转hGM-CSF基因骨髓基质细胞在体外扩散盒中的表达

目的 研究转人粒 巨噬细胞集落刺激因子 (hGM CSF)基因骨髓基质细胞系在体外扩散盒中的表达。方法 采用阳离子脂质体介导法将构建好的真核表达载体pIRESIneo hGM CSF导入人骨髓基质细胞系HFCL ,建立转基因人骨髓基质细胞系HFCL hGM CSF ,用Southernblot和Northernblot方法分别检测其基因组DNA整合和mRNA转录 ,并将其移入体外扩散盒中 ,用ELISA法检测其蛋白表达量。结果 Southernblot和Northernblot分析表明hGM CSF基因已整合到HFCL细胞基因组DNA中 ,在mRNA水平上可以检测到其表达 ,移入扩散盒的HFCL hGM CSF细胞稳定分泌hGM CSF ,量为 5 1 6± 0 5ng 10 6 细胞 天。结论 转hGM CSF基因骨髓基质细胞可以在体外扩散盒中持续稳定表达hGM CSF 。

环境因子对转hGM-CSF基因鱼腥藻生长与光合的调节

以转hGM-CSF基因鱼腥藻7120为对象,分别探讨了温度、pH、光强等环境因子和外加碳、氮等基本营养源对转基因藻生长与光合活性的影响.结果表明:当基本环境因子为30℃、pH9.5和90μmol·m-2·s-1光强时,转基因藻生长最快.添加10mmol·L-1的NaHCO3或5g·L-1的葡萄糖对转基因藻的光合活性促进最大;但外加氮源却抑制了转基因藻的光合活性.

90份转BT基因抗虫棉品种(系)在新疆早熟棉区的适应性评价

【目的】评价转BT基因抗虫棉品种(系)的适应性与应用价值,为棉花新品种的选育提供适合的亲本。【方法】以90份转BT基因抗虫棉为材料,研究其农艺性状和品质性状的变异情况及相关性,并以主要农艺性状和品质性状对90份转BT基因抗虫棉进行主成分和聚类分析。【结果】供试90份转BT基因抗虫棉品种(系)纤维品质、农艺性状间差异显著,其中44份转BT基因抗虫棉为早熟材料,46份转BT基因抗虫棉为中早熟材料;前5个主成分特征值均大于1,累计贡献率达71.62%,第1主成分与产量有关,第2主成分与纤维品质有关,第3主成分与植株性状有关。90份转BT基因抗虫棉划分为4个类群,第Ⅰ类群籽指性状表现好;第Ⅱ类群断裂比强度、伸长率较好;第Ⅲ类群单株铃数、铃重、衣分较高;第Ⅳ类群纤维品质较好。【结论】筛选出了G21-2、G21-14、G21-1、G21-77等综合性状优异、铃重均在5.00 g以上、衣分在42%以上的转BT基因抗虫棉品种(系)18份。

转抗虫基因107杨对根际和内源细菌群落的影响

为研究转抗虫基因对根际和内源细菌群落的影响,以转抗虫基因107杨田间对比试验林为对象,采用高通量测序技术对转基因株系和对照株系根际土壤细菌、树干韧皮部和根系内生细菌群落结构组成及多样性进行对比分析。结果显示:(1)土壤样品中有效序列平均在30000以上,杨树组织有效序列平均在300000以上。(2)转基因株系细菌物种组成与对照株系的极其相似,酸杆菌门与变形菌门为转基因和非转基因株系根际土壤的优势菌门,占比分别为16.6%和21.9%;蓝藻菌门和变形菌门为转基因和非转基因株系韧皮部的优势菌门,所占的比率分别为54.8%和59.2%;变形菌门为转基因和非转基因株系根部的优势菌门,所占的比率分别为40.7%和58.8%。(3)转基因和非转基因株系在细菌群落的丰富度和多样性上均没有表现出明显的差异,但不同部位之间差异显著。结果表明:转基因107杨没有对根际土壤和内生细菌造成显著影响,明确了转抗虫基因107杨不同部位细菌群落特征,为转抗虫基因107杨的生物安全评价提供了有益的参考。

