一株新的胡萝卜软腐欧文氏菌的分离和鉴定

从大白菜软腐组织中分离出一株软腐病细菌BC1,经过形态观察、生理生化特性分析、致病性检测和 16SrDNA序列分析 ,该分离物被鉴定为胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种 (Erwiniacarotovorasubsp .carotovora ,Ecc)的一个新菌株 ,编号为BC1。这是首次从 16SrDNA序列水平上对在我国分布的软腐欧文氏菌进行鉴定。EccBC1的 16SrDNA序列与其它软腐欧文氏菌株的 16SrDNA序列之间同源性达 98 7%～ 99 3% ,而且在系统发育树中独立于Ecc其它菌株。序列分析结果表明 ,EccBC1具有至少 2种不同的 16SrDNA序列 ,它们都在第 4 5 9位和 4 73位 (相对于大肠杆菌 16SrDNA序列 )发生碱基突变 ,同一基因中两个突变位点之间彼此互补 ,处于 16SrRNA螺旋H17颈部 ,而且这两处碱基变异只存在于BC1菌株中。通过与其它软腐欧文氏菌亚种和菌株 16SrDNA序列进行比对分析 ,还进一步鉴定出一些BC1菌株特异的 16SrDNA碱基突变位点。本文报道的EccBC1两个 16SrDNA序列在GenBank中的登录号分别为AY30 90 6 8和AY30 90 6 9。

镧对软腐欧文氏菌生长及其胞外酶活性的影响

研究了镧对软腐细菌（Ｅｒｗｉｎｉａｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ，Ｅｃｈ）生长及胞外酶活性的影响。结果表明，Ｌａ３＋浓度为５０、１００、１５０、２００、２５０、３００和３５０ｍｇ／Ｌ时，固体培养中对Ｅｃｈ生长均呈抑制作用，且随浓度提高，抑制作用加强，表现为菌落出现时间比对照延长，７ｄ后的菌落直径比对照减小。液体培养中，浓度＜２００ｍｇ／Ｌ，Ｌａ在２４ｈ内对Ｅｃｈ生长有轻微刺激作用；但随着浓度提高和培养时间的延长，Ｅｃｈ生长明显受到抑制。当Ｌａ３＋浓度＞３５０ｍｇ／Ｌ，Ｅｃｈ生长基本处于停止状态；浓度为２００ｍｇ／Ｌ，对Ｅｃｈ产生胞外酶能力有一定影响，其中对纤维素酶活性增强最明显，其次是蛋白酶，而对果胶酶活性有减弱作用。经稀土处理的无细胞滤液对马铃薯块茎组织的浸离力降低。

胡萝卜软腐欧文氏菌分子检测技术的研究

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Erwinia carotovorasub sp.carotovora(Ecc)是引起魔芋和马蹄莲软腐病的主要病原细菌.本研究根据细菌L-氨基酸渗透酶同源基因设计URP核苷酸序列特异性引物进行普通PCR、巢式PCR,同时采用细菌16S-23S rDNA间的ITS序列设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR,对样品中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌进行检测,并比较了3种检测方法的特异性和灵敏度.结果表明,应用实时荧光PCR方法检测样品,其中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌的最低菌悬液浓度可达10 cfu/mL;巢式PCR灵敏度也可检测到10 cfu/mL;而用普通PCR最低可检测到103cfu/mL.用实时荧光PCR和巢式PCR方法检测病菌,其灵敏度都比常规PCR提高了100倍,且实时荧光PCR方法更快速、简便、安全、准确,不需PCR的后续处理.实时荧光PCR方法适用于种苗、种球等检测领域.

软腐欧文氏菌致病性的研究进展

由Ecc,Ech,Eca三种主要病原菌引起的软腐病是世界农业生产上危害很严重的病害之一。目前,对软腐欧文氏菌与植物的互作在世界范围内的大量研究,已经为深入揭示其致病的分子机理提供了有效帮助,并将为软腐病的有效防治提供新的思路和手段。文章将就软腐欧文氏菌的重要致病因子、致病过程中病原菌与植物的基因表达等作综述。

