软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比较

目的比较体外软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的敏感性及相关性。方法用软琼脂克隆法检测不同种类、不同来源的细胞的致瘤性,并与裸鼠体内接种法的结果进行比较。结果不同的细胞在体外软琼脂中形成细胞集落的能力及集落形态明显不同。肿瘤细胞在体外可形成肉眼可见的细胞集落,而人二倍体细胞及组织工程用细胞在体外不形成或仅形成极少的细胞集落克隆,其集落形成率与细胞代次没有相关性,在裸鼠体内亦不形成瘤。重组CHO细胞经过遗传改造后,有的在裸鼠体内的致瘤性减弱,但体外软琼脂克隆行为没有发生明显改变。从128至169代次的Vero细胞均可在体外软琼脂中形成不同的细胞集落克隆,高代次细胞的集落形成率明显高于低代次细胞,但所有检测代次的细胞在裸鼠体内均未形成瘤。结论用软琼脂克隆法检测细胞的致瘤性与裸鼠体内接种法不仅具有良好的相关性,而且敏感性高于裸鼠体内接种法。

全反式维甲酸诱导HepG2细胞分化和降低软琼脂克隆形成

目的研究全反式维甲酸(ATRA)体外对人肝癌细胞株(HepG2)分化、软琼脂克隆形成的影响及其机制。方法ATRA处理HepG2,光镜下观察细胞形态,并检测γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、甲胎蛋白(AFP)等分化指标的变化;四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析ATRA对HepG2增殖的影响;软琼脂培养法观察HepG2的克隆形成能力;Western blot检测骨桥蛋白(OPN)表达变化。结果ATRA显著抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞分化,使代表肝细胞恶变的γ-GT比活力、AFP分泌量明显下降。ATRA可降低HepG2软琼脂克隆形成能力并使OPN表达减少。结论ATRA是HepG2有效的分化诱导剂,并可抑制HepG2增殖,其分子机制可能与OPN表达减少有关,为ATRA诱导分化治疗肝癌提供了实验依据。

三种不同生物学特性细胞在软琼脂中的生长表型分析

背景与目的软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力,但很早就有人根据形态学变化用它来检测低等生物的生物学特性。本文探讨利用软琼脂集落形成实验这种方法进行哺乳动物癌细胞表型初步分析的可行性。方法将三种不同生物学特性的细胞(小鼠成纤维细胞NIH3T3,高转移人肺腺癌细胞系Anip973,高浸润人肺腺癌细胞系L18)悬液接种到软琼脂中,分别在1天、5天、14天后观察细胞形态特征。结果第五天开始细胞集落形态出现差异,14天时差异更显著。NIH3T3细胞克隆为椭圆形,中等大小,边界清楚;Anip973克隆周围有大量游走细胞,表现出其转移特性;L18细胞克隆分支多并向周围延伸扩展,与其浸润特性相符。结论软琼脂分析实验是一种良好的根据表型来观察及鉴定哺乳动物细胞生物学特性的方法。

一种简便的低氧环境软琼脂细胞集落形成测定方法

细胞软琼脂集落形成试验,是测定细胞增殖力最可靠的技术之一,广泛应用于肿瘤细胞生物学和实验化疗等学科的研究。目前,人们普遍利用软琼脂集落形成测定技术来区分正常与恶性细胞、预测临床肿瘤患者对化疗的敏感性、以及筛选和开发新的抗癌物质。然而,直接取材的原代肿瘤细胞甚至已建成系的肿瘤细胞在体外软琼脂集落形成率均很低,因而在一定程度上限制了这一技术的推广使用。国内外许多学者曾尝试各种培养方法,以提高肿瘤细胞的软琼脂集落形成率。近年来有不少研究者指出,空气中氧浓度过高,不利于体外培养细胞生长。

嵌合抗原受体T细胞在软琼脂中克隆形成能力及体外致瘤性初探

目的研究嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞产品在软琼脂中形成克隆的可能性,从而评价其体外致瘤性,为其临床应用提供安全性依据。方法采用6孔板固态培养法,按不同密度(每孔1000~5000个)将CAR-T细胞与软琼脂混合铺板,同时设立Hela细胞为阳性对照,计数克隆形成率。结果空白对照组及受试物低(每孔1000个)、中(每孔2000个)、高(每孔5000个)剂量组在培养后14 d内均未见细胞集落产生。阳性对照组14 d时有细胞集落出现。结论CAR-T细胞体外培养不具有软琼脂克隆形成能力,利用软琼脂克隆形成实验可初步考察CAR-T细胞的体外致瘤性。

