硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球的制备及其体外性质

背景:硫酸软骨素酶ABC能够分解脊髓损伤局部持续产生的硫酸软骨素蛋白多糖,从而促进轴突的生长,但该酶性质不稳定,需要多次局部用药。目的:制备硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球,观察其体外释药特性。设计、时间及地点:重复测量设计,于2006-03/2007-01在中国科学院成都有机所和四川大学华西医学中心药理实验室完成。材料:聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、硫酸软骨素酶ABC、CH2Cl2、硫酸软骨素B。方法:复乳法制备硫酸软骨素酶ABC缓释微球,并以生理盐水为体外释药介质。主要观察指标:扫描电镜下观察硫酸软骨素酶ABC缓释微球的形态。应用Malvern激光粒度分布测试仪测定其粒径分布并自动计算微球的平均粒径和径距。采用酶解分光光度测定硫酸软骨素酶ABC含量,并计算载药量与包封率。于0.5,1,1.5,2,3,4,6,8,10,12,14,16,18,21d取样,绘制体外释药曲线。结果:硫酸软骨素酶ABC缓释微球形态均匀,其平均粒径5.538μm,径距1.479,呈正态分布。平均载药量(15.55±0.90)×10-3%,平均包封率(53.88±1.45)%,硫酸软骨素酶ABC微球在3周内的体外累积释药分数为0.8514,释药平稳,其最佳体外释药拟合方程为Weibull方程:lnln(1/1-Y)=0.7396lnX-1.617,R2=0.9933。结论:所制备的硫酸软骨素酶ABC微球形态均匀,粒径分布窄,再分散性好,3周内能维持有效的药物浓度。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖与胶质纤维酸性蛋白表达的影响

目的探讨硫酸软骨素酶ABC对严重脊髓损伤(SCI)大鼠硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达的影响。方法制作大鼠脊髓横断伤模型,60只大鼠随机分为对照组10只、损伤组25只和治疗组25只。治疗组给予硫酸软骨素酶ABC髓鞘浸润治疗。用免疫荧光组织化学观察脊髓CSPGs的表达;用免疫荧光组织化学及Western-blot方法观察脊髓GFAP的表达。结果 SCI后星形胶质细胞明显活化增殖,CSPGs和GFAP的表达明显增加(P<0.05);治疗组脊髓CSPGs和GFAP的表达均较损伤组减少,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论硫酸软骨素酶ABC能够裂解CSPGs,改善SCI区的微环境,改善GFAP蛋白的表达,是修复SCI,促进神经再生的机制之一。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠急性脊髓损伤后神经中丝和胶质纤维酸性蛋白的影响

目的:探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对大鼠急性脊髓损伤后神经中丝200(NF200)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的影响。方法:SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组(A组)、损伤对照组(B组)和ChABC治疗组(C组),每组24只。A组仅打开椎板及置管,不损伤脊髓,不给药;C组和B组均采用Allen′s法制作大鼠T10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下腔注射ChABC(6μl/次)和等量生理盐水。术后1d、1周、2周和4周每组各处死6只大鼠,B组和C组以损伤区为中心、A组在相应部位切取1cm长的脊髓组织,以HE染色观察脊髓组织形态变化,应用免疫组化方法检测脊髓组织中NF200和GFAP的变化。结果:HE染色示A组脊髓无胶质细胞增生和胶质瘢痕形成;B、C组脊髓损伤区有胶质细胞增生和胶质瘢痕,C组明显少于B组。A组术后1d、1周、2周和4周时NF200阳性细胞数及灰度值和GFAP染色阳性面积无差异,1、2、4周时B、C组脊髓损伤区NF200染色阳性细胞数及灰度值和GFAP染色阳性面积均较A组显著增加(P<0.05或P<0.01),1d和1周时C组NF200染色阳性细胞数及灰度值与B组比较无显著性差异,2周和4周时C组明显高于B组(P<0.05);1d、1周和4周时C组GFAP染色阳性面积与B组无显著性差异,2周时C组显著小于B组(P<0.05)。结论:ChABC能提高大鼠急性脊髓损伤后神经细胞内NF200的表达并抑制GFAP的表达,进而促进神经细胞的修复,抑制胶质细胞的增生和胶质瘢痕的形成,对脊髓损伤具有保护作用。