胡萝卜软腐欧文氏菌CXJZU-120的选育及其脱胶性能研究

为寻求更适宜于生产应用的麻类生物脱胶高效菌株,对苎麻脱胶菌株CXJZ95-198进行紫外诱变,存活菌株的生理特性研究和脱胶功能实验发现:紫外线处理120 s获得的变异菌株CXJZU-120性状稳定;在5.5～6.0 h完成苎麻脱胶,总胶质脱除率达87.22%;该菌经10.0 h培养,发酵液中的果胶酶、β-甘露聚糖酶和木聚糖酶活分别为211.2 U/mL、374.8 U/mL和96.6 U/mL;该菌株在固态培养基中培养16.0～17.0 h开始显棕褐色,液态发酵培养基中培养5.0～5.5 h开始显蓝绿色,接种到苎麻上发酵5.0～5.5 h开始显蓝色。该结果表明,变异菌株CXJZU-120与出发菌比较,不仅在脱胶功能和产酶性能上有所提高,而且繁殖速度快,发酵时具有特别的显色现象,对于该菌在生产中的应用具有重要意义。

菌体脂多糖在大白菜软腐欧文氏菌对寄主根表吸附中的作用

用两种方法分别洗除菌体胞外多糖(EPS)和脂多糖(LPS),经在大白菜幼苗上测定表明,菌体洗除 LPS 后对寄主根表的吸附能力明显减弱,吸附菌量随无 LPS 的菌体在混合接种体中比例的增高而降低,在无 LPS 的菌体接种体中加入 LPS 提取物,可使吸附能力恢复到正常水平;平行测定的 EPS 不发生上述影响。用 EPS 和 LPS 对根表进行预处理,均可明显抑制完整菌体(不洗,含 EPS 和 LPS)和无 EPS 的菌体对根表的吸附,但只有 LPS 预处理使无LPS 的菌体吸附量提高2—3倍。用大白菜对该菌的专化性细菌凝集素 Agin-SD60所作的菌体凝集试验表明,菌体洗除 LPS 后不再被 Agin-SD60所凝集。根据以上结果认为,菌体脂多糖在大白菜软腐欧文氏菌与寄主的接触识别中可作为细菌识别子起作用。

Ca^(2+)、Mn^(2+)等8种金属离子对软腐欧文氏菌一些致病因子的影响

在离体试验中,不同金属离子对马铃薯软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora)菌株StEcc-12生长,产生胞外酶和胞外酶活性具有不同的影响。在含果胶酸钠的培养液中,Ca^(2+)促进生长,并使培养液中的果胶裂解酶(PL)、果胶水解酶(PG)和蛋白酶3种胞外酶分别提高1.4～23.4倍,0.3～2.9倍和0.7～6.5倍。Mn^(2+)对StEcc-12生长及产生3种胞外酶的影响与Ca^(2+)相似。Ni^(2+)显著抑制细菌的生长,但在含Ni^(2+)培养液中3种胞外酶的单位活性比对照高1.7倍以上。在酶粗提液中分别加入上述3种离子对PL酶的活性均有抑制作用。Zn^(2+)对细菌生长没有显著影响,高浓度Al^(3+)抑制细菌生长,这2种离子均能促进3种胞外酶的产生。随着Fe^(2+)和K^+浓度的增高,细菌生长减少,两种果胶酶产量降低,蛋白酶产量增加,粗提液中PL酶活性下降。Mg^(2+)对细菌生长和胞外PG产生没有明显影响,提高Mg^(2+)浓度有利于PL的产生。酶粗提液中加入Mg^(2+)后PL活性增高。所有以上离子都能使聚半乳糖醛酸发生不同程度的凝聚,但只有Ca^(2+)和Mg^(2+)的有效凝聚浓度与薯块的实际浓度接近。

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI)。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8 kD,与预期分子量相符。经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致。

几种杀细菌剂对胡萝卜软腐欧文氏菌的毒力测定

采用室内抑菌圈法测定了6种杀细菌剂对胡萝卜软腐欧文氏菌马铃薯黑胫病亚种(Erwiniacaroto-vorasu sp.atroseptica)的毒力,筛选出2种有明显抑菌作用的药剂72%农用硫酸链霉素可湿性粉剂和90%链霉素.土可溶性粉剂,抑菌效果显著,EC50分别为0.0921mg.mL-1和0.0972mg.mL-1。

