内质网应激在软脂酸钠诱导的脂肪变性L02肝细胞凋亡中的作用

目的观察内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)蛋白在软脂酸钠诱导的脂肪变性L02肝细胞凋亡过程中的改变,探讨ERS与脂变肝细胞凋亡的关系。方法用软脂酸钠(饱和脂肪酸)诱导建立L02肝细胞脂肪变性模型。将细胞分为正常对照组和实验组(软脂酸钠72μmol/L)。MTT法筛选软脂酸钠最佳作用浓度;油红O染色和甘油三酯(TG)试剂盒检测细胞内脂变程度;流式细胞术Annexin V-PE/7-AAD双染检测细胞凋亡率;Western blot检测GRP78、CHOP、磷酸化JNK(p-JNK)蛋白表达。结果软脂酸钠在体外能够诱导肝细胞发生脂肪变性以及脂变肝细胞凋亡,与对照组(1.38±0.42)比较,实验组48 h细胞凋亡率(5.95±0.37)显著增加(P<0.05)。Western blot检测示软脂酸钠刺激肝细胞12 h,GRP78表达(0.50±0.03)较0 h(0.37±0.02)明显增加,48 h(0.83±0.01)达高峰(P<0.05)。CHOP和p-JNK表达与GRP78几乎同步增加。结论软脂酸钠对L02肝细胞具有较强的脂毒性,可以诱导肝细胞发生ERS反应。ERS上调CHOP和P-JNK表达可能在软脂酸钠诱导脂肪变性肝细胞凋亡中具有重要作用。

软脂酸钠法纯化牛血清白蛋白的工艺研究

目的研究软脂酸钠法纯化牛血清白蛋白的最佳工艺。方法以牛血清白蛋白提取率为考察指标,通过正交试验和单因素试验,研究软脂酸钠加入时的温度和加入量、血清稀释度、放置时间及水浴时间对白蛋白提取率的影响,并分析产品质量。结果该工艺白蛋白提取率达41.1%,白蛋白含量达95.0%以上。血清稀释度对白蛋白提取率影响大,放置时间次之。该法纯化牛血清白蛋白的条件为软脂酸钠加入时的温度为70℃、加入量1∶2/3,血清稀释度为1∶1,放置时间为1 h,水浴时间为1.5 h。结论该工艺是实现高效、快速纯化牛血清白蛋白的有效方法。

白藜芦醇对软脂酸钠诱导的肝细胞脂肪变性的影响

目的:研究白藜芦醇对软脂酸钠诱导的细胞内甘油三酯沉积的影响。方法:用软脂酸钠诱导法使HepG2细胞内甘油三酯沉积,建立细胞脂肪变性模型,将实验分为对照、白藜芦醇、高脂及高脂+白藜芦醇组,用油红O染色法定量检测各组细胞内甘油三酯的浓度。结果:0.2 mmoL软脂酸钠可引起明显的细胞内甘油三酯沉积(P<0.05),而40μmoL白藜芦醇则可抑制软脂酸钠的这一效应,使细胞内的脂质浓度几乎降至基线水平。结论:白藜芦醇可改善软脂酸钠诱导的肝细胞脂肪变性。

PERK/ATF4/CHOP信号通路在饱和脂肪酸诱导肝细胞脂毒性凋亡中的作用

目的研究在饱和脂肪酸软脂酸钠诱导肝细胞脂毒性凋亡过程中,蛋白激酶R样内质网激酶(PKR-like ER kinase,PERK)/活化转录因子4(activating transcription factor 4,ATF4)/C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)信号通路的作用,对参与饱和脂肪酸诱导肝细胞脂毒性凋亡的主要UPR信号通路进行探讨。方法MTT法筛选不同浓度(0、36、72、108、144、180μmol/L)软脂酸钠作用L02和HepG2细胞株的最佳浓度后,将细胞分为正常对照组和模型组(软脂酸钠108μmol/L),甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三酯含量,流式细胞术Annexin V-PE/7-AAD双染检测细胞凋亡率,Western blot法检测Bip、t-PERK、磷酸化PERK(p-PERK)、ATF4、CHOP蛋白的表达。将PERK shRNA转染L02和HepG2细胞沉默PERK基因,以Control shRNA作为对照,将细胞分为Control shRNA、Control shRNA+软脂酸钠、PERK shRNA、PERK shRNA+软脂酸钠组,Western blot法检测t-PERK、ATF4、CHOP蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果软脂酸钠成功诱导建立肝细胞脂变模型。在体外实验中,软脂酸钠能够诱导肝细胞发生脂肪变性以及脂变肝细胞凋亡,细胞凋亡率随软脂酸钠诱导时间延长而增加,与对照组相比,模型组48 h细胞凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。软脂酸钠诱导L02和HepG2细胞0、12、24、48 h,各时间点Bip、p-PERK、ATF4和CHOP蛋白的表达呈时间依赖性增加(P<0.05)。在使用和不使用软脂酸钠诱导下,PERK shRNA组细胞t-PERK蛋白表达水平显著低于Control shRNA组(P<0.05);软脂酸钠诱导下,与Control shRNA组相比,PERK shRNA组细胞ATF4和CHOP蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率也明显降低(P均<0.05)。结论饱和脂肪酸能够诱导脂变肝细胞凋亡,并且启动过度内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress),激活PERK/ATF4/CHOP信号通路。阻断PERK通路能够在一定程度上抑制脂变肝细胞凋亡,提示ER stress UPR信号途径PERK/ATF4/CHOP参与了饱和脂肪酸诱导的肝细胞脂毒性凋亡。