生物反应器培养轮状病毒基因重配株Ls条件的优化

目的轮状病毒基因重配株Ls(G3型)在生物反应器微载体培养Vero细胞条件的优化。方法采用3 L生物反应器微载体培养Vero细胞,观察Ls株在不同病毒感染复数(0.001、0.002、0.010、0.040 MOI)、不同温度(34.5℃和35.5℃)、不同病毒收获时间(24和48 h)对病毒增殖的影响。根据病毒滴度和收获量筛选出最适MOI、培养温度及病毒的收获时间。结果以0.002 MOI接种Vero细胞,温度为34.5℃培养病毒,滴度最高达7.50 lg CCID50/m L;48 h可连续收获4次病毒液,且收获总量及病毒滴度均高于24 h。结论通过对Ls株在生物反应器微载体Vero细胞培养条件的优化,获得的病毒液滴度高及连续培养多次收获量增加的有效方法,为进一步规模化培养奠定了基础。

轮状病毒基因重配LH9株(G4型)传代稳定性研究

对兰州生物制品研究所自行构建的轮状病毒基因重配株G4型LH9株在Vero细胞中传代的稳定性进行研究。将基因重配LH9毒株接种于Vero细胞上从7代传至17代,经电镜检查、病毒滴度测定、病毒基因组RNA电泳图谱分析、基因序列测定分析、轮状病毒型别鉴定及其它相关检定,结果均符合药典要求。证实该毒株为A群G4P〔12〕型轮状病毒,在Vero细胞传代中具有良好的稳定性,为疫苗研制提供安全有效的依据。

口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗保护效果的Meta分析

目的评价口服人-牛(WC_3株)5价轮状病毒基因重配活疫苗(PRV)的保护效果。方法检索中国生物医学文献数据库等中文数据库和美国国家医学图书馆数据库等外文数据库,检索有关PRV保护效果的研究纳入分析。按照研究地区的社会经济发展水平、疫苗株和流行株的匹配情况,分别合并试验组和对照组针对不同型别轮状病毒感染引起的急性肠炎发病的相对危险度(RR)或比值比(OR),计算疫苗效力(VE)。结果共纳入5篇病例对照研究。高发展水平国家,在疫苗株和流行株完全匹配的情况下,VE=94%(95%CI:84%~98%);在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原匹配的情况下,VE=82%(95%CI:70%~89%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=75%(95%CI:47%~88%)。中等发展水平国家,在疫苗株和流行株不完全匹配的情况下,VE=37%(95%CI:10%~56%);在单一抗原匹配的情况下,VE=71%(95%CI:60%~78%);在单一抗原不匹配的情况下,VE=76%(95%CI:61%~85%)。结论接种PRV可降低轮状病毒感染引起的急性肠炎发病率,PRV的保护效果与疫苗株和流行株匹配情况以及地区因素有关。

Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗免疫原性及对造血系统的影响

目的:研究Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗对SD大鼠的免疫原性及对造血系统的长期毒性。方法:疫苗组大鼠(n=30)免疫3次,每次每只动物2 mL ig,第1次免疫后3周、第3次免疫后1和4周各处死大鼠10只,检测血清特异性抗体,血液学和骨髓。结果:在各时间点疫苗组血清抗体滴度均明显高于对照组。第1次免疫后3周时可测出针对G1,G2,G3,G4和G10型抗原的抗体,逐渐升高。针对G2,G3和G4型的抗体滴度明显高于G1和G10型(P<0.01或<0.05)。疫苗组大鼠LY计数和MCH出现了可逆性变化(P<0.05),但无明显毒性,大鼠骨髓象无明显改变。结论:Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗对大鼠有明显免疫原性,对造血系统无明显毒性。

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析

为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87ku的重组蛋白。Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应。大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验。结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础。

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用SalⅠ和KpnⅠ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和（以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）及红霉素基因（Erythromycin）为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的）质粒载体pW425et，并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4，并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E-coliX13和乳酸杆菌感受态中，经生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87ku的融合蛋白。Western-blot分析结果表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性。