单胞藻软琼脂克隆固体培养基保藏技术

单胞藻藻种的保藏技术,国内外多采用的是液体低温保藏技术,此方法保种时间短、营养盐消耗速度快、易污染、工作量大。试验改用单胞藻软琼脂克隆固体培养基保藏技术,能够使营养成分缓慢的释放;软琼脂固体培养基的表面覆盖0．3 cm厚度的单胞藻培养液,可防止固体培养基水分的挥发;使单胞藻藻种在低温(8-10℃)环境中能够保藏较长的时间(2-3年)。

原丝蛋白对细胞在软琼脂中集落形成的影响

本研究采用原丝蛋白基因低表达的小鼠乳癌温度敏感变异株tsFT10 1细胞及野生株FM3A细胞 ,探讨原丝蛋白对细胞在软琼脂中集落形成的影响。应用Lipofection方法向tsFT10 1细胞内导入原丝蛋白表达基因 ,使用North ernblot方法检测各细胞株原丝蛋白mRNA表达水平 ,观察各细胞株在软琼脂中的集落形成情况。结果可见原丝蛋白mRNA表达水平由高至低的顺序是FM3A细胞、经基因转染的tsFT10 1细胞及未做处理的tsFT10 1细胞。在0 33%软琼脂中形成的集落大小与此顺序相对应。结果表明 。

应用软琼脂培养法筛选抗癌药物及获得耐药克隆细胞的研究

目的 :探寻可靠的诱导细胞分化剂和筛选有效抗癌药物的最佳剂量及配伍 ,并获得耐药克隆细胞。方法 :向软琼脂糖培养基内添加促分化剂全反式维甲酸 (RA)和 /或免疫制剂抗人Fas抗体 ,在评估不同处理因素下 ,对人胶质母细胞瘤系LN 4 2 8的细胞克隆形成能力影响的同时 ,获得耐药克隆细胞。结果 :在不同处理条件下 ,LN 4 2 8细胞克隆形成能力有明显差异。获得正常对照组和含 10 μmol/LRA的LN 4 2 8克隆细胞 ,在形态学上明显不同。同时含有 10 μmol/LRA +10 0ng/ml抗Fas抗体的培养基内 ,则无细胞克隆形成。 结论 :应用软琼脂培养 ,能有效检测化学制剂对肿瘤细胞的杀伤或促分化效应。探寻针对抗LN 4 2 8肿瘤的最佳药物剂量和配伍 ,同时进一步分离出耐药的克隆细胞 。

单胞藻软琼脂克隆固体培养基保藏技术

单胞藻藻种的保藏,国内外一般采用液体低温保藏技术,这种方法保种时间短.改用单胞藻软琼脂克隆固体培养基保藏技术,能够使营养成分缓慢地释放;软琼脂固体培养基的表面覆盖0.3cm厚度的单胞藻培养液,可防止固体培养基水分的挥发;使单胞藻藻种在低温(8～10°C)环境中能够保藏较长的时间(2～3年).

新鲜取材的人体肿瘤标本在软琼脂中直接克隆培养(简报)

我们在利用人癌细胞系进行克隆形成试验的基础上,摸索了一些适用于新鲜取材的人体肿瘤标本克隆培养的条件,成功地对26例恶性肿瘤细胞克隆生长进行了评价。其方法如下: 实验标本来自本院外科和门诊手术肿瘤患者。其中卵巢癌实体肿瘤9例,卵巢癌腹水13例,肺癌胸水例,转移性胃癌腹水1例,都经病理学或细胞学检查确诊。实体肿瘤标本剪碎后在胶原酶和脱氧核糖核酸酶溶液中进行单细胞消化,分离。胸腹水细胞离心后,用氯化铵去除红细胞。

