棉花黄萎病菌对转hpa1_(Xoo)基因棉花幼苗相对电导率的影响

以两个转hpa1x00基因的棉花株系T一33和T一35及其出发品种即非转基因棉品种Z35的2～3叶期棉花幼苗为试材，通过无底塑料盆钵菌液浇根接菌法，在0～10d不同时段测定叶片浸出液电导率。转基因棉T-34在0～10d间相对电导率呈增加趋势，10d时增加率达到115．90％；T一33在接菌后0～1d间的电导率增幅反而略有下降，但3～10d的增幅均呈现上升趋势，到10d时达到140．61％；Z35从接菌后0～10d的电导率增幅均呈现逐渐上升趋势，到10d时相对电导率增加率达到180．78％。转基因棉到达相对电导率峰值的时间晚于非转基因棉，其峰值也低于非转基因棉；同时两个转基因棉花株系相对电导率的增加率均低于非转基因棉。被黄萎病菌感染后转基因棉的显症时间较非转基因棉出现晚，两个转基因株系的受危害程度也低干非转基因棉。

棉花黄萎病菌诱导转hpa 1 xoo基因棉花产生微过敏防御反应

采用叶片针刺接种法从细胞学方面分析转hpa1xoo基因棉花与棉花黄萎病菌互作产生的微过敏抗病反应。通过细胞显微观察表明,转hpa1xoo基因棉花T-34与非转基因棉花在抗病性细胞表型方面存在明显差异。Trypan Blue染色后,伤口外的叶组织中均有一褐色环形条带,褐色环形条带与伤口坏死部位之间区域的组织细胞出现质壁分离和空腔细胞现象,褐色条带与伤口坏死部位之间的区域在转基因和非转基因棉花之间具有较明显的差异,转基因棉T-34较非转基因棉花品种Z35形成的区域小,说明转基因棉细胞损伤程度较非转基因棉细胞损伤程度低。棉花黄萎病菌侵染叶片后,非转基因棉花叶部伤口周围细胞无微过敏性反应(micro HR),受病原菌侵染的叶片萎蔫程度较重;转hpa1xoo基因棉花叶部伤口周围细胞有微过敏反应,叶部刺伤处仅有较小的坏死斑,且不相连,发病较轻,而清水处理的转基因棉花与非转基因棉花叶片中伤口周围均无微过敏反应,说明病原菌侵染诱导转hpa1xoo基因棉花产生微过敏防御反应,转hpa1xoo基因棉花较非转基因棉花有较强的抗病性。

转hpa1_(Xoo)基因棉花对棉铃虫全基因组转录谱的影响

【目的】明确转hpa1Xoo棉花抗虫性及其作用机制。【方法】采用生测法和芯片技术分析了转hpa1Xoo棉T-34的抗虫性和harpinXoo表达对棉铃虫全基因组转录谱的影响。【结果】饲喂T-34棉叶的棉铃虫发育明显迟缓,棉铃虫死亡率为90.95%,而饲喂其出发品种(Z35)棉叶的棉铃虫死亡率为12.20%。利用和棉铃虫同属鳞翅目的家蚕的23KOligo探针,以分别饲喂T-34和Z35叶片的棉铃虫RNA为模板,制作了棉铃虫Oligo表达谱芯片,获得了24280个EST数据,从中检测到了2927个基因。在T-34和Z35上饲喂的棉铃虫有872个差异表达基因,其中上调基因328个(ratio>2.0),下调基因544个(ratio<0.5)。872个差异表达基因主要涉及13个生物功能、96个代谢通路。【结论】转hpa1Xoo棉花对棉铃虫的抗性涉及棉铃虫蛋白酶分解和合成、ATP合成等多个生物代谢途径的改变。

编码harpin_(Xoo)蛋白的基因hpa1_(Xoo)转化菊花增强对蚜虫的抗性

将水稻白叶枯病原菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae编码harpinXoo蛋白的hpa1Xoo基因构建植物重组表达质粒pCAMBIA3300-hpa1Xoo-bar,由根癌农杆菌Agrobacterium tumefa-ciensLBA4404介导,叶盘法转化寒菊QX-077,获得了草丁膦转基因寒菊株系。经PCR、Southernblot和RT-PCR检测证明hpa1Xoo已整合到寒菊基因组中。在转基因株系的叶片和植株上抗虫性鉴定表明,转基因寒菊显著抑制桃蚜Myzus persicae的繁殖(t<0.01)。RT-PCR表明转基因植株中hpa1Xoo能够在转录水平正常表达。hpa1Xoo转化寒菊可以正常表达并提高寒菊对蚜虫的抗性。

