不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和mCherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和mCherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。

RNA m^(1)A和m^(5)C甲基化修饰在拟轮枝镰孢伏马毒素生物合成中的作用

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)是一种危害严重的植物病原真菌,极大降低了粮食产量,还产生2B类致癌物伏马毒素,威胁人畜健康。探究RNA甲基化修饰与伏马毒素之间的联系,解析RNA修饰甲基化转移酶在伏马毒素合成中的作用。【方法】利用HPLC检测了不同地区的拟轮枝镰孢菌株的伏马毒素合成能力,采用QuEChERS前处理结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术建立了m^(6)A、m^(1)A、m^(5)C、Gm、m^(7)G和Um等6种RNA甲基化修饰检测方法,继而对不同产毒菌株的RNA甲基化修饰进行了检测,并采用生物信息学和RT-qPCR方法确定了与伏马毒素合成相关的RNA甲基化修饰基因。【结果】不同地区的拟轮枝镰孢菌株伏马毒素合成能力具有显著差异,成功建立了RNA甲基化修饰检测方法,并确定m^(1)A和m^(5)CRNA甲基化修饰与伏马毒素合成负相关,RT-qPCR发现Fvalyref基因负调控伏马毒素生物合成。【结论】RNA m^(5)C甲基化修饰与伏马毒素生物合成呈负相关且其Reader基因Fvalyref负调控伏马毒素生物合成。

联合全基因组关联和转录组分析筛选玉米拟轮枝镰孢穗腐病的抗性候选基因

玉米是我国第一大粮食作物,实现玉米的高产稳产对于我国粮食安全、农业稳定有重要意义。穗腐病是一种严重危害全球玉米的真菌性病害,会造成玉米大幅减产和品质劣变。本研究选用我国玉米穗腐病的优势致病菌拟轮枝镰孢(Fusariumverticillioides),对241份来源广泛的玉米自交系进行2年田间人工接种抗性鉴定,同时利用20,586个高质量SNP标记通过全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,GWAS),鉴定拟轮枝镰孢穗腐病抗性显著关联的SNP位点;在此基础上选取对拟轮枝镰孢穗腐病表现高抗和高感的玉米自交系各1份,其籽粒在室内接种拟轮枝镰孢,通过对3个不同侵染时间的籽粒进行转录组测序(RNA-seq),分析抗感材料差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)及其富集情况;结合GWAS和RNA-seq结果,共同定位筛选抗病候选基因。主要研究结果如下:(1)综合2年田间抗性鉴定结果,筛选到4份抗拟轮枝镰孢穗腐病的玉米自交系,其中含有热带血缘的玉米种质对拟轮枝镰孢穗腐病表现出更好的抗性。(2)2年GWAS分析共检测到26个与拟轮枝镰孢穗腐病抗性显著关联的SNP位点,其中有18个位点位于前人定位到的QTL范围内。(3) RNA-seq结果表明,抗感材料对病原菌的响应基因不同。与感病材料相比,抗病材料均显示出更多的DEGs,且都有更多的上调基因;在抗感材料特异性DEGs共同富集的GO条目和KEGG通路中,抗病材料中富集到的DEGs占比显著多于感病材料;一些与植物防御病原菌相关的条目和通路也仅在抗病材料中被特异富集。(4)在GWAS检测到的显著关联位点上下游100 kb范围内筛选与转录组DEGs共同定位到的候选基因,结果 16个基因被GWAS和RNA-seq同时检测到;根据这些基因的蛋白功能及相关文献报道,从中预测到6个与拟轮枝镰孢穗腐病抗性相关的候选基因。综上所述,本研究筛选出4份抗拟轮枝镰孢穗腐病的玉米自交系,来自热带、亚热带的玉米种质可以作为抗逆性品种选育的研究重点;对抗感玉米自交系响应拟轮枝镰孢侵染的DEGs及其相关抗病机制进行了初步解析,联合GWAS和RNA-seq共定位到6个与拟轮枝镰孢穗腐病抗性相关的候选基因,研究结果为玉米穗腐病抗性基因的克隆验证与抗性品种的培育提供了一定的理论依据。

