增强PC干旱耐性起重要作用。

共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体

用根癌农杆菌共转化的方法将pSB130/CK质粒[目的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK)与筛选标记潮霉素抗性基因HPT分别构建于2个T-DNA区]导入水稻恢复系R299,经PCR、Southern检测,筛选到T0代13个转基因植株。对T1～T3代转基因后代进行PCR跟踪鉴定,分离出无潮霉素抗性基因的转基因植株(PEPC+PPDK+HPT-),分离株系比率为15%～21%,分离株系中PEPC+PPDK+HPT-型单株分离频率为7.2%～10.0%。在T3代成功获得了无筛选标记的转基因纯合系3个(06D351,06D352和06D353),PEPC酶活性和光合速率分析结果表明,其PEPC活性比对照提高了1.5～4.9倍,光合速率提高了19%～40%,说明这些转基因纯系材料在水稻高光效育种上具有很大的应用价值。

转PEPC＋PPDK双基因水稻的光合特性

【目的】系统研究ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性,证明ATP是增强转C4基因水稻光合能力的关键因子。【方法】以原种和转PEPC+PPDK双基因水稻为材料,进行了PCR检测,C4光合酶活性的测定。通过ATP处理后,分析了光、温—光合曲线和活性氧代谢有关指标,统计分析了相关的产量构成因素。【结果】原种中虽有全套的C4光合酶,但活性很低。PCR检测出玉米的PEPC和PPDK基因转入普通水稻后,转PEPC+PPDK双基因水稻高表达了C4光合酶活性。在高光和高温条件下,同未施ATP的相比,ATP处理后转PEPC+PPDK双基因水稻光合速率分别提高17%和12%。在光氧化条件下,耐光氧化能力进一步增强,产量提高15%。【结论】ATP处理后,转PEPC+PPDK双基因水稻增强了光合生产力,表明ATP是设计类似C4水稻的关键因子。

C_4转基因水稻秧苗叶片气孔与叶鞘维管束结构特征

目的探明C4转基因水稻高光效的生物学结构基础。方法以已导入玉米C4光合关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸磷酸二激酶(PPDK)、NADP-苹果酸酶(NADP-ME)和PEPC+PPDK的转基因水稻为材料,以其受体品种Kitaake(WT)为对照,运用扫描电镜观察了秧苗叶片气孔与叶鞘维管束结构,运用透射电镜观察叶肉细胞。结果与对照品种相比,转C4单基因水稻叶片气孔密度提高、面积增大,PPDK气孔密度和气孔面积都居各转基因品系之首;转C4双聚合基因(PEPC+PPDK)水稻叶片气孔密度提高、面积减小;C4转基因水稻各品系叶片叶肉细胞中叶绿体基粒堆密集,有些基粒类囊体沿长轴方向排列整齐、完整;C4转基因品系的叶鞘均比对照品种粗壮坚韧;除PPDK外,所有转基因品系叶鞘的内外侧维管束及其导管管腔、筛管等执行物质运输功能的组织结构的面积均大于对照品种。结论C4转基因水稻叶片气孔多、面积大以及叶鞘维管束结构发达是C4转基因水稻高光效实现的结构前提和基础,与秧苗高的干物质积累相一致。

转PEPC基因水稻种质的稳定光合生理特性

本文运用稳定和放射性碳同位素研究了第8代转PEPC基因水稻,并测定其光合速率和荧光特性。结果表明,该种质为C3植物,但C4原初光合产物增多,表现出C4光合特性有所改善;转PEPC基因水稻种质已稳定,为我国的高光效育种提供了一个新的种质资源。

模拟干旱胁迫对转C_4双基因水稻幼苗光合功能及部分抗氧化酶活性的影响

为了探究转玉米C4双基因水稻抗旱性,以野生型恢复系水稻R299及其转PEPC&PPDK基因水稻恢复系纯合品种R2P为材料,木村B营养液培养至3叶1心。对两种水稻在20%浓度(质量体积比)PEG6000(聚乙二醇)模拟干旱条件下光合及相关生理生化指标的变化进行了比较。结果表明:在正常木村B营养液水培条件下,转基因株系R2P的叶绿体超微结构、光合及其相关生理指标与R299相比,未见明显差异;但在20%PEG6000模拟干旱条件下,两种水稻之间显示出了明显的变化,表现为R2P的光合速率、C4光合酶活性、SOD(超氧化物歧化酶)活性、Pro(游离脯氨酸)含量均显著高于R299,叶绿体超微结构较R299稳定,而MDA(丙二醛)含量、O2·-(超氧阴离子)产生速率显著低于R299。说明转C4双基因水稻抗旱性增强,光合及抗氧化系统在PEG6000模拟干旱条件下能保持相对较高的稳定性。