表达hpa1_(Xoo)基因棉花对黄萎病抗性及农艺性状的影响

黄萎病是棉花生产中最具毁灭性病害之一,种植抗病品种是控制黄萎病害最为有效途径之一。本试验通过花粉管通道法将hpa1Xoo基因导入陆地棉品系854,经多代选育获得了可稳定遗传表达hpa1Xoo基因且农艺性状稳定的2个棉花材料854-3、854-5,具有出苗快、长势较好、整齐度高、植株中等、株型松、茎秆毛少光滑、叶片大、叶色深绿、叶功能较好、结铃性较强、铃形较大、吐絮畅等特点。2013—2014年854-3、854-5株高98.0~114.0 cm,单株果枝15.60~18.10个,单株结铃26.90~48.45个,铃质量5.26~5.92 g,衣分39.54%~45.10%,籽棉产量3 186.45~5 023.65 kg/hm^2,皮棉产量1 437.5~1 998.45 kg/hm^2。854-3、854-5黄萎病指数分别为4.23、2.80,均为高抗水平。854-3、854-5纤维上半部平均长度分别为28.78、28.83 mm,断裂比强度分别为27.9、28.4 c N/tex,马克隆值分别为5.67、5.83,伸长率分别为6.3%、6.2%。854-3、854-5纤维外观色泽洁白,手感有弹性,内在品质优良,可为棉花抗病品种选育提供种质或材料。

转Bt-cry1Ac基因棉花叶片中杀虫蛋白在环境中的降解动态

采用ELISA 方法研究了Bt 棉花叶片中Cry1Ac 杀虫蛋白在不同环境条件空气介质中和土壤介质中的降解规律。结果表明,不同环境下Bt 杀虫蛋白降解趋势有明显差异。不同温湿度及光照条件的空气介质中,Bt 杀虫蛋白的降解速度一般在初期较快,经过短暂的缓慢降解阶段后进入相对稳定状态(含量50 ng·g-1左右)。高温低湿条件下,Bt 杀虫蛋白降解较快,达到稳定水平的时间短。Bt 杀虫蛋白在光照和非光照环境下的的降解动态没有显著性差异。自然条件下Cry1Ac 蛋白在土壤介质中初始阶段降解迅速,30 d 后降解了85%左右。随着冬季的到来,杀虫蛋白降解趋于缓慢。次年春天后,杀虫蛋白的降解加快,至4 月下旬检测不到Bt 杀虫蛋白。

转SNC1基因棉花抗枯萎病防御酶活性分析

以转SNC1基因的棉花中35和军棉1号和对应的非转基因棉花叶片为材料,接种棉花枯萎病病菌,以分析与主要抗病性有关的5类防御酶系。接菌后,和对照相比,转SNC1基因棉花和非转基因棉花防御酶的活性变化差异明显。其中,转基因中35的PAL、SOD、POD和PPO酶活性均高于非转基因中35,并且在接菌第2,4天达到峰值,然后随时间增加呈下降趋势,而CAT酶活性低于非转基因中35,随时间增加变化趋势不明显;转基因军棉1号的PAL、SOD、PPO和酶CAT活性变化趋势同转基因中35,而POD酶活性变化趋势却相反,低于非转基因军棉1号。通过本试验表明,以抗病品种和感病品种为受体得到的转基因棉在受到病原菌侵染后,酶活性变化有差异。其中PAL、SOD、PPO和CAT酶活性变化趋势稳定,其酶活性高低可以作为转基因棉花抗病性的生化指标,同时表明SNC1基因的抗病性在陆地棉中得到体现。

转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎生长发育的影响

测定了转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎的致死作用及生长发育的影响。结果表明,与常规棉对照相比,转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫具有一定程度的控制作用,但不理想;转Cry1Ac+Cry2ab基因棉花对小地老虎幼虫的生长发育有较大的影响,表现为使各虫态发育历期延长,化蛹时间和羽化时间延长,幼虫虫体质量和蛹质量减轻,化蛹率和羽化率明显降低。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花对天敌生长发育的影响

以转Cry1Ac基因棉和常规棉品种为对照,系统研究了转Cry1Ac+Cry2Ab棉花对小花蝽、龟纹瓢虫和中华草蛉生长发育的影响。结果表明,和常规棉品种相比,饲喂取食转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉和转Cry1Ac基因棉品种叶片的棉铃虫初孵幼虫使各天敌不同龄期的生长发育历期均有所延长,前者延长的历期短,后者延长的历期长,但差异均未达显著水平。