利用非同源末端连接缺陷构建拟轮枝镰孢菌的高效基因敲除方法

拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)是引起玉米茎基腐病和穗粒腐病的主要病原菌之一,严重威胁玉米的产量和品质。为了深入研究拟轮枝镰孢菌致病基因的功能,对该菌中非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)途径中的2个关键基因FvKu70和FvKu80分别进行了基因敲除以创制高效的基因敲除菌株,并比较了野生型菌株和突变体菌株在营养生长速率、菌落形态、产孢量、对玉米的致病力和基因敲除效率等方面的差异。研究结果表明,FvKu70和FvKu80的基因缺失突变体与野生型FvLNF15-11相比,在PDA平板上的形态特征(如菌丝形态、生长速率、菌落直径、产孢量)没有明显差异,对玉米茎秆的致病力也类似。此外,选择尿嘧啶生物合成相关基因FvpyrG作为敲除的靶基因,分析了FvKu70或FvKu80缺失突变体菌株的同源重组效率,结果显示突变体菌株均显著高于野生型,其中ΔFvKu70的同源重组效率最高。综上所述,FvKu70或FvKu80基因缺失突变体可以快速又高效地实现拟轮枝镰孢菌的基因敲除,为进一步研究该菌的功能基因提供了技术支持。

一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法

制备接种体是玉米穗腐病抗性鉴定中的一个重要环节,本研究提出了一种用玉米拟轮枝镰孢穗腐病病粒制备接种体的简易方法,即将上年的拟轮枝镰孢穗腐病带菌病粒按一定重量加入无菌水洗脱制成接种体。田间接种试验结果表明,采用本方法简易制备的接种体接种后可获得与常规制备接种体相当的接种效果,且在-18℃冻存15 d仍可达到新鲜的常规制备接种体接种后的水平。使用简易制备接种体对33个玉米品种进行了田间穗腐病抗性鉴定,21个品种表现为感病或高感。与实验室常规培养制备接种体的方法相比,本制备方法简便易操作,用时短,成本低,无需专业仪器设备,能够一次制备大量接种体,可广泛用于玉米种质材料和新品种的拟轮枝镰孢穗腐病田间抗性鉴定及抗性材料筛选等。

拟轮枝镰孢与玉米籽粒互作的差异基因筛选及代谢通路分析

【目的】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的玉米穗腐病是我国玉米产区发生严重的病害之一,论文旨在了解病原菌与玉米籽粒互作过程中的基因表达差异,为揭示病原菌的致病机制和玉米抗病机制提供依据。【方法】对拟轮枝镰孢侵染玉米籽粒0、4、12和72 h的样品进行转录组测序,之后采用生物信息学分析,分别以玉米和拟轮枝镰孢基因组为参考,以|log_(2)FC|≥1,P-adjust<0.05为阈值筛选互作过程中玉米和拟轮枝镰孢的差异表达基因,利用GO和KEGG对其进行功能注释及富集分析。Goatools软件分析植物-病原互作、MAPK途径和植物激素信号转导通路相关差异基因的表达变化,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对测序差异基因进行验证。【结果】在互作4、12和72 h后拟轮枝镰孢分别有140、400和1945个基因上调表达,有9、302和1784个基因下调表达;玉米分别有293、692和1426个基因上调表达,320、482和153个基因下调表达。GO和KEGG富集分析显示,侵染早期拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,差异基因主要富集在RNA生物合成、细胞壁结构成分、脂肪酸生物合成、蛋白质代谢、碳水化合物代谢、生物过程和代谢过程等通路中。拟轮枝镰孢早期侵染触发了玉米活性氧(ROS)爆发,差异基因主要富集在对活性氧、过氧化氢的反应,几丁质酶、单加氧酶活性,木质素代谢过程等相关通路中。侵染后期拟轮枝镰孢继续在籽粒中定殖及扩展,差异基因主要富集在碳水化合物和细胞壁多糖分解代谢过程、跨膜转运、氧化还原酶活性等功能通路中。玉米主要通过苯丙素、木质素、类黄酮生物合成,MAPK信号通路、植物-病原互作和植物激素信号转导等途径差异基因大量表达响应病原菌侵染。随机选取6个玉米和6个拟轮枝镰孢的差异表达基因进行qRT-PCR分析,基因表达规律与转录组测序结果一致,证实了RNA-seq的准确性。【结论】在病原菌侵染早期,拟轮枝镰孢在细胞间隙生长,触发玉米活性氧爆发,相关通路差异基因表达;侵染中后期,病原菌以淀粉为营养素,继续在籽粒中定殖及扩展,玉米通过苯丙素、木质素及几丁质酶的生物合成等方面的相关基因表达响应拟轮枝镰孢侵染,同时植物-病原互作、MAPK途径和激素信号转导等途径参与抗拟轮枝镰孢侵染。