转C_4光合基因水稻特征特性及其在两系杂交稻育种中的应用

对pepc、ppdk和pepc +ppdk三种转基因水稻农艺性状观察表明 ,与原种Kitaake相比单株有效穗有不同程度的增多 ,单株产量相应提高 ,特别是pepc和ppdk基因聚合后 ,单株有效穗和单株产量分别比受体亲本Kitaake提高 2 9.1%和2 7.0 %。三种转基因材料作基因供体分别与受体光敏核不育系培矮 6 4S、2 30 4S和 2 30 6S杂交后 ,这些基因在新的遗传背景下不仅稳定遗传和高水平表达 ,而且表现增穗增产 ,特别当pepc和ppdk基因聚合时 ,与受体相比 ,F1的PEPC活性提高 5 .8～ 18.6倍 ,PPDK活性提高 0 .5～ 1.3倍 ,植株饱和光合速率提高 5 0 %左右。转育的转基因材料结实率有所降低 ,是值得进一步研究的问题。

铝胁迫对转C4磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因水稻光合作用和活性氧代谢的影响

以转C4 Ppc基因水稻为材料,利用叶绿素荧光技术和酶学手段,调查铝胁迫对转C4 Ppc基因水稻光合作用和活性氧代谢的影响。结果表明,在铝胁迫条件下,转C4 Ppc基因水稻的叶绿素含量、光合速率、叶绿素荧光参数Fv/Fm、φPSⅡ、qP和qN下降幅度显著小于野生型。可见在铝胁迫的条件下,转C4 Ppc基因水稻仍表现出较高的光合效率。铝处理导致水稻活性氧含量的增加,但由于转C4 Ppc基因水稻活性氧清除酶SOD、POD和CAT含量显著高于野生型,表现出较低的膜脂过氧化。上述结果表明,C4 Ppc基因的导入显著提高了水稻的耐铝特性。

转玉米C_4光合酶基因水稻株系中的光合C_4微循环

用转PEPC、PPDK、NADP ME、PEPC +PPDK等酶基因的水稻株系及原种野生型 (WT)为材料 ,研究了不同基因型水稻叶片中的C4光合微循环及其功能。用外源OAA或MA饲喂叶切片或离体叶绿体后 ,光合放氧速率在野生型水稻中增加了 5 0 % ,在NADP ME 和PPDK 转基因水稻中增加了 5 0 %～ 5 4 % ,在PEPC 和PEPC +PPDK 转基因水稻中增加了10 0 %～ 15 0 %。证明原种水稻Kitaake叶片中具有一个原初的和有限的C4光合微循环 ,除PPDK基因、NADP ME基因外 ,外源PEPC基因或PEPC +PPDK双基因导入原种水稻Kitaake后 ,可大幅度提高C4光合微循环的运行。水稻中C4光合微循环的增强有降低光呼吸速率 (Pr)、增加净光合速率 (Pn)的作用 ,在光能利用上 ,可增加PSⅡ光化学效率 (Fv/Fm)、光化学猝灭 (qp)、降低非光化学猝灭 (qN)的作用 ;

