转PRSV复制酶基因T_2代番木瓜植株的抗病性测定

转PRSV复制酶基因的番木瓜植株,其自交及杂交二代植株经PCR检测和Southern blot杂交的结果表明:目的基因整合在番木瓜的染色体上.人工接种PRSV的Ys、Vb、Sm株系于分子检测阳性的7～8叶期植株,转基因植株均表现高抗.在定植田间的9个月中,转基因植株无一发病,而对照则全部发病.

复制缺陷重组腺病毒有效转染兔心包组织的实验研究

目的 观察腺病毒载体转染兔心包组织的有效性和外源性基因表达的时相性。方法 用第五代腺病毒粘粒(Adv5-CAG)为对照组或含β半乳糖苷酶基因的第五代腺病毒质粒(Adv5-CAG/LacZ)为实验组转染兔心包组织,转染后第3、7、14、28 d取被转染组织行β-半乳糖苷酶(X-gal)染色及β半乳糖苷酶活性检测。结果 X-gal染色显示实验组转染后第3、7、14、28 d注射部位心包组织均见蓝染,尤以第7 d最明显,而对照组心包组织均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示实验组转染后第3 d心包组织中即有β-半乳糖苷酶表达,7、14 d达高峰,28 d表达量明显减少。结论 重组腺病毒载体可有效地转染兔心包组织,外源性基因在兔心包组织中能够表达并能维持1个月左右。

正链RNA病毒复制蛋白的分子生物学研究进展

综述了复制蛋白的几个关键的结构域(解螺旋酶的功能区,依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)的核心区域,类似糜蛋白酶的蛋白酶区域,转甲基酶结构域)的结构特点、功能和基因表达方式,以及复制酶基因在抗病毒工程中的应用.

双特异性启动子调控条件复制腺病毒载体的构建

目的 构建并鉴定既能在人端粒酶反转录酶（hTERT）启动子调控腺病毒早期区域1A（E1A）基因,又能在胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子引导入钠碘转染体（hNIS）基因的腺病毒载体.方法 采用免疫印迹分析检测人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87、人神经胶质瘤细胞U251和人胚肺成纤维细胞MRC-5细胞感染病毒前自身GFAP和端粒酶蛋白的表达情况.通过PCR扩增获得hTERT启动子、GFAP启动子及hNIS基因,采用基因合成腺病毒E1A基因.采用hTERT和GFAP启动子重组质粒转染MRC-5、U251、U87细胞,转染24 h后应用荧光分析法检测hTERT启动子及GFAP启动子的启动活性.再将上述特异性启动子分别与E1A基因和hNIS基因连接,最后插入穿梭质粒pDC311中,构建重组质粒pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS,并应用EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切及测序鉴定.将pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS与骨架腺病毒质粒pBHGlox△E1-3Cre共转染人胚肾293细胞,得到条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后,分别感染293、MRC-5、U87和U251细胞,利用病毒空斑形成实验检测条件复制腺病毒的复制能力.使用重组腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS及Ad-CMV-EGFP（对照）感染U251、U87及MRC-5细胞后,采用γ计数器测定由hNIS基因介导的摄125I能力.结果 在U87和U251细胞中,均有相对分子质量120000的端粒酶和49000的GFAP蛋白的表达,在MRC-5中,则无表达.GFAP启动子和hTERT启动子能引导目标基因胶质瘤靶向性表达,启动效率分别为U87细胞中（62.10±6.26）％和（49.24±1.73）％,U251细胞中（59.75±34.36）％和（37.31±16.86）％.限制性内切酶能将质粒pDC311-Tp-E1A-Gp-NIS酶切成3252、5500 bp的片段,经测序鉴定后与预计序列一致.成功构建的Ad-Tp-E1A-Gp-NIS条件复制腺病毒,在U87和U251细胞能很好的产生病毒颗粒,在293细胞也能实现复制,但是在MRC-5细胞中则无病毒产生.U251和U87细胞感染Ad-Tp-E1A-Gp-NIS后均具备了较明显的摄125I能力,约为对照组的93.4倍和107.1倍[（60 679.42±635.61）cpm/100 mg比（656.67±9.25） cpm/100 mg,（69 593.10±1842.89）cpm/100 mg比（660.63±16.01）cpm/100 mg,均P＜0.05].MRC-5细胞感染后与对照组比较则未见明显的125I摄取[（649.67± 13.66）cpm/100 mg比（649.67± 13.66） cpm/100 mg,P＞0.05].结论 构建的条件复制腺病毒Ad-Tp-E1A-Gp-NIS具有良好的条件复制能力,并可以摄125I介导放射性碘治疗.

腺病毒介导VEGF和HO-1联合治疗缺血随意皮瓣的实验研究

目的探讨复制缺陷型腺病毒介导的血管内皮生长因子（VEGFl65）和血红素氧化酶（HO—1）联合应用，对提高大鼠超长随意皮瓣成活面积的影响和作用机制。方法将25只健康纯种成年雌性SD大鼠的背部两侧各设计－6cmx1cm大小随意皮瓣。皮瓣远端皮下分别注射日的基因联合应用组（Ad—VEGFl65＋Ad—HO－1）、基因对照组（Ad—VEGFl65）、基因对照组（Ad—HO—1）、绿色荧光蛋白基因对照组（Ad－11B—GFP）、病毒保存液（Ad—buffer）为空白对照组，共5组。术后7d，分别测量皮瓣的成活面积、HE染色及目的蛋白和CD31免疫组化表达情况及皮瓣新生傲血管密度（MVD）检测等。结果目的基因联合应用组皮瓣成活面积、目的蛋白表达及MVD与其他4组比较，其差异有显著统计学意义（P〈0．01）。结论以复制缺陷型腺病毒为载体，联合应用VEGF和HO－1基因治疗能显著增加大鼠随意皮瓣的成活面积，促进皮瓣存活。