转WYMV-Nib8基因抗黄花叶病小麦的农艺性状

与一般作物相比,转基因作物在目标性状得到改良的同时,其他农艺性状可能会受到影响。前期研究发现,与受体小麦扬麦158相比,转WYMV-Nib8基因小麦N12-1对小麦黄花叶病具有较强抗性。为了明确N12-1的生存竞争能力及在长江中下游麦区的生态适应性,在2017—2018年以转基因小麦N12-1及其受体扬麦158和3个当地主栽品种扬麦11、宁麦13、宁麦14为比较对象,对小麦的主要农艺性状(基本苗数、株高、穗数、粒数、穗粒数、千粒质量)和对主要病害的抗性进行研究。2年的试验结果表明,N12-1与扬麦158的基本苗数、穗数、粒数无显著差异,但N12-1显著矮于其受体扬麦158,而穗粒数显著高于扬麦158。N12-1与当地主栽品种扬麦11相比,株高、穗粒数、千粒质量有显著差异,其他性状无显著差异;N12-1与宁麦13仅在株高上有显著差异,其他性状均无显著差异;N12-1与宁麦14仅千粒质量有显著差异,其他性状均无显著差异。转基因植物与受体之间对赤霉病、纹枯病的抗性均无显著差异。研究结果可为该转基因小麦申请安全证书提供基础。

瞬时转染后WAF1基因对肠癌细胞株Hct/8的生物学效应

目的 :探讨外源基因 WAF1的转染、表达活性和生物调控作用。方法 :采用脂质体转染技术将外源基因 WAF1转入 Hct/ 8细胞 ;经免疫荧光染色和流式细胞仪分别监测外源基因的表达和对细胞分化增殖、细胞凋亡的调控作用。结果 :外源基因 p2 1 WAF1/CIP1- pc DNA3在 Hct/ 8细胞阳性表达为 89.6% ,显著高于空质粒对照和空白对照组 ( P<0 .0 1 ) ;转染 48h后细胞分裂减慢 ,2 4～48h凋亡指数开始增高 ,72 h达到高峰 ,以后逐渐下降。结论 :克隆的外源基因 WAF1具有表达活性及诱导 Hct/ 8细胞凋亡的作用 ,揭示

人质子感知受体TDAG8基因的克隆、表达载体构建及瞬时转染293T细胞

克隆了人质子感知受体TDAG8基因,构建了TDAG8基因的表达载体并瞬时转染293T细胞,检测了TDAG8的过表达。从人胃癌组织cDNA中克隆了TDAG8基因,亚克隆到pEASY-T1载体,通过测序、酶切、连接到表达载体pEGFP-N3,通过酶切、测序鉴定获得了pEGFP-N3-TDAG8重组质粒;表达载体以lipofectamine2000介导转染了293T细胞。Real time PCR法检测了外源基因在293T细胞中的表达。结果表明:克隆到了TDAG8基因并获得了pEGFP-N3-TDAG8表达载体,在293T细胞中检测到了表达过的TDAG8基因。

α_1—干扰素基因转移的鼠腺癌细胞可致CD8^+T细胞介导的肿瘤排斥及诱导抗肿瘤免疫

自发性、侵袭性和转移性鼠乳腺癌细胞（TS／A-PC)可以通过逆转录病毒载体转染分泌鼠α1-干扰素基因．几乎所有的分泌α1-干扰素基因的TS／A细胞克隆(TS／A．IFN-α)存小鼠的生长受抑制，只能形成小的肿瘤，而单纯的TS／A细胞或仅转染对照细胞(I／A·TC)则能在皮下形成大的肿瘤结节，这种对肿瘤的抑制排斥主要能通过CD8^+T淋巴细胞和多形核细胞介导．

p21Cip1基因对V_(79-8)细胞周期的影响

为了探讨缺乏可测出Ｇ１、Ｇ２期Ｖ７９－８细胞株的细胞周期失调的分子机理，构建了人的周期负调控基因ｐ２１Ｃｉｐ１的可表达重组质粒ｐＸＪＳＣ，转染该细胞系，建立了高表达ｐ２１的Ｖ７９－８－ＳＣ细胞。以３ＨＴｄＲ放射自显影法，流式细胞光度术，细胞增殖曲线测定及免疫印迹技术，检测及比较了与细胞周期变化和增殖有关基因的表达，发现该细胞较对照细胞Ｖ７９－８－ｎｅｏＧ１期明显延长，Ｇ２期也稍有增加。与此同时，Ｇ１期调控的ｃｙｃｌｉｎＤ１、ＣＤＫ４、Ｉｄ基因表达明显下降，Ｇ２期调控基因ｃｙｃｌｉｎＢ１的表达也有所下降。结果表明：此细胞系的细胞周期缺陷可能由于ｐ２１Ｃｉｐ１。