PLD途径合成的PA增强高表达转玉米C_4型pepc水稻悬浮细胞中PEPC酶活性

为了研究外源信号分子对高表达玉米C_4型pepc酶活性的调节机制,本实验以高表达玉米C_4型pepc水稻(PC)和原种水稻Kitaake(WT)的悬浮细胞系为材料,研究葡萄糖、胡蜂蜂毒肽(mastoparan,Mas)及其磷脂酸(phosphatidicacid,PA)的两个合成途径的专一性抑制剂(磷脂酶D(phospholipaseD,PLD)的专一性抑制剂正丁醇和磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)的专一性抑制剂新霉素)对供试材料PEPC活性的影响。结果表明,3%葡萄糖处理0.5h对WT的PEPC酶活性抑制最明显;相对于PC,则5%的葡萄糖处理5h时,对其PEPC酶活性抑制的最明显。5mmol/L的Mas对WT和PC悬浮细胞的PEPC酶活性分别抑制了约60%和40%。0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L新霉素处理对WT的PEPC酶活性影响不明显,且无时间效应;与WT相比较,不同浓度的新霉素均增强了PC的PEPC酶活性,其中0.1mmol/L新霉素处理增加为对照的约7倍。正丁醇处理明显抑制了WT的PEPC酶活性,但不同浓度处理之间却没有显著差异;而对于PC,0.02%、0.04%正丁醇处理使得PEPC酶活性显著下降,且比WT的更显著。同时0.04%的正丁醇的抑制效应具有明显的时间效应。以上结果表明,对PC的PEPC酶活性的调节主要依赖于由PLD途径产生的PA的参与。

低浓度NO对高表达转玉米C4型pepc水稻光合的促进

为了揭示C3植物中C4pepc高表达带来的生理差异与其高光合效率的关系。本文以高表达的转玉米C4pepc光合基因水稻(PC)及原种Kitaake(WT)为材料,通过水培在孕穗期通过根吸入的方法,进行不同浓度的NO供体、NO合成抑制剂以及相关影响信号分子的试剂单独和联合过夜处理12 h,选取倒二叶研究NO对供试材料净光合速率(Pn),气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(Ci)的影响。结果表明:WT和PC在200μmol·L-1SNP(Sodium ni-troprusside)和1 mmol·L-1 L-Arg(L-Arginine)处理下,Pn分别增加20.8%、10.7%,差异显著(p<0.05);随SNP和L-Arg浓度的增加,其表现不同程度的抑制,与PC相比,WT的Pn抑制更显著(p<0.05),而Gs和Ci的变化则相反(p<0.05);进一步结合200μmol·L-1SNP和1 mmol·L-1L-Arg与SA处理,结果与高浓度的NO供体处理类似;在联合6 mmol·L-1Ca2+螯合剂EGTA处理下,与PC相比,WT的Pn抑制达到极显著水平(p<0.01),Ci的变化则相反(p<0.05)。相关分析结果表明:PC的Pn的高低与Gs的相关性小于WT,PC与WT决定系数分别为0.654 9、0.773 5;而与Ci的相关性则更大些,PC与WT决定系数分别为0.466 5、0.419 6,显示PC可能有不同的调节方式,尤其在低浓度的NO,PC可在Ca2+参与下调节气孔的开放,在气孔关闭的条件下,仍能维持一定的Pn。

转PEPC基因水稻接种固氮菌的效应

利用^(15)N-同位素技术研究转PEPC基因水稻及无PEPC基因水稻在接种不同固氮菌后的光合特性、产量性状和固氮能力的变化。结果表明:接种水稻联合固氮工程菌处理与未接种固氮菌处理相比,转PEPC基因水稻的PEPC活性、PS Ⅱ光化学效率(Fv/Fm)、净光合速率均明显提高,生物学产量和经济产量也相应增加了38.08％和26.86％;与无PEPC基因水稻相比,转PEPC基因水稻能明显提高水稻联合固氮工程菌的固氮效率。这种水稻光合与固氮相互促进的机理值得深入研究。

外源H2O2对孕穗期转C4PEPC水稻及原种光合特性的影响

为阐释转C4PEPC光合基因水稻过氧化物胁迫条件下的光合生理特性,以转PEPC基因水稻(PC)、未转基因原种(Kitaake)为材料,运用Li-6400便携式光合仪观测其在不同浓度外源H2O2处理下的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)以及水分利用率等光合参数的变化。结果发现,与未用H2O2处理的PC相比,PC在0.5～5mmol/LH2O2浓度处理下,其Pn在不同光强下均表现下降,与其Gs的下降一致,这个抑制过程随光强的增加而减弱,而50mmol/LH2O2处理下PC,虽Gs增加,但是其Pn并没有增加,表现不同H2O2的浓度效应;而未转基因水稻则没有上述表现,推测PC可能通过低浓度的H2O2参与气孔运动的调节,从而影响其光合特性。