NT3基因转染对噪声性耳聋的影响研究

目的验证阳离子脂质体介导神经营养因子3(Neurotrophin-3,NT3)基因转染对噪声致豚鼠耳聋的保护作用。方法选取广西医科大学动物实验中心提供的60只健康花色黑目豚鼠为研究对象,按随机数字表法分为5组,每组12只(实验过程中部分动物死亡,实际实验数据按每组10只统计)。Ⅰ组未受噪声影响,Ⅱ组注入人工外淋巴液未受噪声刺激,Ⅲ组注入人工外淋巴液后受噪声刺激,Ⅳ组在注入空质粒后受噪声刺激,V组在注入含NT3基因的质粒后受噪声刺激。噪声为4 kHz的稳态白噪声,强度100 dB,8 h/d,连续10 d,休息5 d,再通过听性脑干反应(Auditory Brain-Stem Response,ABR)测试和免疫组织化学染色来评估听阈变化和耳蜗螺旋神经节细胞中NT3蛋白的表达情况。结果V组ABR阈值高于Ⅰ、Ⅱ组,但低于Ⅲ、Ⅳ组,差异有统计学意义(P均<0.05)。耳蜗螺旋神经节细胞处NT3蛋白表达量以V组较其余各组更高,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论NT3基因转染后阈值增幅减小,听功能受损有一定程度减轻,对噪声致豚鼠耳聋具有一定程度的保护作用。

昆虫对杀虫剂和转Bt基因植物的抗性进化机制研究进展

为防治昆虫对农作物的危害,采取了喷施杀虫剂和种植转Bt基因抗虫植物等措施。然而,杀虫剂的大规模使用和转Bt基因抗虫植物的大面积连续种植使得一些靶标昆虫产生了抗性进化,这不仅影响防治效果,而且还影响整个农业生态系统服务功能。本文综述了昆虫对化学杀虫剂、微生物杀虫剂和转Bt基因植物产生抗性的分子机制。昆虫对化学杀虫剂的抗性进化机制主要是靶标位点敏感性下降和解毒酶系活性增强;对微生物杀虫剂的抗性进化机制主要是免疫系统激活和共生菌群变化;对转Bt基因植物的抗性进化机制主要是昆虫中肠结合受体基因突变或表达下调和中肠蛋白酶活性降低。为了减缓昆虫抗性进化和提高杀虫剂效率,未来建议减少使用化学杀虫剂,合理利用杀虫谱广和活性高的微生物杀虫剂以及抗虫植物等方法系统治理农业害虫。

不同遗传背景的转Cry1C基因玉米品系的室内抗虫性鉴定

以转Cry1C基因的转基因玉米C492为供体,通过回交转育的方式将目标基因分别导入不同遗传背景的玉米自交系,获得转基因玉米自交系C492/N-76、C492/N202、C492/S273、C492/DH1901和C492/DH1904,采用室内离体组织生测的方法研究各品系对玉米螟和草地贪夜蛾的抗虫性。结果表明:转基因玉米C492和5个不同遗传背景自交系均表现出高抗玉米螟,虽对草地贪夜蛾的抗性有一定差异,但接虫6 d后幼虫死亡率均达到80%以上。这说明转基因玉米C492和5个不同遗传背景自交系可用于抗虫转基因玉米新品种培育,具有较好的商业化应用前景。

基因编辑在转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病治疗中的进展

转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病(ATTR-CM)是由于不溶性转甲状腺素(TTR)蛋白在心肌中沉积引起包括心脏传导异常以及心力衰竭等在内的多种并发症。既往对ATTR-CM的治疗只针对ATTR-CM的并发症如心力衰竭、心律失常等进行治疗,缺乏针对病因治疗的有效药物。近年来,随着TTR的稳定剂如氯苯唑酸及RNA干扰(SiRNA)药物如patisiran等问世,使ATTR-CM的治疗真正进入了病因治疗的时代。基因组编辑技术是有别于传统药物治疗机制的新方法,是通过CRISPR/Cas9工具对目标基因编辑,从而实现从蛋白到临床表型的改变。在ATTR-CM的小动物模型中已证实,通过CRISPR/Cas9基因编辑可有效降低TTR蛋白在组织中的沉积。小样本的临床研究也取得了和动物实验相似的结果,可能为未来ATTR-CM的治疗带来革命性影响。本文对目前基因编辑技术治疗ATTR-CM的进展作一综述。