拟轮枝镰孢荧光标记与侵染结构观察

【目的】以玉米穗腐病优势病原菌和伏马毒素主要产毒菌拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)为研究对象,构建组成型表达绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白DsRED、过氧化物酶体靶向标记蛋白DsRED-PTS1和细胞骨架F-actin结合蛋白LifeAct-GFP的荧光菌株,观察拟轮枝镰孢侵染玉米须表皮的穿透结构,明确拟轮枝镰孢侵染结构形成的调控机制和影响因素。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化方法将荧光表达载体pCOM-GFP、pCOM-DsRED、pCOM-DsRED-PTS1和pCOM-LifeAct-GFP分别导入拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2中,PCR鉴定含有目标基因的转化子,激光共聚焦显微镜观察各荧光蛋白的表达和分布;接种玉米须观察侵染结构;赛璐酚膜模拟植物表皮穿透试验,观察穿透结构和F-actin的动态组装;使用F-actin聚合抑制剂Latrunculin A、三环唑和活性氧抑制剂DPI(diphenyleneiodonium chloride)检测穿透结构形成的影响因素。【结果】建立了以遗传霉素G418为抗性标记的遗传转化方法;FV-GFP和FV-DsRED菌株分别具有清晰、明亮的绿色荧光和红色荧光,FV-DsRED-PTS1菌株中红色荧光呈圆点状分布,符合真菌中过氧化物酶体的分布特征,FV-LifeAct-GFP菌株孢子和菌丝内部具有丝絮状绿色荧光,符合真菌中F-actin蛋白的分布特征;玉米须表皮侵染过程中观察到菌丝顶端膨大类似附着枝侵染结构;赛璐酚膜模拟穿透试验观察到穿透结构中F-actin蛋白的成环组装;药物胁迫试验表明,穿透结构的形成受F-actin蛋白聚合和活性氧调控。同时,三环唑能够抑制穿透。【结论】构建了4种荧光标记菌株,细胞定位清晰,具有正常的生长表型和致病力,能够满足致病机制相关研究需求;明确了拟轮枝镰孢在侵染玉米时能够形成一种菌丝顶端膨大的类似附着枝状的侵染结构;确定了F-actin成环聚集、细胞骨架组装和活性氧调控是影响拟轮枝镰孢侵染结构形成的关键因素。

芽孢杆菌抑制玉米茎腐病菌禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌的研究进展

玉米茎腐病是由一种或多种真菌、细菌单独或共同侵染引起玉米根腐、茎腐、鞘腐以及穗腐等症状的世界性顽疾,部分病原还能产生真菌毒素,严重影响玉米的产量和质量。芽孢杆菌(Bacillus spp.)是已知的最具潜力的生防菌之一,且在自然界中分布十分广泛。深入了解生防芽孢杆菌的抗菌活性物质及抑菌机制,对玉米茎腐病的绿色防控具有重大意义。本文重点阐述对玉米茎腐病具有生防作用的芽孢杆菌种类、防效、防控机制,及相关混合菌剂的应用现状。生防芽孢杆菌菌体悬液、发酵液和无菌发酵液对病原菌均具有一定的抑菌效果。其中,甲基营养型芽孢杆菌TA-1的发酵液防效最佳,且对玉米具有促生长作用;蜡样芽胞杆菌B25菌体悬液浸种后显著降低了鲜玉米粒中伏马菌素的含量;贝莱斯芽孢杆菌BV23对玉米多种病原均有抑制作用;在室内及大田中解淀粉芽孢杆菌B9601-Y2发酵液均较菌体悬液和无菌发酵液的抑制效果好。多数芽孢杆菌产生的脂肽类抗菌物质能破坏细胞膜和细胞壁的完整性,导致禾谷镰孢菌和拟轮枝镰孢菌菌丝畸形、顶端囊泡化,细胞膜通透性增强,细胞质渗漏,从而抑制病原菌菌丝生长、孢子产生以及孢子萌发;此外,脂肽类活性物质还能使病原菌DNA二级结构和形态发生改变,致病基因表达下调。最后,指出使用芽孢杆菌包衣种子结合苗期发酵液灌根的方法可有效防控玉米茎腐病,为芽孢杆菌防控玉米茎腐病提供理论参考及研究思路。