骨髓间充质干细胞与硫酸软骨素酶ABC联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用及其机制

目的观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)与硫酸软骨素酶ABC(ChABC)联合移植对大鼠脊髓损伤的修复作用,并探讨其机制。方法 80只脊髓亚急性损伤大鼠随机分为4组各20只。损伤后第6天,A组先后移植2.0×10~6/μL的原代BMSCs细胞悬液、1 U/mL的ChABC各20μL,B组予等量BMSCs,C组予等量ChABC,D组予等量PBS。比较各组运动功能评分(BBB评分)、脊髓损伤区面积及后肢体感诱发电位(SEP)、经颅磁刺激运动诱发电位(MEP)潜伏期和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长相关蛋白-43(GAP-43)、脑源性神经生长因子(BDNF)阳性细胞百分比。结果与D组比较,其余3组制模后第1天BBB评分降低,第14、28天BBB评分升高;与A组比较,B、C组BBB评分降低(P均<0.05)。与同组移植前比较,其余3组SEP、MEP潜伏期短;与A组比较,B组SEP潜伏期长,C、D组SEP潜伏期短;与A组比较,其余3组MEPP潜伏期短;P均<0.05。与其余3组比较,A组损伤区面积小(P均<0.05)。与D组比较,其余3组GFAP阳性细胞百分比低,GAP-43、BDNF阳性细胞百分比高;与A组比较,GFAP阳性细胞百分比高,GAP-43、BDNF阳性细胞百分比低;P均<0.05。结论 BMSCs与ChABC联合移植对大鼠脊髓损伤有修复作用,机制可能与其降低GFAP、GAP-43表达及升高BDNF表达有关。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后神经元修复的影响

目的探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对脊髓损伤后神经元修复的影响。方法SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组、生理盐水对照组和ChABC治疗组,采用Allen法打击大鼠胸10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天1次连续1周蛛网膜下注射生理盐水和ChABC。在伤后第1天,第1、2、4周应用免疫组化检测各组组织切片中NF200的变化,尼氏染色观测各组脊髓切片中尼氏体和神经元的改变,BBB评分检测损伤的后肢运动恢复情况。结果大鼠脊髓损伤后1d和1周给药组NF200着色面积、Nissl染色阳性细胞和BBB评分与生理盐水组比较差异无统计学意义。在2、4周,治疗组要显著优于生理盐水组(P<0.05)。结论ChABC能促进大鼠脊髓损伤后神经元的修复,提高后肢运动功能的恢复。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤修复的影响

为了探讨硫酸软骨素酶ABC对脊髓损伤后损伤局部瘢痕形成和脊髓传导功能修复的影响,本研究首先制作大鼠脊髓全横断损伤动物模型,并将其分为脊髓损伤组(A组)和脊髓损伤治疗组(B组)。在观察期内对动物的行为学表现进行BBB评分;用免疫荧光组织化学方法观察损伤4周后硫酸软骨素酶ABC对损伤局部的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs)的裂解作用;用辣根过氧化物酶(HRP)示踪法观察损伤8周后神经纤维的再生情况。结果显示:A组与B组之间动物的行为学评分B组优于A组,有显著性差异(P<0.01);B组动物脊髓内硫酸软骨素蛋白聚糖阳性物质的表达明显低于A组,具有显著性差异(P<0.05),而硫酸软骨素核心蛋白的表达无显著性差异(P>0.05);HRP示踪法显示B组脊髓损伤头端可见少量HRP标记的神经元胞体和纤维。本研究结果提示硫酸软骨素酶ABC能够裂解CSPGs中的葡胺聚糖链,减少瘢痕,促进损伤的神经纤维再生。

