转cry1Ac/cpti基因水稻对土壤酶活性和养分有效性的影响

【背景】转基因作物可能通过根系分泌物和植株残体组成的改变对土壤酶活性和养分转化产生影响,转基因作物对土壤质量的影响是其环境安全性评价的重要方面。【方法】本研究通过田间定位试验分析了连续3a种植2种转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻后,土壤酶活性和养分有效性等土壤质量性状的变化。【结果】在水稻各生育期内,除齐穗期转基因稻科丰8号(GM1)田的土壤酸性磷酸酶活性显著(P<0.05)高于其受体非转基因稻明恢86(CK1)外,转基因稻GM1、GM2(Ⅱ优科丰8号)的土壤酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和脲酶活性与对应非转基因稻CK1、CK2(Ⅱ优明恢86)间均无显著差异。同时,在水稻生长过程中,土壤pH、有机质、有效氮、有效磷和速效钾等土壤理化指标在GM1和CK1或GM2和CK2间也均无显著差异。【结论与意义】连续3a种植转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻并未改变稻田土壤中主要营养元素的有效性及其相关土壤酶活性,即短期内种植转cry1Ac/cpti双价抗虫基因水稻不会影响土壤酶活性和养分状况。该结果为进一步评价转基因水稻的生态风险提供了一定的依据。

转cry1 Ac/cpti基因水稻对土壤氨氧化细菌群落组成和丰度的影响

【背景】氨氧化细菌是驱动硝化作用的关键微生物,其群落多样性变化对土壤氮素转化具有重要意义。转基因作物可能通过根系分泌物和植株残体组成的改变对土壤微生物群落产生影响。【方法】本研究通过田间定位试验,利用特异引物进行PCR-DGGE(聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳)和荧光定量PCR,分析了种植转cry1 Ac/cpti双价抗虫基因水稻第3、4年土壤中氨氧化细菌群落组成和丰度的变化。【结果】水稻各生育期(分蘖期、齐穗期和成熟期)内,转cry1 Ac/cpti基因杂交稻Ⅱ优科丰8号(GM)的土壤氨氧化细菌16S rRNA基因群落组成、多样性指数与其对应的非转基因杂交稻Ⅱ优明恢86(CK)间均没有显著差异;以DGGE条带为基础的氨氧化细菌群落组成的冗余分析(RDA)显示,GM和CK的土壤氨氧化细菌群落组成只与水稻生育期存在显著相关性(P=0.002和0.018);同时,水稻各生育期内土壤氨氧化细菌16S rRNA基因丰度在GM和CK间也没有显著差异,但均随水稻生长而变化且在齐穗期达到最高(P<0.05)。【结论与意义】稻田土壤氨氧化细菌的群落组成与丰度在水稻不同生育期存在差异,但在转cry1 Ac/cpti基因水稻和非转基因水稻间没有显著差异,即一定时期内种植转cry1 Ac/cpti抗虫基因水稻不会影响土壤氨氧化细菌的群落组成和丰度。

转cry1 Ac/sck基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落影响的评价

以转cry1Ac/sck双基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4(对照:MH86)及其杂交稻KF6-304(对照:Ⅱ-YM86)为材料,系统地研究了转基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落的影响及生态安全性。结果表明:在群落水平上,转基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304对稻田寄生蜂的物种丰富度、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数的总体情况与时间动态以及个体总数无明显负面影响,但在生长中期转基因稻可降低稻田寄生蜂的个体数量。按寄生蜂功能团分析,MSA与MSA4在水稻生长发育的后期初始,提高卵寄生蜂的数量,MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304显著降低以靶标害虫稻纵卷叶螟为寄主的寄生蜂功能团的个体数量,对其他寄生蜂无明显负面影响。