中嘉8号杨树转Bt植株的分子检测

用分子生物学方法对中嘉8号杨树转BtCry1A基因株系进行了检测和鉴定。通过PCR、ELISA和SDS-PAGE等实验证实,BtCry1A基因不仅存在于中嘉8号杨树基因组中,而且获得了较高的表达。PCR阳性植株Bt毒蛋白含量平均为3.32 ppb,Bt毒素蛋白分子量约为130 kD。实验结果表明,课题组前期获得的中嘉8号杨树转Bt植株具有进行生物测定和大田释放试验的价值。

稳定表达IL-8基因宫颈癌SiHa细胞株的建立及鉴定

目的建立高效、稳定表达IL-8基因的人宫颈癌pcDNA3.1-IL-8-SiHa细胞株。方法利用pcDNA3.1(+)真核表达载体构建pcDNA3.1/IL-8表达载体,利用基因克隆技术将IL-8cDNA基因片段通过脂质体转染入人宫颈鳞癌SiHa细胞中,经G418筛选获得稳定表达的细胞克隆,建立了高表达IL-8的pcDNA3.1-IL-8-SiHa宫颈癌细胞株,转染阳性细胞连续传代培养,传8代后用RT-PCR,ELISA,免疫细胞化学法进一步鉴定细胞中IL-8的表达。结果成功建立了持续高表达IL-8的pcDNA3.1-IL-8-SiHa细胞株,并在细胞中检测到IL-8mRNA及蛋白的高表达。结论高效表达IL-8基因的SiHa细胞株的建立有助于研究IL-8基因在宫颈癌发生发展中的作用。

应用TNF基因转染细胞进行的肿瘤实验性免疫疗法(英文)

基因修饰的肿瘤细胞所分泌的TNF(肿瘤坏死因子)能够主要通过诱导机体的抗肿瘤免疫反应而使机体产生强大的抗肿瘤免疫功能,这一效应的发挥需要肿瘤局部TNF的持续的存在并具有剂量依赖性,同时不应伴有全身性毒副作用.在体内,分泌TNF的肿瘤细胞局部浸润的细胞主要是巨噬细胞及CD4^+和CD8^+T淋巴细胞,由于在有效的抗肿瘤免疫反应中必需巨噬细胞及CD8^+T细胞的参与,CD4^+T细胞似为无辜旁观者细胞.肿瘤细胞所分泌的TNF在T细胞缺陷鼠中也有一定作用,但大多数资料表明T细胞对于肿瘤细胞的完全清除是必需的.根据所选择的肿瘤细胞类型及转染细胞所分泌的TNF水平,TNF所引起的实验动物全身性毒副作用包括恶液质及消瘦、部分体内实验结果表明,TNF基因转染的肿瘤细胞不仅不能抑制肿瘤细胞的生长,反而会促进肿瘤的转移.将TNF基因转染的肿瘤细胞制备的瘤苗也不能使机体对亲本肿瘤的侵袭产生保护性免疫反应.

siRNA-pool抑制大鼠脊髓背角神经细胞TDAG8的表达

目的观察siRNA-pool对大鼠脊髓背角神经细胞(rat neurons-dorsal spinal cord cells,RNdsc)上T细胞死亡偶联基因8(T-cell death-associated gene 8,TDAG8)表达的影响。方法设计并合成针对TDAG8的siRNA 3对(siRNA63、siRNA341、siRNA897)及一条带绿色荧光标记的阴性对照siRNA。在阳离子聚合物纳米粒jetPEITM介导下转染RNdsc。RNdsc细胞随机分为正常(normal)组,载体(vehicle)组,阴性对照(mismatch)组,siRNA 50、100、200 pmol组。转染24 h后,荧光显微镜下计算转染复合物的转染效率,用MTT法检测转染复合物的细胞毒性,采用real-time PCR及Western blot测定siRNA-pool的干扰效率。结果采用jetPEITM作为转染介质转染效率高达98.9%。转染复合物的细胞毒性低,各组细胞成活率差异无统计学意义。siRNA 50、100、200 pmol可剂量依赖性地抑制TDAG8的表达,siRNA200 pmol组对TDAG8 mRNA表达的抑制率达88%,对TDAG8蛋白的表达抑制率达73%。结论 siRNA-pool能高效地抑制RNdsc上TDAG8的表达。