转BtCry1Ac基因107杨生长分析

以4个7年生转BtCry1Ac基因107杨无性系及其未转基因对照为材料,对河北深州市、枣强县和盐山县3个地点营建的对比试验林进行调查,对其生长进行分析,探究外源基因的转入对其生长产生的影响。结果表明,转基因株系间平均树高、胸径、材积无显著差异,但均显著低于未转基因对照。转基因株系在不同试验林生长量表现不同,枣强试验林与盐山、深州试验林在生长量方面均存在显著差异,盐山试验林表现最好,枣强试验林平均树高、胸径、材积仅为盐山的86.5%、84.8%、65.1%。多点联合方差分析表明,株系与地点之间互作明显。转基因株系与对照树高、胸径、材积方面,在速生期、年平均最大生长量等时期较为相近,生长模式基本相同。

基因枪介导重组hGM-CSF转移系统的建立及其在人肿瘤细胞中的稳定表达

目的 :建立基因枪介导的基因转移系统 ,为基因修饰的肿瘤细胞疫苗研究奠定实验基础。方法 :采用基因枪转导的方法 ,将真核表达质粒 (pcDNA3 .1GM CSF)转导入人胃癌细胞株 (SGC) ,经G418筛选获得阳性克隆 (SGC GM CSF) ,通过RT PCR方法鉴定 ,重组载体已整合到胃癌细胞的基因组中。结果 :SDS PAGE和Westernblot分析的SGC GM CSF上清液结果显示rhGM CSF主带在 3 0kD左右 ,SGC GM CSF在体外长期培养中保持稳定分泌 ,分泌量达到 2 4h平均 2 47ng 10 6 cell。结论 :建立的基因枪介导的基因转移系统安全、有效 。

转hGM-CSF基因HepG2细胞疫苗侵袭性和生长活性初步检测

目的:探讨经60Co处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗的侵袭性和生长活性变化。方法:体外培养三种肝癌细胞(①野生型HepG2肝癌细胞②转染hGM-CSF基因的HepG2肝癌细胞③60Co射线处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗)采用MTT方法检测三种细胞在24h、48h、72h的OD值并绘出生长曲线;利用transwell小室进行体外侵袭实验来观察上述三种细胞侵袭性;用RT-PCR技术检测上述三种细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)在mRNA水平上表达的变化;结果:经60Co照射处理的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗组OD值在相同培养时间点较其他两组明显变小且差异有显著性(P<0.05)。三种细胞(上述①②③种细胞)transwell侵袭试验显示:③组穿过人造基底膜的细胞数量明显少于前两组;PT-PCR示:③组细胞的MMP-2的mRNA的表达明显低于①②。结论:经过60Co处理过的转hGM-CSF基因的HepG2肝癌疫苗的侵袭性和生长活性均明显降低。

hGM-CSF基因克隆、病毒包转及转染人胃癌、肝癌细胞的研究

hGM-CSF是一种细胞因子．具有对单核巨噬细胞趋化作用及提高它们对肿瘤的吞噬功能，并且能增加粒细胞粘附分子的表达，ADCC杀瘤作用。为了研究hGM-CSF修饰的肝癌细胞，胃癌细胞的方法．我们从人外周血淋巴细胞通过RT-PCR克隆了hGM-CSF基因．鉴定大小后，克隆人pBIuscript和LXSN中，

基于KASP平台的转基因玉米高通量特异性检测方法

为了促进转基因玉米产业化发展,加快优良性状转化体与骨干自交系的转育工作,适用于回交群体的高通量前景选择方法亟待开发。本研究以转基因玉米DBN9936为材料,根据其外源插入片段及其侧翼序列,采用primer5软件设计了6对特异性引物,与内标准基因zSSIIb引物进行组合用于评估,获得最优引物组合后,进一步开展特异性验证、检出限测试和多样品验证。结果显示,最优引物组合为DBN9936-LB1*zSSIIb-k1;10份DBN9936 BC1代种子的KASP基因分型结果与琼脂糖凝胶电泳结果完全一致;10份转化体DBN9858、DBN9501、C0010.1.3、C0010.3.1、C0010.3.7、C0030.2.5、BT11、GA21、MIR162和2A-7的转基因玉米样品在双平台上检测结果均表现为阴性;转基因玉米DBN9936的检出限为10%;48份不同DBN9936杂交种材料的KASP基因分型结果均表现为阳性。综上,本研究方法可用于转基因玉米DBN9936回交转育过程中的前景选择,且样品通量高,为其他农作物在转基因育种过程中的目标基因检测提供了技术参考。