猪A组轮状病毒pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的构建及表达

以嗜酸乳杆菌为受体菌株,将pW425et-Vp4重组质粒电转化入嗜酸乳杆菌,构建猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌,对影响电转化效率的主要因素进行研究,并对构建的乳酸菌进行表达分析。结果表明,在MRS培养基中加入1%甘氨酸+0.3mol/L蔗糖,电场强度为11kV/cm,脉冲时间为3.8ms,电击后细胞复苏3～4h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。pW425et-Vp4乳酸菌阳性克隆经Western-blot分析表明,其蛋白具有与猪轮状病毒多克隆抗体的反应原性。

轮状病毒疫苗基因转化烟草的研究

以烟草叶片的切段为外植体,用含有轮状病毒疫苗基因的农杆菌浸泡5 min,然后共培养2 d,再转入MS+6-BA 1.0 mg/L+IAA0.1 mg/L,添加100 mg/L卡那霉素和500 mg/L氨苄青霉素的筛选培养基上筛选,得到卡那霉素抗性苗32株。对其中的4株卡那霉素抗性苗进行PCR分子检测,结果表明,目的基因已经整合进烟草基因组中。

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D600nm值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸+0.3mol/L蔗糖,电场强度为11kV/cm,脉冲时间为3.8ms,电击后细胞复苏3～4h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×104 CFU/μg DNA。

利用搭桥PCR法实现轮状病毒VP7表位片段的重组

选择了RV VP7的3个高度保守可诱发高水平体液免疫反应的中和性抗原表位,人工合成了这3个表位片段。采用了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法—搭桥PCR法,方便快速地构建了轮状病毒VP7蛋白的重组表位基因,将其T/A克隆入PBS-T载体,经过测序与报道序列同源性达100%。结果表明:搭桥法PCR简单易行,快速准确,尤其是在构建2个或多个小基因片段的融合时,比酶切、连接方法更具优越性。

荧光灶试验和TCID_(50)-ELISA方法在Ⅲ价轮状病毒重配疫苗感染滴度测定中的对比研究

目的:对比荧光灶试验和TCID50-ELISA方法测定III价轮状病毒基因重配疫苗感染滴度的精确性,重复性和可行性。方法:同时采用TCID50-ELISA方法和荧光灶试验方法测定Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗的感染滴度,对测定结果进行比较分析。结果与结论:在Ⅲ价轮状病毒基因重配疫苗的感染滴度测定中,荧光灶试验方法和TCID50-ELISA方法各有其特点,荧光灶试验方法更加精确和快速,相对于TCID50-ELISA方法,具有更低的变异性,即其重复性较高;而TCID50-ELISA方法受主观因素的影响较低。

胆道闭锁实验动物模型的比较

胆道闭锁(biliary atresia,BA)是新生儿时期导致肝移植的重要病因之一,近年来随着诊断技术的提高,本病的发病率也在不断上升,但本病的具体病因及发病机制尚不明确,动物模型的出现是探索本病的重要途径。但国内对本病的认识及相关动物模型的研究还相对滞后,目前BA模型主要分为药物毒物诱导型、胆道机械结扎型、轮状病毒诱导型3大类,其中药物毒物诱导的BA模型对胆管具有选择性,目前还存在诸多尚未解决的问题;胆道结扎的方法虽然造成胆管闭锁,但和真实世界的BA存在发病年龄等不相符的情况;而轮状病毒诱导胆管闭锁模型目前被广泛接受,也是当前主要的研究模型,但是在肝纤维化形成之前,模型动物均已死亡,也不能充分反映BA的疾病进展过程;而采用轮状病毒基因重组方法建立的动物模型有存活时间相对较长,并且可以实现肝纤维化的优点,更接近实际的病理发展过程,是具有前景的模型。总的来讲,BA的研究尚缺乏完全符合临床实际,充分反映临床疾病发展的理想动物模型。