转铁蛋白-多聚乙烯亚胺体外转染小鼠骨肉瘤细胞的实验研究

目的评价转铁蛋白-多聚乙烯亚胺(transfertin-polyethylenimine,Tf-PEI)靶向性转染小鼠骨肉瘤细胞的可行性,并确定最佳的转染条件。方法以Tf-PEI为载体,将绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞,用荧光显微镜及荧光素酶检测系统检测其转染效率。以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI,并观察它对转染效率的影响。结果Tf-PEI可以高效的、靶向性的转染小鼠骨肉瘤细胞。当N/P比值为5时,Tf-PEI的转染效率最高。游离转铁蛋白能够显著的拮抗Tf-PEI的转染。结论Tf-PEI是一种高效率、低毒性、肿瘤靶向性的基因转染载体,它可以作为体外恶性肿瘤基因治疗试验的一个有效工具。

结肠癌组织中MEG8、TGM2 mRNA的表达变化及其意义

目的观察结肠癌组织中长链非编码RNA(lncRNA)母源性表达基因8(MEG8)、转谷氨酰胺酶2(TGM2)mRNA的表达变化,并探讨其意义。方法采用实时荧光定量PCR法检测85例份结肠癌组织及其癌旁正常组织MEG8、TGM2 mRNA,分析两者间及其与结肠癌临床病理参数、患者预后的关系。结果结肠癌及其癌旁正常组织MEG8 mRNA相对表达量分别为0.62±0.23、1.87±0.55,TGM2 mRNA相对表达量分别为2.03±0.95、0.98±0.36,两者比较,P均<0.05。MEG8、TGM2 mRNA表达均与结肠癌TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。结肠癌组织中MEG8 mRNA和TGM2 mRNA表达呈显著负相关(r=-0.798,P<0.05)。MEG8 mRNA高表达者5年总生存率为77.78%(35/45)、生存时间为(43.62±8.31)个月,低表达者分别为52.50%(21/40)、(31.07±7.25)个月,两者比较,P均<0.05;TGM2 mRNA高表达者5年总生存率为54.55%(24/44)、生存时间为(37.21±9.68)个月,低表达者分别为78.49%(32/41)、(49.18±8.76)个月,两者比较,P均<0.05。结肠癌患者预后Cox回归模型分析显示,高级别TNM分期、有淋巴结转移、MEG8 mRNA低表达、TGM2 mRNA高表达是影响结肠癌患者预后的危险因素(P均<0.05)。结论结肠癌组织中MEG8 mRNA呈低表达,TGM2 mRNA呈高表达,两者表达均与TNM分期、淋巴结转移有关,检测两指标有助于评估疾病病情及患者预后。

鼻咽癌细胞中表达的人白细胞介素18(hIL-18)对鼻咽癌患者外周血CD8^+T细胞细胞毒活性增强作用的研究

目的:探讨人白细胞介素18在鼻咽癌细胞中的表达能否提高鼻咽癌病人外周血CD8+T细胞的杀伤活性以及作用途径。方法:构建人白细胞介素18的真核表达载体pcDNA3．1(-)/HIL-18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE;以转染的SUNE细胞和未转染的 SUNE细胞为靶细胞,以鼻咽癌患者外周血的 CD8+T细胞为效应细胞,混合培养 12h,用 LDH释放法测定 CD8+T细胞的细胞毒活性;用免疫组化法测定混合培养物中 CD8+T细胞上 Perforin、Fas－L、Granzyme B的表达。结果:所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL-18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL-18的含量为(85±10)pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL-18的含量低于5pg/ml。将表达hIL－18的SUNE细胞与鼻咽癌患者外周血CD8+T细胞混合培养12h后,CD8+T细胞的细胞毒活性显著增强(P＜0．111),尤其是当效应细胞/靶细胞为10:1时,CD8+细胞对转染的SUNE细胞的裂解率高达46．7%,而CD8+T细胞对未转染的SUME细胞的裂解率仅为4．6%。免疫组化法表明,这种杀伤活性的增强与CD8+T细胞表达Perforin有关,而与Fas-L和Granzyme B途径无关。结论:hIL-18能显著增强鼻咽癌患者外周血口CD8+T细胞的体外杀伤活性,这种杀伤活性与 CDS8+细胞表达Perforin有关。