硫酸软骨素酶ABC-PLGA缓释微球处理去细胞同种异体神经移植修复大鼠坐骨神经

目的探讨硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植修复大鼠坐骨神经的可行性。方法用复乳法制备硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球。取成年雄性SD大鼠40只,随机分为4组(n=10):硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植组(A组)、自体神经移植组(B组)、改良化学法去细胞同种异体神经浸泡ChABC神经移植对照组(C组)、改良化学法去细胞同种异体神经移植09%氯化钠注射液对照组(D组)。取A、C、D 3组动物人工切取右侧坐骨神经10 mm,用改良化学法制备移植神经段:A、C两组浸泡在PBS液中,D组浸泡在含2 U/ml ChABC的PBS液(pH7.4)中。A组动物取C组制备神经行同种异体神经移植,外膜无张力缝合,并在移植神经段距近心端缝合处2 mm、4 mm、6 mm、8 mm处分别注入0.2μl制备好的硫酸软骨素酶ABC-PLGA缓释微球。B组在右侧离断10 mm坐骨神经倒置后行外膜缝合。C组取D组制备神经行神经移植。D组取A组制备神经行神经移植后,按照A组的位置注入等量等渗0.9%氯化钠注射液。术后4、8、12周进行大体标本观察,术后12周行电生理检测、HE染色、镀银染色及电镜组织学检测、图像分析对比。结果制备所得硫酸软骨素酶ABC微球表面光滑,球体大小各异且均匀,无粘连及成簇等现象,Weibull方程曲线显示硫酸软骨素酶ABC微球体外释药稳定。采用硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植能够促进大鼠神经缺损处的轴突再生,提高神经修复的速度和质量,再生神经直径较粗,粘连较轻,电生理检测和组织学观察显示各项指标均优于两对照组,且较两对照组修复效果更接近于自体神经移植。结论硫酸软骨素酶ABC-聚乳酸-聚乙醇酸共聚物缓释微球处理改良化学法去细胞同种异体神经移植可以修复大鼠神经损伤。

软骨素酶ABC去除化学去细胞神经中硫酸软骨素蛋白多糖

目的:观察软骨素酶ABC(ChABC)是否能降解化学去细胞神经(CEAN)中的硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)。方法:取SD大鼠的坐骨神经,按化学法制备去细胞神经,ChABC浸泡16h,行HE染色、CSPG及基底膜素层粘连蛋白(LN)免疫组化染色,观察去细胞神经的结构及成分变化。Wistar大鼠15只,切除左坐骨神经5mm,随机分为A、B、C 3组各5只,分别采用自体神经、CEAN、经ChABC处理的CEAN修复缺损,术后15d测量各组神经纤维生长情况。结果:ChABC处理去细胞神经后,CSPG免疫组化染色示CSPG表达显著降低;HE染色显示结构无明显变化;LN免疫组化染色无明显变化。术后2周A组神经再生距离长于B、C组(P<0.05),C组优于B组(P<0.05)。结论:ChABC可降低化学去细胞神经中的CSPG,有利于促进神经再生。

软骨素酶ABC诱导大鼠尾椎间盘退变的实验研究

目的探讨软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)诱导SD大鼠椎间盘退变动物模型的稳定性及可行性。方法80只雄性SD大鼠,随机分为7天组和30天组,每组40只,取浓度为0.25 unit/m L Ch ABC 0.1 m L,注入(coccygeal vertebrae,Co7/8)椎间盘作为造模组,(coccygeal vertebrae,Co6/7)近端椎间盘不作处理作为对照组。术后第7天、第30天行尾椎7.0T磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI),取标本行HE染色,阿尔新蓝染色,马森三色染色及Ⅱ型胶原和蛋白多糖免疫组织化学,观察椎间盘退变情况。结果 MRI结果显示:术后第7天,第30天,对照组Co6/7椎间盘T2信号强度均未见明显变化,而造模组Co7/8椎间盘T2信号强度均明显降低,Co7/8与Co6/7椎间盘T2信号值差异具有统计学意义(P<0.05),两时间点Co7/8椎间盘T2信号值比较差异无统计学意义;术后第7天和第30天,HE染色,阿尔新蓝染色,马森三色染色提示Co7/8椎间盘均出现明显退变,Co7/8椎间盘Ⅱ型胶原和蛋白多糖免疫组织化学积分光密度值均较Co6/7椎间盘显著降低(P<0.05)。结论软骨酶素ABC诱导构建大鼠尾椎间盘退变模型是一种简单有效、重复性好的建模方法。