软琼脂克隆形成实验评价药物体外抑瘤性与成瘤性

目的:分别采用肿瘤细胞系和转化细胞系摸索软琼脂克隆形成实验的适宜条件,并对冬凌草甲素(oridonin,ORI)的抑瘤性和没食子酸乙酯(ethyl gallate,EG)促瘤性进行评价。方法:1)摸索实验条件:采用6孔板固态培养法,按不同密度(每孔500~20 000个)将肿瘤细胞系(Hela,K562和Hep G2)和转化细胞系(Bhas 42)与软琼脂混合铺板,计数克隆形成率。2)Hep G2细胞分别与质量浓度为0.016、0.08、0.4、2、10、50μg·mL^(-1)的ORI溶液混合后铺板;Bhas 42细胞预先经质量浓度为0.3、1、3μg·mL^(-1)的EG溶液处理后,镜下观察细胞达到转化状态后,与软琼脂混合铺板培养。经培养后观察给药处理对克隆形成率的影响。3)利用流式细胞仪分析ORI和EG对细胞周期的影响。结果:细胞接种密度为每孔1 000个左右时,利用肿瘤细胞和转化细胞开展软琼脂克隆形成实验效果较好。ORI作为抑瘤药物在低浓度条件可显著降低Hep G2细胞的克隆形成率(P<0.01),且对细胞增殖有抑制作用。EG随给药浓度增加可显著升高Bhas 42的克隆形成率(P<0.01),但对细胞增殖影响不显著。结论:软琼脂克隆形成实验以克隆形成率为检测指标,可较为简便而灵敏地检测药物引起的抑瘤性和促瘤性。该实验结果与细胞周期分析结果相互印证。两者的有机结合,可用于药物对细胞增殖及成瘤性的影响的初步分析。

利用激光扫描影像系统对软琼脂和超低粘附板中的3D肿瘤球体或干细胞克隆球体进行快速检测和分析

1介绍 发现新的抗癌药物的研究目前正面临着重要的挑战,因为在临床前研究显示有效果的化合物只有5%的能继续被开发,成为获得许可的药物。传统的2D细胞培养模型在药物发现过程的早期阶段被用于评估候选药物,然而,有越来越多的证据表明,在二维单层生长的细胞并不能准确地反映肿瘤的生物学复杂性。

HepG2细胞在不同琼脂糖浓度下克隆形成能力的比较

目的:探讨分离细胞克隆的最佳细胞密度和最适琼脂浓度,为肿瘤干细胞的筛选提供更广阔的思路.方法:将HepG2单细胞悬液与10g/L的琼脂糖相混合,在2g/L(A组)和3g/L(B组)琼脂中接种不同密度的HepG2细胞,14d后观察克隆形成.结果:100-1000个/孔的各个实验组中,A组细胞的克隆数高于B组,差异有统计学意义(t=4.36,P<0.05);在细胞密度为100-500个/孔时,A、B组细胞克隆形成率随着细胞密度的增加逐渐增加;600-1000个/孔,A、B组均随着细胞密度的逐渐加大,克隆形成率呈现下降趋势.结论:在进行软琼脂克隆形成实验时,可以采用2g/L的上层琼脂浓度,并采用10g/L的琼脂糖凝胶作为储备胶,HepG2细胞在500个/孔时的克隆形成率最高.

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提?

从形态及功能研究MNNG诱导GES-1永生化细胞的恶性转化

目的探讨甲基硝基亚硝基胍(methyl nitro nitrosoguanidine,MNNG)作用于GES-1永生化细胞所发生的恶性转化。方法 MNNG作用于GES-1永生化细胞24 h后,通过显微镜和软琼脂集落形成实验观察细胞形态学、染色体变化和集落形成情况。统计采用t检验。结果经MNNG处理的GES-1细胞(命名为MC)核增大,畸形,核染色质变粗,核仁肥大,核分裂。染色体可见双倍及多倍体,染色体断裂。克隆形成实验可见细胞接触抑制消失克隆形成,t=5.139,P<0.05。结论经MNNG诱导的GES-1细胞的生长特性改变,呈现肿瘤细胞的形态学及生长特征。