转sck+cry1Ac基因水稻对二化螟及二化螟绒茧蜂存活和生长发育的影响

在实验室研究了转sck+cry1Ac基因水稻(MSB)对二化螟Chilosuppressalis(Walker)生长、存活以及经寄主对二化螟绒茧蜂Apanteleschilonis(Munakata)生物学特性的影响。连续取食转sck+cry1Ac基因水稻的二化螟,体重下降、死亡率上升,从第2天开始,其体重显著低于取食明恢86的对照组;从第6天开始,死亡率极显著高于对照组。二化螟取食MSB36h后移至对照水稻上继续取食3、6、9、12天后,死亡率与对照差异都不显著;但体重均低于对照,其中第3天的体重差异达显著水平。二化螟绒茧蜂分别以取食MSB一定时间的3、4、5龄二化螟幼虫为寄主时,寄生率均低于以对照组,其中对4龄幼虫的寄生率差异显著;结茧率与对照差异均不显著;寄生在取食MSB的5龄二化螟幼虫体内的蜂、蛹期显著长于对照,而所结茧的茧长显著短于对照;但卵-幼虫历期、每茧块茧数、羽化率、雌性率、成蜂寿命和前翅长与对照无显著差异。结果表明转sck+cry1Ac基因水稻不仅对二化螟生长和存活有显著影响,而且可经寄主二化螟影响到二化螟绒茧蜂的一些生物学特性。

抗虫基因cry1Ab/Ac在水稻杂交转育后代中的表达效应

以转入了Bt基因cry1Ab/Ac的水稻品系TT51为供体,与10个恢复系杂交。通过分子检测,并结合田间的抗虫性观察,筛选出农艺性状良好的转基因纯合株系。抗虫基因在所有的杂交组合后代中按照孟德尔规律遗传,但是不同遗传背景下的表达量有很大差异。Cry1Ab/Ac蛋白含量维持原有水平的株系对螟虫表现出良好的抗性,蛋白含量降低的株系则受到轻微的危害。纯合株系的部分农艺性状发生变异,其程度与Cry1Ab/Ac蛋白含量有关。结果为利用杂交转育培育优良抗虫水稻提供依据。

泥鳅生长及抗氧化-解毒酶系统对水体中转Cry1Ab/Ac基因水稻残遗物的响应

在泥鳅养殖水体中添加稻秆粉模拟水稻残遗物生境,研究了泥鳅生长和肝胰脏抗氧化酶(SOD、CAT)与解毒酶(GST)活性对转Cry1Ab/Ac基因水稻‘华恢1号’(HH1)的响应。设计以HH1稻秆粉10 mg·L?1、50 mg·L?1、100 mg·L?1和200 mg·L?1 4个梯度浓度处理泥鳅为试验组,以非转Bt基因水稻‘明恢63’(MH63)稻秆粉处理组为阴性对照,不加稻秆粉的基础饲养组为空白对照。结果显示:在4种稻秆粉浓度下,HH1组与MH63对照组泥鳅的特定生长率、肥满度、内脏系数及SOD、CAT和GST酶活性均无显著差异(P>0.05);与空白对照比较,稻秆粉浓度升高对泥鳅生长的抑制逐渐增强,当浓度达到200 mg·L?1时,HH1组和MH63对照组泥鳅的特定生长率、内脏系数与CAT活性降低。研究结果表明,水体中低含量的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻HH1稻秆粉对泥鳅的生长与生理酶活性没有明显影响,高浓度HH1和MH63稻秆粉均使泥鳅的生长和生理酶活性显著降低,这可能与养殖水体中浓度较高的悬浮稻秆粉妨碍了泥鳅的呼吸和滤食,及稻秆粉的分解降低了水体p H和溶氧量有关。

转cry1Ac1基因抗虫水稻和非转基因亲本的主要营养成分比较

秀水134-Bt是以秀水134为受体材料,通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法导入抗虫基因cry1Ac1获得的转基因纯合品系。对转cry1Ac1抗虫基因水稻秀水134-Bt与其原亲本秀水134稻米的关键营养成分进行比较分析,包括对水分、脂肪、粗灰分、粗蛋白、氨基酸、脂肪酸、矿物质和维生素的测定分析等。结果表明,转基因水稻秀水134-Bt与非转基因亲本秀水134非常相似,在关键性营养成分上差异不明显。表明在水稻遗传转化操作过程中,T-DNA插入并未明显改变原亲本的上述品质性状。