软腐欧文氏菌对大白菜幼根吸附的接种菌量阈值

用9种含菌量的菌悬液接种大白菜幼苗根系,分别检测病菌对幼根各分区表面的吸附菌量,估计出了病菌对根不同分区表面吸附所需的接种菌量阈值(菌悬液含菌量低限),为研究吸附性质和机制打下了基础。

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种Ecb菌株表达的一种Harpin蛋白

1986年,hrp基因被首次报道。由于Wei等（1992）从梨火疫病菌（Brwinia amylovora）中分离出了能激发过敏反应的HarpinEa蛋白,细菌所产生的Harpin分子受到了同行的重视。基于对Harpin蛋白的深入研究,国外已研制出了相关新型、高效、安全的生物农药。近年来,国内涉及Harpin蛋白结构与功能的研究课题组逐年增多,并在某些方面取得了较好的进展。

大白菜根组织中细菌凝集素含量与软腐欧文氏菌吸附和侵染的关系

用大白菜4个品种进行的测定表明,软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp. carotovora)从寄主根系侵入的菌量与它对寄主根细胞表面吸附的菌量间存在正相关关系。在测定的寄主根组织两种物质中,细菌凝集素(BAG)含量的高低与病菌的根表吸附量和根系侵入量的高低呈正相关趋势;随幼苗的生长,吸附菌量和侵入菌量与BAG含量呈平行下降趋势;细胞壁蛋白质(CWP)含量与病菌吸附和侵染之间也有类似关系。结合以前的研究分析认为,BAG是作为吸附中的植物识别子而影响吸附和侵入的,而CWP则作为一种菌体粘联因子对吸附和侵入发生影响。

关于大白菜—软腐欧文氏菌互作的某些新观点

以病菌根系侵入、系统性潜伏侵染为主要环节的病害循环;寄主—病菌接触识别;潜伏侵染和致病或发病状态转变中的寄主—病菌互作;互作的阶段性和专化性等,是近10年来对大白菜软腐病重新研究和认识的主要观点。这些观点对探讨和实施病害控制的新途径已产生重要的指导作用。

软腐欧文氏菌对大白菜根毛吸附的专化性

分3个层次测定了软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora susp carotovora)对大白菜根毛吸附的专化性.病菌吸附表现出对寄主根毛表面的选择性、病原细菌与寄主问的专化性、吸附菌量在病菌不同菌株和奇主不同品种间的差异.讨论了病菌吸附专化性在寄主-病原物识别中的意义.

胡萝卜软腐欧文氏菌CSSY002菌株hrpN基因的克隆、鉴定及其表达产物Harpin蛋白的活性分析

从感染软腐病的胡萝b组织中分离出胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝b亚种（ Erwinia carotovora subsp, carotovora）CSSY002菌株．用该菌株接种非寄主植物烟草不能引起过敏反应．构建CSSY002菌株的基因组文库，应用α-P^32标记的hrpN基因作探针，通过菌落原位杂交技术从该文库中筛选到1．5～2．0 kb的hrpN-like阳性克隆，进一步将该片段亚克隆到pBluescript—II SK（＋）载体中，进行核苷酸序列测定．结果表明，hrpN-like基因（即hrpNCSSY002基因）的开放阅读框（ORF）为1071bp，其核苷酸序列已在Genbank注册，登录号为bankit AY999002．hrpN-like基因的编码产物Harpin—like蛋白（即HarpinCSSY002蛋白）由356个氨基酸残基组成，分子量为36．64×10^3，等电点pI5．9．将hrpN—like基因构建到表达质粒pET-28a（＋）的17强启动子下，并转化到大肠杆菌工程菌JM109（DE3）细胞中，经WTG（异丙基硫代-β-D半乳糖苷）诱导获得Harpin-like蛋白的高效表达，并通过接种烟草叶片的过敏反应检测Harpin—like蛋白的生物学活性．

软腐欧文氏菌代谢网络重构及其在靶标筛选中的应用

欧文氏杆菌(Erwinia)是一类重要的农作物致病细菌,侵染宿主范围广,在世界范围内造成了严重的经济损失,其中Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043 (Eca SCRI1043) 可导致马铃薯感染黑胫软腐病,危害极大。本文构建了Eca SCRI1043基因组的代谢网络,并进行拓扑结构和流平衡分析,以此筛选出网络的中心节点。若中心节点所代表的酶收录在TTD数据库中,则此酶可作为农用杀菌剂的候选靶标。随后选取靶标十一异戊二烯焦磷酸酶(Upps),采用specs公司的商品化合物数据库作为小分子数据库,对靶标进行高通量虚拟筛选,对综合打分结果最好的前400个化合物进行目筛后得到73种先导化合物,这73种先导化合物可以进一步进行后续生测实验以确定其杀菌活性。