稳定高效表达p21^(WAF1/CIP1)的HCT/8-WAF1细胞株的建立

目的 :建立高效、稳定表达 p2 1 WAF1/ CIP1大肠癌细胞株 HCT/8- WAF1。方法 :应用阳离子脂质体分别将带有目的基因 WAF1的 pc DNA3及空白 pc DNA3质粒转染大肠癌细胞株 HCT/8,经G41 8进行阳性筛选 ,将筛选的阳性细胞连续传代培养 ,应用免疫荧光技术监测 p2 1 WAF1/ CIP1的表达。结果 :经 G41 8筛选后 ,空白对照细胞全部死亡 ,转染目的基因及空质粒组的细胞存活 ,可连续传代培养 30代以上 ,并选择 HCT/8作对照 ;免疫荧光技术监测 p2 1 WAF1/ CIP1表达结果显示转染目的基因的 HCT/8细胞 p2 1 WAF1/ CIP1表达阳性细胞率 ( 89.96% )显著高于转染空质粒组 ( 8.0 2 % )和空白对照组 ( 3.39% ) ( F=1 6 60 8.99,P<0 .0 0 1 ) ;各代间差异无显著性 ( F=2 .1 71 ,P>0 .0 5 )。结论 :HCT/8- WAF1是一株高效、稳定表达 p2 1 WAF1/

MEG8、TGM2在胃癌组织中的表达及临床意义

背景胃癌(gastric cancer, GC)是常见恶性肿瘤之一,发病率、死亡率均排在全国、乃至全世界前列,是影响人类健康的重要问题.目前仍缺乏GC早期诊断、治疗及GC预后相关的基因靶点.目的探讨母源性表达基因8(maternally expressed gene 8,MEG8)及转谷氨酰胺酶2(transglutaminase2,TGM2)在GC组织中的表达及临床意义.方法通过荧光定量聚合酶链式反应检测30对GC及癌旁组织中MEG8、TGM2表达情况,分析表达情况与GC患者临床病理特征相关性,通过摘录Oncomine数据库中相关研究数据,分析TGM2表达差异性及与GC患者的生存状态的相关性.结果MEG8在GC组织中的表达量低于癌旁组织(0.462±0.082 vs 1.048±0.149), TGM2在GC组织中的表达量高于癌旁组织(1.202±0.143 vs 0.742±0.083),差异具有统计学意义(P <0.05);MEG8表达与年龄、临床分期有关(P<0.05), TGM2表达与临床分期有关(P <0.05);T G M2表达高低与G C患者生存状态无关(P>0.05).结论MEG8、TGM2参与GC的发生发展过程,可作为GC诊断及预后的潜在靶点.

CD86对CD8^+T细胞分化的影响

目的 探讨CD86 (B7 2 )对CD8+ T细胞分化的影响。方法 用限制性内切酶XhoⅠ酶切质粒pCDM8得到CD86基因 ,并将其插入pCDNA3,用BamHⅠ酶切鉴定。用脂质体法介导pCDNA3 CD86真核表达载体转染人肝癌细胞株HMC772 1,6 0 0 μg mLG4 18筛选 ,稳定且高表达CD86的抗性克隆用流式细胞仪进行鉴定。从健康志愿者血中分离外周血单个核细胞 (PB MC) ,使PBMC与靶细胞之比为 2 0∶1,共同培养 4 8h后 ,用流式细胞仪检测CD3+ T细胞内IL 4和IFN γ的表达率。结果 成功构建pCDNA3 CD86真核表达载体 ;CD86在HMC772 1 CD86细胞中的表达率为 30 .8% ,而在HMC772 1细胞中的表达率为 0 .98% ;健康志愿者CD3+ T细胞内IL 4和IFN γ的表达率分别为 1.92 %和 2 4 .4 % ;PBMC与靶细胞共同培养 4 8h后 ,无论是否用IFN α刺激 ,IL 4 IFN γ的阳性比值在HMC772 1 CD86转染组均大于 1,而在HMC772 1未转染组均小于 1。结论 在细胞培养中 ,CD86可诱导CD8+ T细胞活化 。