转融合基因Cry1Ab/Ac水稻稻杆对泥鳅蛋白水解酶和乙酰胆碱酯酶活性的影响

为探索转Bt抗虫水稻对泥鳅的毒性作用,采用水体中添加不同浓度(10、50、100、200 mg/L)的转融合基因Cry1Ab/Ac水稻华恢1号(HH1)稻杆粉饲养泥鳅,非转基因亲本明恢63(MH63)作对照,不加稻杆粉为空白对照,分析了对泥鳅蛋白水解酶、乙酰胆碱酯酶(AChE)的影响。研究发现:经4个浓度处理后,泥鳅的胃蛋白水解酶、肠蛋白水解酶和脑AChE、肝脏AChE、肌肉AChE与对照组泥鳅相比均无显著差异(n=3,P>0.05)。高浓度(200 mg/L)HH1、MH63组泥鳅胃蛋白水解酶与空白对照相比均显著降低(n=3,P<0.05);低浓度(10 mg/L)HH1组泥鳅肝脏AChE与空白对照差异显著(n=3,P<0.05);不同浓度HH1、MH63稻杆粉对泥鳅的肠蛋白水解酶、脑AChE和肌肉AChE均无显著影响(n=3,P>0.05)。结果表明:HH1水稻稻杆粉对泥鳅的消化道蛋白酶和乙酰胆碱酯酶没有影响,而水体中高剂量的HH1或MH63稻杆粉均会降低泥鳅胃的消化能力。

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻TT51-1中外源基因多重PCR检测方法

针对转cry1Ab/cry1Ac基因抗虫水稻(Oryza sativa L.)TT51-1及其回交后代中外源基因的检测建立了一种三引物多重PCR检测方法。结果表明,三引物PCR体系可以准确区分cry1Ab/cry1Ac基因纯合、杂合和阴性三种基因型,纯合体中只扩增出一条298 bp片段,阴性材料中只扩增出一条787 bp片段,杂合体中同时扩增出298 bp片段和787 bp片段。该体系的建立为利用TT51-1进行抗螟虫水稻分子育种提供了一个简便有效的基因鉴定技术。

转BtCry1Ac基因107杨生长分析

以4个7年生转BtCry1Ac基因107杨无性系及其未转基因对照为材料,对河北深州市、枣强县和盐山县3个地点营建的对比试验林进行调查,对其生长进行分析,探究外源基因的转入对其生长产生的影响。结果表明,转基因株系间平均树高、胸径、材积无显著差异,但均显著低于未转基因对照。转基因株系在不同试验林生长量表现不同,枣强试验林与盐山、深州试验林在生长量方面均存在显著差异,盐山试验林表现最好,枣强试验林平均树高、胸径、材积仅为盐山的86.5%、84.8%、65.1%。多点联合方差分析表明,株系与地点之间互作明显。转基因株系与对照树高、胸径、材积方面,在速生期、年平均最大生长量等时期较为相近,生长模式基本相同。

转cry1Ac基因抗虫水稻环介导等温扩增检测方法的建立及应用

为了方便快速地检测转cry1Ac基因抗虫水稻的转基因成分,本研究以转cry1Ac基因水稻‘华恢1号’为主要研究对象,根据环介导等温扩增技术的原理,针对人工改造的cry1Ac晶体蛋白毒素基因的6个区段设计4条特异性引物,在65℃条件下,利用链置换DNA聚合酶等温扩增1h,分别通过荧光显色和凝胶电泳完成对转基因作物的检测工作,同时对2种转基因作物和5种非转基因作物进行LAMP检测以检验该方法的特异性。结果表明,该LAMP方法能有效地检测含有cry1Ac的转基因作物,检测结果与常规PCR方法结果一致,灵敏度是PCR方法的10倍,达到0.01%,并且具有高特异性,表明该检测方法适合转cry1Ac基因抗虫作物的快速检测。