施钾时期对葡萄转色和品质及钾吸收基因表达的影响

【目的】钾肥可促进葡萄果实的提前着色,本研究比较了不同时间施用钾肥对葡萄转色和品质的影响,并从分子水平初步验证了钾肥施用时期对葡萄转色的效果。【方法】以江苏盱眙、浙江天台和浙江金华3个地区的5年生‘夏黑’葡萄为试材,分别在果实膨大后4 (T1)、8 (T2)、12 (T3)、16 (T4)天的上午10:00,沟施120 g/株K2SO4水溶肥,以不施钾肥为对照。在每次处理前观察果实颜色,处理后每隔4天统计果实转色率,并采集30粒果实用于测定果实纵横径、果粒重、硬度、可溶性固形物(SS)、可滴定酸(TA)等生理指标。于施肥处理前1 h (上午9:00),采集葡萄第8~9节位成熟叶片4~5片,用于检测VvKUP1、VvKUP2荧光定量相对表达量。【结果】4个施肥时期沟施120 g/株钾肥后,3个地区施肥处理均促进了葡萄果实提前转色。与对照相比,在江苏盱眙和浙江金华均以T3处理促进着色效果最好,果实分别提前4和8天左右着色,转色率分别达到95.0%和80.6%;在浙江天台以T2处理促进果实着色效果最好,提前4天左右着色,转色率达到83.4%。沟施钾肥可以促进果粒重和纵横径的增加,在江苏盱眙和浙江金华均以T3处理最好,在浙江天台以T1处理最好。在江苏盱眙,4个沟施钾肥处理均提高了果实可溶性固形物含量,T2、T3、T4处理降低了果实硬度;在浙江金华地区,4个施钾处理均降低了果实可滴定酸含量和果实硬度,提高了可溶性固形物含量;在浙江天台,沟施钾肥降低了果实可滴定酸含量和果实硬度,T1、T2、T3处理提高了可溶性固形物含量。通过对不同时期‘夏黑’葡萄叶片中钾吸收基因的表达分析,发现当钾吸收基因VvKUP1表达趋势由下降转为上升,且VvKUP2表达趋势由上升转为下降时,与最适施肥时期相符合。【结论】沟施钾肥可以促进‘夏黑’果实提早着色和果实品质的提高。果实膨大后12天施钾肥在江苏盱眙和浙江金华地区促进‘夏黑’葡萄转色的效果较好,果实膨大后8天施钾肥促进浙江天台地区‘夏黑’葡萄的转色效果较好。葡萄膨大后叶片中两个钾吸收关键基因(VvKUP1和VvKUP2)表达量的变化证明了该时期施钾的必要性。

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染在乳腺癌治疗中的研究进展

乳腺癌全球发病率逐年上升,严重威胁女性健康。近年来,随着生物技术的快速发展,基因治疗在乳腺癌中的研究日益增多。超声靶向微泡破坏作为一种潜在的基因或药物递送系统,既可作为载体,又可增加生物屏障的通透性,从而提高肿瘤的治疗效果,已广泛应用于乳腺癌基因治疗研究。考虑到常规基因载体的固有缺陷,研究者倾向将其与超声靶向微泡破坏技术联合应用以提高基因转染的安全性和有效性。本文对超声靶向微泡破坏技术及其与常规基因载体联合介导基因转染治疗乳腺癌的研究进展做一综述。

三华李ANS基因克隆及其在果实采后转色过程中的表达分析

花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是参与植物组织花青素合成的关键酶。果肉富含花青素是三华李果实的显著特色。本研究首次克隆得到三华李ANS全长cDNA,将其命名为PsANS,并对其在不同组织和果实成熟转色过程中的表达模式进行分析。结果表明,PsANS编码区长度为1074 bp,包含一个长度为217 bp的内含子,可编码一个包含357个氨基酸、分子量为40401.37的蛋白质;该蛋白二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主,亚细胞定位于细胞质中。蛋白互作预测发现,含有ANS结构域的蛋白主要与TT4、DFR、UF3GT、F3H、TT8等存在互作关系。不同植物的ANS蛋白同源性较高,均包含相似的蛋白催化位点;PsANS与同属蔷薇科的欧洲李ANS蛋白的亲缘关系较近。PsANS在不同组织中表达差异较大,果肉中表达量最高。三华李后熟转色过程中PsANS表达呈上升趋势,乙烯处理进一步上调了PsANS的表达,表明PsANS对三华李果实发育和后熟过程中花青素的合成起着重要作用。