玉米拟轮枝镰孢穗腐病遗传分析研究

培育抗性品种是解决玉米穗腐病最有效的途径。以抗性不同的5个玉米自交系为试验材料,通过双列杂交遗传交配设计,对杂交组合F_1和亲本在3个地点同时接种拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides),采用Griffing固定模型和Hayman模型进行穗腐病和穗长、穗粗、穗行数、行粒数、百粒重以及产量等6个农艺性状的遗传分析,旨在研究正交和反交对杂种F1穗腐病抗性的影响。结果表明,穗腐病和6个农艺性状在组合间差异均达到极显著水平(P<0.01),穗腐病与6个农艺性状之间均未达到显著相关。7个性状的一般配合力效应和特殊配合力效应均达到极显著水平(P<0.01),反交配合力均未达到显著水平,玉米穗腐病的正交与反交接种后表型差异非常小。穗腐病的遗传符合加性-显性模型,且为部分显性。利用亲本组配玉米杂交种时,抗性亲本作为父本或者母本并不影响杂交种的抗性。

玉米种质资源对拟轮枝镰孢与禾谷镰孢穗腐病的抗性精准鉴定与分析

穗腐病是我国玉米生产上的重要病害,严重影响玉米的产量和品质。利用抗病品种是控制穗腐病的安全有效措施。抗性资源是开展抗病育种的物质基础。本研究优化和完善了玉米种质抗镰孢穗腐病精准鉴定的方法,比较分析了花丝通道注射接种和果穗注射(创伤)接种鉴定的穗腐病抗性,发现2种方法鉴定出的抗性结果具有高度的一致性(相关系数r≥0.90)。2018—2020年,在北京昌平和四川西昌,利用花丝通道注射接种法,对690份代表性玉米种质进行了抗拟轮枝镰孢穗腐病的精准鉴定与评价,筛选出H446、YCF、辽2309、吉资1055、Y1723、XF8-3、铁97085等35份具有稳定抗性的种质,占比为5.07%。6个环境下玉米对拟轮枝镰孢穗腐病抗性的相关系数为0~0.48,同一年度(2018、2019和2020年)2个鉴定点穗腐病抗性值之间的r值分别为0.03、0.20和0.15,3个年度间穗腐病综合抗性的相关系数为0.20、0.30和0.35,表明在不同环境下玉米对拟轮枝镰孢穗腐病的抗性反应存在较大差异。在辽宁沈阳和四川西昌共6个环境下,对690份种质进行了抗禾谷镰孢穗腐病精准鉴定,6个环境下玉米种质抗性的相关系数为0~0.39,2018、2019和2020年2个鉴定点之间的r值分别为0.05、0.25和0.29,表明环境因素对玉米抗禾谷镰孢穗腐病的表型存在较大影响;3个年度间镰孢穗腐病综合抗性的r值为0.14、0.20和0.13,显示年度间综合抗性差异较大。共鉴定出17份对禾谷镰孢穗腐病具有稳定抗性的种质(H446、MC7528、Y1632、Y1679、吉资1055、铁97085等)。690份种质对上述2种穗腐病抗性的相关系数为0.52,表明其对2种穗腐病的抗性存在中等水平的相关性。H446、吉资1055、铁97085三份种质在所有鉴定环境中均对2种穗腐病表现出稳定抗性,是玉米抗穗腐病育种和品种抗性改良的宝贵资源。

轮枝镰孢SSR标记开发及在玉米分离群体遗传多样性分析中的应用

【目的】开发轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的SSR标记,为轮枝镰孢遗传多样性研究提供技术支持。【方法】利用Fastpcr在轮枝镰孢基因组中查找符合条件的SSR位点,采用Primer5.0软件设计引物,利用NTSYS及Popgene分析来自玉米的轮枝镰孢单孢分离物群体的PCR扩增结果。【结果】共设计有效扩增SSR引物158对,经筛选,109对(69.0%)可扩增出2条及以上的条带,其中55对引物(34.8%)多态性较好,可扩增出3条及以上的条带。从11条已组装的轮枝镰孢染色体上各选出2对多态性引物,计22对引物,对66株轮枝镰孢玉米分离物进行扩增,共获得125个等位变异,变异范围为2—11个,平均为5.68个。轮枝镰孢玉米分离物之间Nei’s基因多样性指数为0.1139—0.8687,平均为0.6199,表现出较高的遗传多样性。【结论】基于轮枝镰孢基因组序列开发的SSR标记具有很好的多态性,可用于轮枝镰孢的遗传多样性分析。用22对SSR引物扩增,以遗传相似系数0.3进行划分,可将66株轮枝镰孢玉米分离物分为3群;中国轮枝镰孢玉米分离物的遗传多样性与地理分布无相关性。