转Cry1Ab/Ac基因水稻对稻田底栖动物群落的影响

转Bt基因抗虫水稻的成功研发,为有效控制鳞翅目害虫对水稻的危害提供了一条最为有效、经济的途径。稻田底栖动物群落是转Bt基因抗虫水稻的重要非靶标生物。为了解转Bt基因水稻对稻田底栖动物群落的安全性,以转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻‘华恢1号’(简写为HH1)为材料,以其非转基因亲本‘明恢63’(简写为MH63)为对照,以稻田底栖动物群落为指示生物,运用群落学方法,通过连续2年在江西南昌的大田试验,研究了转Cry1Ab/Ac基因抗虫水稻对稻田底栖动物群落的影响。结果显示:2012年在HH1与MH63的稻田中分别采集到底栖动物22种与25种,其中两生境中相同物种19种,两群落物种组成相似度为0.808 5,有7种优势种,优势种相似度为0.833 3。2013年在HH1与MH63稻田中分别采集到底栖动物26种与28种,两类稻田相同底栖动物22种,两群落物种组成相似度为0.814 8,有6种优势种,优势种相似度为1.000 0。2012年与2013年群落总体分析与时间动态分析均显示,两类稻田中底栖动物的物种丰富度、个体数量、多样性指数、均匀性指数及优势集中性指数变化趋势相似,且均无显著差异。结果表明:连续种植2年转Cry1Ab/Ac基因水稻HH1对南昌稻田底栖动物群落无明显的负作用。

转cry1 Ab/cry1 Ac基因籼稻对稻田节肢动物群落影响

将稻田节肢动物群落按营养关系划分为 5个功能团 ,即植食类、寄生类、捕食类、腐食类和其它类 ,从功能团优势度、功能团内科组成及其优势度、群落主要参数及群落相异性等方面 ,经两年四点的调查就 2个转cry1Ab cry1Ac基因籼稻(Bt水稻 )品系TT9 3和TT9 4对稻田节肢动物群落的影响作了较系统评价。植食类、寄生类和腐食类功能团内某些优势科的优势度在Bt水稻田与对照 (IR72 )田之间有时呈显著或极显著差异 ,如Bt水稻田中茧蜂或姬蜂科的优势度有时明显低于对照。但是 ,在大多情况下Bt水稻田与对照田之间功能团优势度、功能团内科组成及其优势度、群落主要参数 (物种丰富度、Shannon Wiener多样性指数、均匀性指数、优势集中性指数 )及其时间动态基本无明显差异 ;Bt水稻田与对照田间植食类、寄生类、捕食类亚群落和整个节肢动物群落的相异性大多较低。可见 。

转修饰cry1 Ac基因籼稻明恢81经花药培养获得抗虫DH系

对基因枪法获得的明恢 81转修饰的cry1Ac基因当代植株进行花药培养 ,共接种花药 2 6 0 0枚 ,获得 83份花培植株 ,其中双倍体植株 43份 ,单倍体植株 40份。PCR结果表明含有cry1Ac基因的植株 5 5份 ,花培植株群体中转基因与非转基因植株的比值为 2∶1(5 5 2 8)。进一步结合Southernblot和ELISA分析 ,于花培植株当代筛选到转基因纯合株系 36份。外源蛋白表达量上 ,花药来源于同一克隆的DH系的不同植株之间基本一致 ,最高的Cry1Ac含量达 0 2 5 %。田间抗虫性试验表明 ,经花药培养纯合获得的部分转基因纯合系植株对二化螟 (Chilosuppressalis)表现出高抗 ,而且主要农艺性状保持不变。以上结果表明水稻花药培养可以加速转基因的纯合与育种利用。

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

采用ELISA 方法研究了Bt 棉花叶片中Cry1Ac 杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明,不同环境下Bt 杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中,Bt 杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快,经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态(含量50 ng·g-1左右)。高温低湿条件下,Bt 杀虫蛋白降解较快,达到稳定水平的时间短。Bt 杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac 蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速,30 d 后降解了85%左右。随着冬季的到来,杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后,杀虫蛋白的降解加快,至4 月下旬检测不到Bt 杀虫蛋白。