转Bt Cry1Ac基因抗虫棉花外源基因漂移研究

【目的】研究转Bt Cry1Ac基因棉花外源基因漂移规律,为转基因棉花生态安全性评价提供依据。【方法】2014年在吐鲁番市和2015年在库尔勒市,利用小区试验种植转基因棉花,翌年利用卡那霉素抗性检测结合分子检测的方法检测外源基因的漂移。【结果】在距离转基因棉花小区边缘1~120 m均能检测到含有外源基因Cry1Ac。SGK321种子漂移率最大漂移率是向南方向距离转基因棉花小区边缘1 m处,漂移率为5%;GK19最大漂移率是向西方向达到了10.09%。以方向因素和距离因素建立Cry1Ac基因漂移Logistic回归预测模型,方向和距离对种子漂移都有显著影响(P<0.05),但方向和距离两个因子并不能最终决定外源基因的漂移率。【结论】转基因棉花外源基因漂移率受方向和距离的影响,但最终决定外源基因的漂移率,并不是方向和距离联合作用的结果。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花主要生化物质含量变化及其对棉田昆虫的影响

【目的】新型转基因棉花在进入大规模商业化应用前,需对其生态环境安全性进行评价;同时,经基因改造的新型转基因抗虫棉花可能影响抗虫棉的次生代谢,进而导致一些综合的生态学效应,致使棉花生理上发生改变,这也是转基因植物安全性评价研究的重要内容。【方法】比较了不同关键时期新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花与转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比、主要酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和谷胱甘肽还原酶(GR)]活性、营养物质(蛋白质、氨态氮、脯氨酸和可溶性糖)和次生代谢产物(棉酚和单宁)含量的差异及其对棉田不同昆虫营养层昆虫个体总数和物种数的影响。【结果】棉花生长的蕾期、花期和花铃期,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花、转Cry1Ac基因棉花和非转基因棉花叶片的鲜重、干重和干鲜比呈先升高后降低的趋势;SOD和POD活性在花铃期明显升高,CAT、APX和GR活性无显著变化;蛋白质、氨态氮含量无明显变化,脯氨酸和可溶性糖含量均表现为先升高后下降的趋势;棉酚含量在3个时期无显著变化,而单宁含量呈逐渐升高的趋势。3种棉花叶片中干物质积累、主要酶活性、营养物质和次生代谢产物含量均无显著差异;单株大铃数表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花>转Cry1Ac基因棉花>非转基因棉花,小铃数则表现为转Cry1Ac基因棉花<Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花<非转基因棉花;昆虫群落和害虫亚群落的昆虫个体总数均表现为转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉田<转Cry1Ac基因棉田<非转基因棉田,天敌亚群落昆虫个体总数无显著变化;3种棉田中昆虫群落、害虫亚群落和天敌亚群落的物种数均未发生显著变化。【结论】转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花叶片干物质积累、产量性状、生化物质含量、酶活性在不同生长期表现不同,但上述参数在3种棉花之间无显著差异;且转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花具有较好的抗虫性,能有效降低棉田害虫数量。

转cry1Ab基因棉花质粒标准分子的构建与分析

为缓解转基因检测用标准品严重缺乏的现状,本研究构建了含转基因棉花cry1Ab基因序列及棉花fsACP(fiber-specific acyl carrier protein)内标基因序列的质粒标准分子,经PCR、酶切、测序等方法的验证,证明了所构建质粒的正确性。利用荧光定量PCR技术系统地分析了所建质粒的重复性、特异性、均匀性、均一性和不同温度下处理不同时间的质粒标准分子的稳定性。结果表明,所构建质粒的重复性、特异性、均匀性及均一性良好,质粒溶液在低温条件(70℃、20℃和4℃)下可稳定储存6个月,且具有稳定的质粒量值,不宜高温(20℃和40℃)保存。本研究为质粒标准分子的制备、性状分析及保存环境等相关研究提供了试验依据。

转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂生长发育的影响

研究了取食转Bt-cry1Ac棉花花粉对意大利蜜蜂的影响,主要包括意大利蜜蜂的生长发育、体内酶活性的变化.结果发现,取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂与取食非转基因亲本棉花花粉的蜜蜂(CK)相比,4、5、6日龄幼虫体重差异不显著,幼虫及蛹的历期也没有明显差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂6日龄幼虫体内的谷胱甘肽-S-转移酶、总蛋白酶活力与CK相比,没有显著差异.取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的意大利蜜蜂幼虫体内的α-乙酸萘酯酶、乙酰胆碱酯酶活力极显著高于CK,强碱性、弱碱性类胰蛋白酶活力极显著低于CK,类胰凝乳蛋白酶活力显著低于CK.另外,采用酶联免疫(ELISA)方法在取食转Bt-cry1Ac基因棉花花粉的蜜蜂6日龄幼虫体内能够检测到Bt杀虫蛋白.