玉米自交系对轮枝镰孢菌穗腐病的抗性评价

【目的】在我国西南玉米产区,轮枝镰孢菌穗腐病是一种常发性病害,对其最为经济有效的防治方法是选育抗性品种。【方法】本研究对114份引进的国外自交系,采用田间人工接种的方式,进行穗腐病抗性评价。【结果】表现为高抗的自交系仅1份,占0.9%,为CML490;抗性材料(R)23份,占20.2%;中抗材料(MR)49份,占43.0%;感病材料(S)28份,占24.6%;高感材料(HS)13份,占11.4%。【结论】供试材料中,中抗以上的种质资源占68.5%,说明国外引进的玉米自交系材料中存在丰富的抗源,可加大引进力度和筛选量,以筛选到优质的抗源。

拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性及抗性菌株生物学性状和交互抗性

为评价玉米穗腐病主要致病菌拟轮枝镰孢Fusarium verticillioides对多菌灵的敏感性,采用菌丝生长速率法测定了采自山东、河北、河南、四川、甘肃、辽宁及宁夏7省(自治区)的168株玉米穗腐病拟轮枝镰孢对多菌灵的敏感性,并对经药剂驯化获得的拟轮枝镰孢抗多菌灵菌株主要生物学性状和交互抗性进行了研究。结果表明:多菌灵抑制拟轮枝镰孢菌丝生长的EC50值在0.0132~0.7740 mg/L之间,平均EC50值为(0.2208±0.1437)mg/L。敏感性频率分布显示,供试病原菌群体中已出现对多菌灵敏感性下降的亚群体,但其中仍有35.71%的菌株对多菌灵的敏感性频率呈正态分布,因此可将此部分菌株的平均EC50值(0.0814±0.0289)mg/L作为拟轮枝镰孢对多菌灵的相对敏感基线。药剂驯化共获得6株抗性菌株,抗性倍数在5.05~12.22之间。抗性菌株的菌丝生长速率及菌丝干重均低于亲本菌株,表明其抗性菌株的生物适合度有所降低,同时发现其抗药性均不能稳定遗传。室内交互抗性测定结果表明,拟轮枝镰孢对多菌灵的抗性与咪鲜胺、戊唑醇、三唑酮及吡唑醚菌酯之间均不存在交互抗性关系。

利用红色荧光蛋白标记的轮枝镰孢研究病原菌对玉米根系的系统侵染和定殖

采用农杆菌介导法将红色荧光蛋白基因DsRed转入轮枝镰孢Fv-1菌株,利用荧光显微镜观察轮枝镰孢在玉米自交系B73根部定殖和生长的规律。土壤中的轮枝镰孢首先侵染玉米的须根等组织,并在其中大量增殖,随后沿主根向上侵染,以菌丝的形式扩展到地上组织。有些孢子附着在根表面的纹理中,萌发形成菌丝而扩展;有的则向内侵染附着的细胞,然后再继续向周边侵染。由根内部向上侵染的菌丝多沿着细胞间隙上行,有些也会穿行在不同细胞之间。分析接种不同时间轮枝镰孢在玉米根和茎基部组织形成的单菌落数量(CFU)发现,轮枝镰孢在根部的CFU值随时间逐渐减小,而茎基部的CFU值则呈逐渐增大的趋势。这说明土壤中的轮枝镰孢能够通过根系侵染途径危害地上部组织。本研究的结果为进一步探明轮枝镰孢和玉米之间的互作关系,以及其他土传真菌与植物之间的互作提供了有益的参考。