转染FRZB基因对人胃癌SGC-7901细胞生长和转移的影响

背景与目的:FRZB(frizzled motif associated with bone development)是sFRP(secreted frizzled related protein)家族的成员,在胚胎发育过程中起重要作用。有文献报道FRZB的表达能抑制基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和MMP-9表达而与前列腺癌的侵袭能力相关。本研究拟探讨FRZB基因对人胃癌SGC-7901细胞成瘤性和侵袭能力的影响,及其可能的机制。方法:构建FRZB真核表达载体并转染SGC-7901细胞,经G418筛选获得稳定表达克隆。用MTT法检测并绘制细胞增殖曲线,软琼脂培养和裸鼠皮下注射的体外和体内实验检测细胞成瘤性变化。用细胞免疫化学检测转染FRZB后细胞中MMP-2、MMP-7、MMP-9的表达变化,体外侵袭和粘附实验检测细胞侵袭能力变化。结果:筛选稳定表达细胞株经定量PCR检测,FRZB表达显著提高。体内外实验证实,转染FRZB的细胞(SGC-7901/FRZB)生长抑制率约为60%,克隆形成能力和成瘤性减弱。免疫细胞化学显示MMP-2、MMP-7、MMP-9在细胞浆内的阳性表达降低或接近阴性,对细胞外基质成分(CollagenI、IV、Vitronectin、Fibronectin、Laminin)粘附能力均增高,比空载体转染对照组(SGC-7901/vector)增加12.8%、19.8%、59.8%、26.7%、15.2%,差异具有显著性(P<0.05),而空载体转染对照组与亲本细胞间差异无统计学意义(P>0.05)。SGC-7901、SGC-7901/vector和SGC-7901/FRZB细胞侵袭能力分别是每高倍视野55.90±5.68、54.80±6.97、6.60±2.63,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:FRZB高表达在体内体外均可抑制SGC-7901细胞的增殖、成瘤性和侵袭能力,具有肿瘤抑制基因的功能。FRZB抑制肿瘤细胞的生长和抑制MMP-2、MMP-7、MMP-9的表达为抑癌功能相关机制之一。

紫龙金抑制人乳腺癌细胞系MCF-7生长的体内外实验研究

目的探讨复方中药紫龙金在体内和体外对MCF-7人乳腺癌细胞生长的抑制作用及其作用机制。方法 (1)台盼蓝拒染法和双层软琼脂克隆形成法检测紫龙金对MCF-7细胞增殖活性和克隆形成的影响;(2)Westernblot法检测紫龙金对p-ERK1/2蛋白表达的影响;(3)17-β-雌二醇缓释药片包埋法构建MCF-7细胞的BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,并检测紫龙金(实验组灌胃生药20g紫龙金/kg体重)对肿瘤生长的抑制效应。结果 (1)紫龙金降低MCF-7细胞的存活率,并呈剂量和时间依赖性;(2)紫龙金组MCF-7细胞克隆形成率显著低于对照组,且随着浓度的增加,克隆形成能力明显降低[0.75、1.5、3.0、6.0mg/mL紫龙金组细胞克隆形成抑制率分别为(12.66±1.54)%、(88.83±2.13)%、100%、100%],克隆直径也明显减小或无克隆形成;(3)紫龙金下调p-ERK1/2蛋白的表达;(4)实验组裸鼠与对照组裸鼠4周后移植瘤的平均体积分别为(0.73±0.58)cm3、(1.36±0.64)cm3,平均瘤重分别为(1.02±0.25)g、(1.66±0.09)g,两组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),实验组抑瘤率为38.55%。结论紫龙金可显著抑制MCF-7细胞的体内和体外增殖、转化和致瘤性,这可能与p-ERK1/2蛋白的表达下调有关。

利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体

旨在利用改良后的脾内免疫和半固体培养基法制备单克隆抗体,节约免疫原用量、简化试验操作、一步法筛选和克隆杂交瘤细胞、缩短单抗制备周期。通过局部麻醉小鼠脾脏区域皮肤,切开后透过腹膜直接向脾脏内注射微量抗原,使小鼠的脾细胞在短时间内产生免疫反应,尾静脉注射强化免疫后进行细胞融合;选取半固体培养基(甲基纤维素、软琼脂)法,以有限稀释法作对照筛选分泌高效价抗体的杂交瘤细胞。结果显示,与传统的单抗制备方法相比,改进后的脾内免疫操作更简单,联合尾静脉注射,使用微量免疫原在短时间内产生高效价抗体;半固体培养基甲基纤维素浓度在1.1%条件下,获得克隆团较多,阳性率较高。本研究方法适用于大规模制备单克隆抗体。