四株胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种新菌株的分离鉴定

采用棋盘式取样法,从正茬、重茬、连作2年和连作3年的马铃薯播前、现蕾期、成熟期和收获期4个不同阶段采集马铃薯根围土样。以稀释平板法,用选择性培养基CVP分离软腐欧文氏杆菌,共得到42个菌株。在形态学观察和生理生化特性测定的过程中发现编号为GAUP-b410、GAUP-b492、GAUP-b416和GAUP-d34等4个菌株的主要性状一致,且与其他菌株的性状不同。致病性测定结果显示,这4个菌株均能引起马铃薯薯片腐烂。对其中的2个菌株进行了16S rDNA序列分析,其PCR产物的序列与GenBank上登记的18个分离自中国大白菜上的Erwinia carotovorasubsp.carotovora菌株的亲缘关系最近,同源性均达99%。利用DNAStar软件绘制系统发育树状图,菌株GAUP-b410亦与这18个E.carotovorasubsp.carotovora菌株位于系统发育树的同一分支,聚为一类;菌株GAUP-b492与其中的16个E.carotovorasubsp.carotovora菌株位于系统发育树的同一分支,聚为一类;结合生理生化特性和16S rDNA序列分析,确定这4个菌株为胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜亚种(E.carotovorasubsp.carotovora)新菌株。

魔芋软腐病菌分子鉴定与遗传多样性

通过对分离的魔芋软腐病菌株和其它参试菌株的致病性测定、选择性培养基培养性状观察和16S-23S rDNA转录间隔区PCR(ITS-PCR)分析,将测试的33株软腐病菌株主要分为3个组群。第1组群为胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐亚种(Erwinia carotovorasubsp.carotovora,E.c.c.);第2组群为菊欧文氏杆菌(Erwinia chrysanthemi,E.ch.);还有一组未能确定的菌株。利用细菌基因组重复序列通用引物BOX和J3进行Rep-PCR特异性扩增,引起软腐病的菌株E.c.c.和E.ch.(ITS-PCR鉴定)种内的Rep-PCR指纹存在明显的遗传分化,经聚类分析,在0.1水平上把E.c.c.13株区分为5个类群。

芋头软腐病拮抗菌的筛选及生防效果研究

分别从蔬菜田土壤和采后芋头表面黏附土壤中分离纯化到267和244株菌株,通过平板拮抗实验,发现其中6个菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)产生了清晰且明显的拮抗圈(直径>10 mm)。利用芋头对它们的生物防控效果进行复筛,结果发现BGP14菌株发酵液处理芋头的发病率仅为6.7%,显著低于其他5个菌株(P<0.05)。根据BGP14的形态学特征、芽孢产生及16S rRNA和gyrB基因的部分核酸序列,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌BGP14(Bacillus amyloliquefaciens)。BGP14在芋头伤口上具有较强的定殖能力,并将病原菌Ecc的群体数量压制在一个较低水平。BGP14与病原菌Ecc联合处理芋头的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性显著高于其他处理。以上结果表明,解淀粉芽孢杆菌BGP14对病原菌E.carotovora具有强大的拮抗活性,能够有效防治贮藏期芋头软腐病,具有潜在的应用开发前景。

风信子软腐病病原的鉴定和杀菌剂试验

在上海生长的风信子发生软腐病的球茎中分离了菌株EP,对纯化的菌株EP进行传统方法鉴定;并进行16SrDNA序列同源性分析,结果表明EP与Erwinia carotovorasubsp.carotovora同源性达到97%,确定风信子软腐病病原为Erwinia carotovora subsp.carotovora。风信子软腐病病菌在不同杀菌剂浓度下的生长试验表明,杀毒矾抑菌效果最好,有效浓度0.64×10-6g/mL时细菌停止生长,其次为吗啉胍乙铜和农用链霉素可溶性粉剂,有效浓度分别为2×10-4g/mL和5.76×10-4g/mL时,细菌停止生长。