拟轮枝镰孢ATMT突变体库的构建及分析

【目的】通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。【方法】筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌AGL-1的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过ATMT构建GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行PCR检测和荧光显微镜观察,检测分析T-DNA插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选9个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。【结果】通过农杆菌抑菌试验发现当Cefo/Amp的浓度为150/150μg·mL^(-1)时,AGL-1生长受到抑制;当潮霉素B的浓度为150μg·mL^(-1)时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的ATMT转化获得了2 465株GFP标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素B的PDA培养基上连续转接5代再转到含潮霉素B的培养基上仍能正常生长,说明HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用GFP特异性引物对转化子进行PCR检测,测序结果显示与NCBI中GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为99.26%,表明GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子54的产孢量明显增多,约为野生型的1.9倍;转化子24的分生孢子萌发率在相同时间内明显下降;转化子13的致病力增强,病害级别达到9级,转化子33和16致病力减弱为3级,转化子4致病力最弱为1级,部分转化子生物学性状未发生明显变化。【结论】构建了农杆菌介导GFP标记的拟轮枝镰孢突变体库,筛选分析获得了产孢量、孢子萌发率、致病力发生变化的突变体,为进一步研究拟轮枝镰孢侵染玉米果穗的途径和致病的分子机制打下了基础。

轮枝镰孢菌的绿色荧光蛋白基因标记

本研究采用农杆菌介导法(ATMT)将绿色荧光蛋白基因(gfp)转入轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)获得了表达gfp的转化子。结果表明,转化子经过5代培养仍能发出稳定的荧光,转化后的菌落形态与菌丝生长速度差异不明显,对寄主仍有致病能力。通过PCR验证也表明gfp基因已成功转入到菌株PX1015基因组中,轮枝镰孢菌绿色荧光蛋白基因转化体的成功构建为该病菌侵染机制的研究奠定了基础。

LAMP快速诊断由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病

[目的]水稻恶苗病是为害水稻生长发育的重要病害,在我国的分布非常广泛,经常会造成严重的损失。拟轮枝镰孢是引起水稻恶苗病的重要病原菌,本研究意在建立由拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的快速诊断技术。[方法]基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术,以拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的3-磷酸甘油酸激酶(3-phosphoglyceric phosphokinase)基因Pgk为靶标,设计筛选LAMP特异性引物。[结果]建立了可直接从水稻恶苗病植株中检测拟轮枝镰孢并诊断由该病原菌引起的水稻恶苗病的LAMP检测技术(FvPgk-LAMP)。该检测技术可以从田间发病的水稻植株中直接对病原菌进行检测,反应条件为62℃、70 min。由于反应前在反应管内加入了羟基萘酚蓝(HNB),反应结束后可对结果进行直接判定,阳性反应呈天蓝色,阴性反应则仍然为紫色。该体系的最低检出限为目标菌纯DNA的100pg·μL^(-1)。应用该技术我们已成功且快速地对来自江苏南京和镇江的水稻恶苗病样本进行了病害诊断。[结论]本研究为拟轮枝镰孢引起的水稻恶苗病的诊断提供了快速且有效的新技术。

拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米种子发芽及幼苗生长的影响

为建立玉米杂交种和自交系利用拟轮枝镰孢菌毒素抗性筛选的试验方法,制备拟轮枝镰孢菌毒素粗提液,测定不同稀释倍数毒素粗提液对2个玉米杂交种和4个玉米自交系处理4和6d后的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率以及幼苗致萎效果,分析不同抗性玉米种质、毒素稀释倍数和处理时间对玉米种子发芽、胚根和幼苗生长的影响。结果表明,易感杂交种豫玉22与抗性杂交种农大108的种子发芽抑制率和胚根生长抑制率均存在极显著差异(P<0.01);在处理后4、6d时,前者的种子发芽抑制率、胚根生长抑制率分别比后者高7.2%、11.3%、12.7%、11.8%。在对玉米杂交种幼苗致萎蔫试验中,用稀释2倍和5倍的毒素粗提液处理,豫玉22与农大108杂交种幼苗间的萎蔫程度也存在显著差异(P<0.05)。拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对不同抗性玉米种质种子发芽、幼苗生长的影响存在显著差异,为利用拟轮枝镰孢菌毒素粗提液对玉米品种进行苗枯病抗性鉴定和筛选提供理论依据。

