人源轮状病毒vp7基因的克隆与转基因植物研究

目的 克隆人源轮状病毒外壳蛋白vp7基因 ,以制备转基因植物疫苗。方法 用RT PCR方法制备vp7基因 ,以植物高效表达质粒PBI12 1为载体 ,构建重组DNA质粒。重组体用载体上的通用引物为测序引物 ,鉴定克隆的正确性。再将鉴定过的重组质粒用农杆菌介导法转染马铃薯外植体 ,分别用PCR、Westernblot法鉴定阳性转化植株中vp7基因的表达。结果 成功地将vp7转入马铃薯植株中 ,并且在转化植株中检测出了vp7的表达。结论 成功地构建了重组PBI12 1 hvp7质粒 。

轮状病毒VP7 DNA免疫研究

目的研究促使基因分泌或膜锚定表达的基因修饰对轮状病毒 VP7DNA疫苗所诱导抗体水平的影响。方法把携带野生型 (VP7wt)、分泌型 (VP7s)和膜锚定型 (VP7tm ) 3种 VP7基因的重组 pc DNA3质粒分别免疫小鼠 ,用大肠杆菌表达的重组 VP7抗原检测 VP7特异的抗体反应 ,统计分析。结果 3种 DNA疫苗均能诱导轮状病毒 VP7特异的 Ig G抗体反应 ,但其抗体水平之间无显著性差异。结论把轮状病毒 VP7基因导入分泌或膜锚定表达途径不能增强其

1株表达人轮状病毒VP7的重组腺病毒的生物学特性鉴定

目的 对表达轮状病毒VP7基因的 1株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)的生物学特性进行鉴定 ,为进一步免疫学研究打下基础。方法 用rvAdG1VP7(G)感染 2 93细胞 ,并分别应用电子显微镜技术以及Southernblot、PCR、RT PCR和Westernblot等分子生物学方法了解rvAdG1VP7(G)的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性。结果 电子显微镜观察表明 :rvAdG1VP7(G)具有典型的腺病毒形态 ;Southernblot、PCR、RT PCR和Westernblot等分子生物学方法分析显示 :rvAdG1VP7(G)中确有特异性的VP7基因稳定整合 ,有较好的遗传稳定性 ,感染 2 93细胞后能有效转录 ,可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7。结论 rvAdG1VP7(G)具有良好的生物学性质 ,为进行体内实验研究提供了必要条件。

利用搭桥PCR法实现轮状病毒VP7表位片段的重组

选择了RV VP7的3个高度保守可诱发高水平体液免疫反应的中和性抗原表位,人工合成了这3个表位片段。采用了一种不需要限制性内切酶和连接酶的重组DNA方法—搭桥PCR法,方便快速地构建了轮状病毒VP7蛋白的重组表位基因,将其T/A克隆入PBS-T载体,经过测序与报道序列同源性达100%。结果表明:搭桥法PCR简单易行,快速准确,尤其是在构建2个或多个小基因片段的融合时,比酶切、连接方法更具优越性。

2001—2003年杭州地区婴幼儿腹泻轮状病毒VP7型别分析

目的研究杭州地区秋冬季婴幼儿腹泻轮状病毒(RV)的感染特点及RV分子流行病学特点。方法收集2001—2003年秋冬季来本院就诊拟诊为病毒性肠炎患儿的粪便共683份,采用乳胶凝集试验(LAT)检测A组RV,阳性者再用酶联免疫吸附试验(ELISA)分型检测RVVP7(G)血清型;将ELISA确定VP7(G)血清型的标本进一步做逆转录聚合酶链反应(RTPCR)扩增及RV基因测序,证实其VP7(G)血清型。结果683份标本中,RV阳性297份,检出率为43.5%(297/683);ELISA分型:VP7(G)血清型以G1、G3型为主,其中G1型占36.7%(109/297)、G3型占30.9%(92/297),其余G2、G4、混合型和未分型分别占4.0%(12/297)、7.1%(21/297)、11.8%(35/297)和9.4%(28/297);每年流行的VP7(G)血清型的主流不同,2001年以G1型为主,占54.9%(45/82)、G3型占14.6%(12/82),2003年以G3型为主,占43.2%(63/146)、G1型占29.5%(43/146)。RTPCR扩增、基因序列测定和同源性分析证实了ELISA分型的可信性。结论2001—2003年杭州地区秋冬季婴幼儿腹泻RVVP7(G)血清型以G1、G3型为主,且每年流行的主流血清型不同。