转cry1Ac＋cry2Ab基因棉对棉田节肢动物群落的影响

以Bt棉和常规棉为对照,研究了转cry1Ac+cry2Ab棉对棉田节肢动物群落的影响。研究结果表明,转cry1Ac+cry2Ab棉田、转cry1Ac棉田和常规棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的结构与组成无明显差异;转cry1Ac+cry2Ab棉田刺吸类害虫、蛀食类害虫和食叶类害的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田蜘蛛类、瓢虫类和捕食类天敌的数量均低于转cry1Ac棉田和常规棉田;转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的多样性指数与转cry1Ac棉田和常规棉田相比均无明显差异,说明转cry1Ac+cry2Ab棉田节肢动物群落、害虫亚群落和天敌亚群落的稳定性和转cry1Ac棉和常规棉相比均无明显差异。

转Bt基因棉花对烟粉虱天敌昆虫龟纹瓢虫的影响

在实验室控制条件下,以转Bt基因棉花GK12、33B、SGK321上的烟粉虱为食料饲养龟纹瓢虫,研究转Bt基因棉花上的烟粉虱对龟纹瓢虫生长发育及捕食的影响,同时利用Y型嗅觉仪,观察龟纹瓢虫对来自不同类型棉花的棉叶及其烟粉虱的嗅觉反应和视觉反应。结果表明,转Bt基因棉花和对应的常规棉亲本上的烟粉虱对龟纹瓢虫的发育历期和存活率没有明显的影响。龟纹瓢虫对棉花叶片、烟粉虱若虫、蜜露、蜕等4种物质的视觉反应之间没有明显的差异。对4种嗅源物质的嗅觉选择性的大小依次为:烟粉虱若虫>蜕>棉花>蜜露;在两类不同的棉花之间,龟纹瓢虫对GK12、33B、SGK321等3种转基因棉花上的烟粉虱若虫的嗅觉选择性明显较对应的常规棉亲本SM3、33、SY321上的烟粉虱若虫小;对烟粉虱若虫的蜕,两种转单价基因棉花GK12、33B较对应的常规棉亲本上的小,而转双价基因的棉花SGK321上与对应的常规棉之间没有明显的差异。烟粉虱密度大于200头/皿时,龟纹瓢虫捕食转基因棉花上烟粉虱的数量大于对应的常规棉花亲本,但烟粉虱密度小于200头/皿时,龟纹瓢虫捕食转基因棉花上烟粉虱的数量小于对应的常规棉花亲本。龟纹瓢虫对烟粉虱的捕食符合HollingⅡ型反应。龟纹瓢虫取食转基因棉花上的烟粉虱的理论极限值、瞬间攻击率均大于对应的常规棉亲本。

我国3个主产棉区转Bt/CpTI基因棉田根际土壤中Cry1Ab蛋白的降解动态

于2009—2010年棉花种植期,在长江流域、黄河流域和西北内陆3个主产棉区分别选择代表地———江西九江、河南新乡和新疆喀什,采集长期种植转Bt/CpTI棉SGK321及其亲本石远321棉(对照)的棉田根际土壤样品,采用酶联免疫吸附法对根际土壤中Cry1Ab蛋白含量进行残留动态监测。结果显示,在各产棉区棉花蕾期、花期和铃期,转Bt/CpTI棉田根际土壤Cry1Ab蛋白含量大多显著高于对照棉田;而在棉花成熟期,转Bt/CpTI棉田根际土壤Cry1Ab蛋白含量与对照棉田大多无显著差异。长期种植转Bt/CpTI基因棉花不会造成Cry1Ab蛋白在棉花根际土壤中的累积。