轮枝镰孢菌FvST12基因敲除载体的构建及功能分析

【目的】鉴定并分析轮枝镰孢菌中STE12类转录因子的基因功能。【方法】以尖孢镰孢菌转录因子Fost12蛋白为靶序列,在轮枝镰孢菌基因组数据库中进行BlastP搜索,发现一个与Fost12蛋白同源性高达98%的基因,命名为FvST12。基于Double-Joint PCR技术,构建该基因的敲除载体,通过真菌原生质体转化及筛选获得基因敲除突变体,并对突变体的表型及致病性进行系统分析,以明确该基因的功能。【结果】突变体在生长速率、菌落形态、产孢量以及高渗和氧化等逆境胁迫反应上与野生型无显著差异;致病性分析表明,突变体致病力明显下降。【结论】轮枝镰孢菌FvST12对致病性起重要调控作用,但不参与营养生长、产孢和高渗和氧化胁迫等逆境反应。

化学防控玉米蛀穗害虫对减轻拟轮枝镰孢穗腐病及伏马毒素的作用

【背景】拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)引起的穗腐病严重影响玉米产量和品质,其产生的伏马毒素威胁食品安全。亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)和桃蛀螟(Conogethes punctiferalis)等穗期害虫危害可导致玉米严重减产,并加重玉米穗腐病的发生。【目的】评估2种杀虫剂(甲维盐和氯虫苯甲酰胺)、3种杀菌剂(氰烯菌酯、戊唑醇和苯醚甲环唑)对玉米穗期病虫害的防治效果以及对玉米产量和籽粒中伏马毒素含量的影响;明确施用杀虫剂后接菌对穗腐病发病的影响,探究防治玉米穗期病虫害的有效方案,为玉米安全生产提供技术支撑。【方法】以郑单958为供试玉米,在2019年春、夏两季于河北廊坊进行田间试验。玉米大量吐丝后5 d和20 d两次施药,接菌处理于吐丝后7 d进行。在玉米完熟期调查虫害级别、穗腐病发病率和病情指数、果穗穗长、行粒数、穗重和百粒重,计算防治效果和增产情况,并用高效液相色谱-串联质谱法分析籽粒中伏马毒素B1、B2的含量。【结果】与对照相比,施用甲维盐和氯虫苯甲酰胺均可显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量。与单独施用杀虫剂相比,施用杀虫剂与杀菌剂的混剂未显著降低平均虫害级别、穗腐病发病率、病情指数、伏马毒素含量,也未显著提高产量和对上述病虫害的防治效果。与仅接菌的处理相比,施用氯虫苯甲酰胺后接菌处理在穗腐病发病率、病情指数和伏马毒素含量方面均显著下降。在春玉米和夏玉米试验中,25 g·hm^(-2)氯虫苯甲酰胺及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果分别达82.1%—92.7%、94.2%—95.0%,而30 g·hm^(-2)甲维盐及其与杀菌剂的混剂对穗部螟虫的防治效果显著低于25 g·hm^(-2)氯虫苯甲酰胺,仅为57.8%—78.0%、83.1%—89.9%。2种杀虫剂对穗腐病的防治效果无显著差异,春玉米防治效果均>60%,夏玉米防治效果均>88%。对于产量而言,各处理均对果穗穗长和行粒数无显著影响,药剂处理后的果穗穗重均显著高于对照,且各处理间无显著差异。施用杀虫剂后接菌对产量无显著影响。分别施用2种杀虫剂单剂或其与杀菌剂的混剂后,春玉米可增产5.49%—13.49%,夏玉米可增产9.20%—13.95%,玉米籽粒中伏马毒素含量均低于500μg·kg^(-1),而对照玉米中伏马毒素含量达2817μg·kg^(-1)。喷雾接菌处理的玉米中伏马毒素含量高达8710μg·kg^(-1),而接菌前施用杀虫剂可将伏马毒素含量降至1500μg·kg^(-1)以下。【结论】施用25 g·hm^(-2)氯虫苯甲酰胺和30 g·hm^(-2)甲维盐均可通过显著降低玉米蛀穗害虫的危害,从而减轻穗腐病的发生并降低籽粒中伏马毒素含量,提高玉米产量和品质,而杀虫剂/杀菌剂混用与杀虫剂单用对虫害防控效果差异不显著;穗期害虫对果穗的伤害在穗腐病的发生过程中起决定性作用。综合各方面因素,25 g·hm^(-2)的氯虫苯甲酰胺是防治穗期玉米害虫、减轻穗腐病较为理想的药剂。