RNA靶向和基因编辑药物在转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病中的研究进展

转甲状腺素蛋白(TTR)是一种主要由肝脏合成的四聚体蛋白,可错误折叠并沉积为淀粉样原纤维,沉积于心肌间质导致转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病(ATTR-CM)。ATTR-CM列入中国《第一批罕见病目录》,治疗策略包括阻断肝脏中TTR合成、稳定TTR四聚体和破坏TTR原纤维。氯苯唑酸、二氟尼柳等小分子药物为患者提供新的治疗选择。其中氯苯唑酸成为首个美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗ATTR-CM的药物。小干扰RNA(siRNA)patisiran和反义寡核苷酸(ASO)inotersen阻断肝脏TTR表达,并已批准用于治疗变异ATTR多发性神经病(ATTRv-PN),用于治疗ATTR-CM正在进行Ⅲ期试验,其他siRNA药物vutrisiran和ASO制剂eplontersen临床效果正在评估中。本文介绍RNA靶向治疗药物及使用CRISPR-Cas9进行基因编辑药物的研究进展。

靶向超声微泡介导VEGF基因转染对薄型子宫ER的影响研究

目的:研究靶向超声微泡介导血管内皮生长因子(VEGF)基因转染对薄型子宫内膜容受性(ER)的影响。方法:选择40只性成熟但未交配的具有动情周期的雌性SD大鼠进行研究。将其随机分为四组,包括正常组10只,模型组10只,阴性对照组10只,治疗组10只。其中模型组、阴性对照组及治疗组大鼠均自宫角处注入95%无水乙醇贮留5 min制备薄型子宫模型,正常组自宫角处注入生理盐水,贮留5 min。模型组予以生理盐水注射治疗,阴性对照组予以超声微泡+抗体(不含基因)治疗,治疗组则以靶向超声微泡介导VEGF基因转染治疗。比较四组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量,子宫内膜血流灌注,子宫内膜VEGF及白血病抑制因子(LIF)水平。结果:正常组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组(P<0.05)。正常组阻力指数(RI)、搏动指数(PI)、脐动脉收缩压与舒张压比值(S/D)均低于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组RI、PI、S/D均低于模型组、阴性对照组(P<0.05)。正常组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组(P<0.05)。结论:靶向超声微泡介导VEGF基因转染可有效修复子宫内膜,改善ER,值得临床重点关注。

hGM-CSF基因在哺乳动物细胞中稳定转染表达质粒的构建和鉴定

目的：获得具有天然糖基化结构的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｒｈＧＭ－ＣＳＦ）。方法：采用含ｓＲα启动子和新霉素抗性基因的真核细胞表达载体ｐＭＥｎｅｏ，接上ＸｈｏＩ接头，与ＸｈｏＩ酶切ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段连接，构建了可在哺乳动物细胞中稳定表达的ｐＭＥｎｅｏ－ｈＧＭ－ＣＳＦ质粒。结果：２２个ｐＭＥｎｅｏ重构载体克隆中，８个含有ｈＧＭ－ＣＳＦｃＤＮＡ片段，酶切鉴定插入方向为５个顺式，１个顺式串珠，２个反式。结论：将上述各式以ＤＥＡＥ法转染ＣＯＳ细胞，瞬时表达鉴定，用ＴＦ１细胞ＭＴＴ法测定培养液上清的ｈＧＭ－ＣＳＦ活性，顺式和顺式串珠培养上清活性为１×（１０３～１０４）Ｕ／ｍｌ。

转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病一家系遗传学分析

目的:探讨转甲状腺素蛋白淀粉样变心肌病(ATTR-CM)的遗传学特征。方法:对1例以心肌肥厚所致心力衰竭为主要临床特征的ATTR-CM先证者的临床表型进行分析,通过高通量测序分析转甲状腺素蛋白(TTR)基因突变情况并进行Sanger测序验证。结果:先证者发病年龄较早,临床症状复杂。先证者及其妹妹、侄子、女儿4人存在TTR基因c.A163G(p.Lys55Glu)杂合突变。结论:本研究发现了TTR基因c.A163G(p.Lys55Glu)突变导致的ATTR-CM,异常TTR沉积主要累及心脏,症状复杂且不典型。