转cry1 Ab基因水稻中毒蛋白的表达、分泌及其在土壤中的残留

研究了转cry1Ab基因水稻 (克螟稻 )中Cry1Ab毒蛋白的表达、根系分泌及其在土壤中的残留规律 .结果表明 ,分蘖始期至成熟期 ,克螟稻地上部和根部中的Cry1Ab毒蛋白的表达量 (FW)分别为 3 2 3～ 8 2 2 μg/ g和 0 6 8～ 0 89μg/g .生育期间克螟稻根系分泌的Cry1Ab毒蛋白含量仅为 1 6 6～ 4 8 0 2ng/ (株·d) .试验证实 ,克螟稻根际土中的Cry1Ab毒蛋白残留含量低于检测限 (<0 5ng/ g干燥土 ) .生物测定还表明 ,克螟稻根际土及其提取液对棉铃虫初孵幼虫和 3龄幼虫不产生致死性效应 .相对于Cry1Ab毒蛋白的根系分泌转移 。

转Btcry1Ab基因水稻对稻田弹尾虫种群数量的影响

以转Btcry1Ab基因水稻克螟稻1号(KMD1)和克螟稻2号(KMD2)及其亲本非转基因水稻秀水11(XS11)为材料,于2003年9月和翌春4月,调查了KMD1和KMD2对水稻灌浆期和收割后休田期稻田土表落叶层中弹尾虫种群数量的影响.结果表明,KMD植株表达的cry1Ab杀虫蛋白可在稻田环境中残留160d以上;在水稻灌浆期采用吸虫器法在稻田落叶层中采集到灰橄榄长角跳虫(Entomobrya griseoolivata)和钩圆跳虫(Bourletiella christianseni)等2种弹尾虫,其中灰橄榄长角跳虫在KMD1和KMD2稻田中的种群密度显著高于XS11稻田;在水稻收割后休田期采用网袋法采集到灰橄榄长角跳虫、钩圆跳虫、球角跳虫(Hypogastrura matura)和等节跳虫(Isotoma monochaeta)等4种弹尾虫,其中转Bt基因水稻稻田中的灰橄榄长角跳虫和球角跳虫的种群密度显著高于XS11稻田,且其植株组织残体生物量损失率显著高于XS11.

水稻叶色白化转绿及多分蘖矮秆突变体hfa-1的基因表达谱分析

hfa-1的白化转绿、多分蘖矮秆表型受单隐性核基因hw-1(t)控制。该基因编码含线粒体交替氧化酶AOX结构的叶绿体蛋白,通过参与叶绿体呼吸电子传递链,对类胡萝卜素生物合成途经及其次生代谢途径进行调控。本研究对hfa-1突变体叶色白化转绿过程中的类胡萝卜素生物合成途径、与该途径有关的植物激素代谢途径的相关基因进行表达分析,并分析了hfa-1突变体在白化、转绿2个时期的基因表达谱。结果表明,类胡萝卜素、植物激素(GA、ABA和SL)生物合成相关基因在hfa-1突变体白化期叶片中表达量减低,暗示hw-1(t)基因的突变抑制了苗期类胡萝卜素合成,同时还对涉及该过程相关多个次生代谢途径产生影响。通过基因表达谱芯片和功能分类分析,发现hfa-1叶色白化转绿过程中上调和下调表达基因涉及的生理过程主要在光合作用、应对内源刺激物和胁迫响应等方面;其中电子传递体Cytb6/f复合蛋白合成相关基因上调表达明显,推测Cytb6/f蛋白复合体在电子传递和质醌库还原氧化上对hw-1(t)起一定的补偿功能。

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。

转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎生长发育的影响

测定了转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎的致死作用及生长发育的影响。结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫具有一定程度的控制作用,但不理想;转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫的生长发育有较大的影响,表现为使各虫态发育历期延长,化蛹时间和羽化时间延长,幼虫虫体质量和蛹质量减轻,化蛹率和羽化率明显降低。