自噬对效应型CD8^+ T细胞存活及形成记忆型细胞必不可少

目前,自噬对于在体形成记忆型CD8＋T细胞的作用尚未明确,作者发现,在急性感染中,自噬在病毒特异性的CD8＋T细胞中是动态变化的,而之前的研究多表明自噬伴随TCR的激活而增加。作者证明自噬对于病毒特异性CD8＋T细胞的存活以及进一步形成基因型T细胞是必不可少的。

核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其表达

目的:构建人核心蛋白聚糖(decorin,DCN)真核表达载体,并在人结直肠癌HCT-8细胞中进行表达,以研究其抗肿瘤作用。方法:以克隆有完整人DCN基因片段的质粒pBluescript为模板,采用聚合酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因片段。真核表达载体pcDNA3及PCR产物经XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切后连接,转化大肠杆菌JM109,获得重组载体pcDNA-DEC,进行酶切鉴定和测序鉴定。脂质体lipofectamine介导重组载体转染HCT-8细胞,经G418(800μg/mL)筛选建立稳定转染细胞株。采用免疫组化法检测转染后HCT-8细胞中DCN的表达。MTT法检测HCT-8细胞的增殖活力。结果:PCR扩增获得与预期大小一致、约1 000 bp的特异性DNA片段;重组载体pcDNA-DEC经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。免疫组化结果显示在稳定转染的HCT-8细胞株中可见DCN蛋白表达。细胞生长曲线显示转染DCN的HCT-8细胞生长较对照组减慢。结论:成功构建DCN真核表达载体pcDNA-DEC,并获得稳定转染的HCT-8细胞株,为进一步研究DCN抗肿瘤作用奠定基础。

人源性ApoE4基因转染PC12细胞株建立及麦芽酚铝对其细胞活力影响

目的建立人源性载脂蛋白E4(ApoE4)基因转染的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12细胞(以下简称"PC12细胞"),探讨麦芽酚铝对该细胞株细胞活力的影响。方法将携带有人源性ApoE4基因重组慢病毒载体转染PC12细胞株,用嘌呤霉素进行筛选,获得ApoE4稳定过表达PC12细胞株(PC12-ApoE4组)和阴性空载体对照PC12细胞株(PC12-NC组)。采用实时荧光定量聚合酶链反应法分别检测PC12组、PC12-NC组、PC12-ApoE4组细胞的R-Apo E和(或)H-Apo E-FLAG的mRNA相对表达量,以鉴定构建效果。分别用浓度为0.00、100.00、200.00和400.00μmol/L的麦芽酚铝溶液对PC12-ApoE4组和PC12组细胞染毒24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率。结果 PC12-ApoE4组、PC12-NC组细胞荧光显微镜下均可见荧光表达,提示转染成功;PC12组细胞未见荧光表达。PC12组细胞R-Apo E基因、PC12-NC组细胞R-Apo E基因、PC12-ApoE4组细胞H-Apo E-FLAG基因的mRNA的相对表达量的中位数分别为1.00、1.01和148.74;其中,PC12组与PC12-NC组细胞R-Apo E基因的mRNA的相对表达量均低于PC12-ApoE4组细胞H-Apo E-FLAG基因(P<0.01)。麦芽酚铝染毒后,细胞存活率在染毒剂量及细胞类型的主效应以及交互效应上均有统计学意义(P<0.01);其中,麦芽酚铝在0.00~400.00μmol/L浓度下,随着染毒剂量的增加,2种细胞的细胞存活率均降低,均呈剂量-效应关系(P<0.01)。结论成功构建稳定表达人源性ApoE4基因的细胞株。麦芽酚铝和ApoE4基因对PC12细胞存活率的影响存在交互作用,ApoE4基因可增强麦芽酚铝对PC12细胞的细胞毒性。