转Bt基因棉花中Cry1Ac蛋白经烟粉虱途径向龟纹瓢虫的传递

【目的】烟粉虱Bemisia tabaci是转基因棉的非靶标害虫，对棉花生产造成严重影响。本文探讨转Bt基因棉花中CrylAc蛋白在棉花．烟粉虱一龟纹瓢食物链中的传递规律，以期为转基因棉的环境安全评价提供科学依据。【方法】在实验室条件下，以常规棉SM3号、33、SY321为对照，分析转Bt基因棉花GKl2、XM33B、SGK321叶片、在这些棉花上取食的烟粉虱、以及捕食烟粉虱的瓢虫体内CrylAc蛋白含量。同时，将取食转Bt基因棉花上的烟粉虱的瓢虫转接到对应的受体亲本棉花上，分析瓢虫体内CrylAc蛋白含量变化规律。【结果】在转Bt基因棉花上取食的烟粉虱成虫和若虫以及它们的蜜露中均能检测到CrylAc蛋白，以转Bt基因棉花上的烟粉虱若虫为食料的龟纹瓢虫体Propylaea japonica内也能检测到CrylAc蛋白。龟纹瓢虫取食转Bt基因棉花上的烟粉虱若虫1d后体内即能检测到CrylAc蛋白，并且随着取食时间的延长，体内CrylAc蛋白的含量逐渐增加，但到第6～8天后CrylAc蛋白的含量相对稳定。取食3个不同品种棉花上烟粉虱若虫的龟纹瓢虫体内CrylAc蛋白的含量存在明显差异，这种差异与棉花叶片上表达的CrylAc蛋白量呈正相关。但取食后6d，在3个品种棉花上取食的龟纹瓢虫体内的CrylAc蛋白含量之间没有明显的差异。以转Bt基因棉花上的烟粉虱若虫为食料的龟纹瓢虫转移到对应的常规棉亲本上以后，体内的CrylAc蛋白的含量迅速下降，但10d后仍能检测到微量的CrylAc蛋白。【结论】转Bt基因棉花中的CrylAc蛋白可以通过烟粉虱途径传递到龟纹瓢虫体内，龟纹瓢虫对食料中的CrylAc蛋白具有富集作用，并且CrylAc蛋白的富集存在饱和现象，富集饱和量与食料中的CrylAc含量无关；龟纹瓢虫脱离含有CrylAc蛋白的食料环境后，体内的CrylAc蛋白可以消减，但在10d时间内龟纹瓢虫体内仍会有CrylAc残留。

转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫的控制效果及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾生长发育的影响

为评估转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫Helicoverpa armigera的抗性及对非靶标害虫甜菜夜蛾Spodoptera exigua和斜纹夜蛾S.litura生长发育的影响,采用室内生测法测定其对棉铃虫的抗性及对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾不同龄期幼虫存活率、营养代谢及中肠酶活性的影响。结果表明,转Cry1Ac/1Ab基因棉花对棉铃虫第2代幼虫的抗性程度最高,幼虫校正死亡率达91.33%,但对甜菜夜蛾和斜纹夜蛾的抗性程度较低,幼虫校正死亡率分别为15.33%和13.33%。甜菜夜蛾和斜纹夜蛾各龄期幼虫取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,其存活率与取食常规棉花对照无显著差异;甜菜夜蛾对转Cry1Ac/1Ab基因棉花叶片的相对取食量、近似消化率分别为16.68和93.12%,均高于取食常规棉花对照的10.72和92.00%,但差异不显著,而斜纹夜蛾取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后的各项营养指标均低于取食常规棉花对照,差异也不显著。取食转Cry1Ac/1Ab基因棉花后,甜菜夜蛾的过氧化物酶活性为0.02 U/mg prot,显著低于取食常规棉花的0.05 U/mg prot;斜纹夜蛾的酸性磷酸酶活性为0.15 U/mg prot,高于取食常规棉花的0.10 U/mg prot,但差异不显著,其它中肠酶活性均低于对照,亦无显著差异。

转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉对棉蚜生命表参数及种群动态的影响

为研究新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉对棉蚜Aphis gossypii Glover生命表参数及种群动态的影响。2010—2011年以常规棉中棉所49为对照,对新型转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉在室内进行了生物测定和田间进行了系统的调查。结果表明,和常规棉相比,转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花上棉蚜的净增值率降低81.69%,差异达显著水平;内禀增长率和周限增长率分别降低65.00%和13.01%,但差异不显著;平均世代周期和种群加倍时间分别增加5.54%和154.19%,后者差异达显著水平。和常规棉相比,2010年转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花百株苗蚜、伏蚜和秋蚜的数量分别降低10.79%、37.18%和17.49%,差异均未达显著水平;2011年转Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花百株苗蚜的数量增加2.03%,伏蚜和秋蚜的数量分别降低37.41%和64.03%,差异均未达显著水平。