硫酸软骨素酶ABC促进大鼠脊髓损伤后神经功能恢复的实验研究

目的探讨硫酸软骨素酶ABC(ChABC)对神经脊髓损伤后运动功能恢复的影响。方法SD大鼠72只,雌雄不限,随机分为假手术组、生理盐水对照组和ChABC治疗组,采用Allen法打击大鼠胸10脊髓损伤模型,分别在伤后即刻和随后每天一次连续一周蛛网膜下注射生理盐水和ChABC。HE染色和尼氏染色观察各时间点脊髓损伤组织形态和尼氏体及神经元的变化,采用BBB功能评分和运动诱发电位(MEP)观察大鼠的运动功能恢复情况。结果大鼠脊髓损伤后1周时BBB评分和对照组无显著差别,在2、4周,治疗组评分结果明显优于对照组(P<0.05;P<0.01);MEP在1、4周的N1波潜伏期与对照组差异显著(P<0.05;P<0.01)。HE和Nissl染色显示治疗组的形态和神经元数量要优于对照组。结论ChABC能促进大鼠脊髓损伤后神经运动功能恢复,并对脊髓组织损伤具有保护作用。

硫酸软骨素酶ABC治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤后在损伤部位周围形成的神经胶质瘢痕是轴突不能有效再生的主要障碍,胶质瘢痕由星形胶质细胞和硫酸软骨素蛋白聚糖组成。硫酸软骨素蛋白聚糖的基本结构是核心蛋白和葡胺聚糖链共价交连,其中抑制轴突生长的作用大部分是通过葡胺聚糖链介导的。硫酸软骨素酶ABC能特异性破坏硫酸软骨素蛋白聚糖的葡胺聚糖链,将硫酸软骨素蛋白聚糖分解成核心蛋白和碳水化合物短链,从而降低胶质瘢痕的阻碍作用使轴突的再生能力加强,神经功能得到改善。实验研究证明鞘内注射硫酸软骨素酶ABC治疗大鼠脊髓损伤取得良好结果,利用行为学评分评价硫酸软骨素酶ABC的治疗效果也证明它能促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复。

硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖与生长相关蛋白43表达的影响

目的:探讨硫酸软骨素酶ABC对严重的大鼠脊髓损伤蛋白多糖及生长相关蛋白43(GAP-43)基因表达的影响。方法:制作大鼠脊髓横断伤模型,分为脊髓损伤组和脊髓损伤治疗组,给于治疗组硫酸软骨素酶ABC鞘内注射,用免疫荧光组织化学观察硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的表达,半定量RT-PCR、Western印迹法观察GAP-43 mR- NA及蛋白的表达。结果:治疗组与损伤组比较,CSPGs的表达减少,差异具有显著性,而GAP-43mRNA及蛋白表达增多。结论:硫酸软骨素酶ABC能够裂解CSPGs,改善脊髓损伤区的微环境,促进GAP-43 mRNA及蛋白的表达,是修复脊髓损伤和促进神经再生的机制之一。

不同连接肽在硫酸软骨素酶ABC I重组表达中的应用研究

硫酸软骨素酶ABC I(ChSase ABC I)是一类能够将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺多糖降解为寡糖及不饱和二糖的裂解酶。该研究将硫酸软骨素酶ABC I基因与麦芽糖结合蛋白(MBP)基因分别用FFFFF和RRRRR两种连接肽连接,并克隆到pMAL-c2X载体上,在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)高效表达。结果表明,重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为716.5 IU/L发酵液和1.15 IU/mg蛋白,重组酶MBP-RRRRR-ChSase ABC I的酶活和比酶活分别为741.0 IU/L发酵液和1.13 IU/mg蛋白。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果表明,重组酶MBP-FFFFF-ChSase ABC I和MBP-RRRRR-ChSase ABC I的分子质量均为130 kDa,并且都为可溶性蛋白。

软骨素酶ABC促进大鼠脊髓损伤后轴突再生和功能恢复的初步研究

目的探讨软骨素酶ABC(ChABC)对大鼠脊髓横断损伤(SCI)后轴突再生和功能恢复的影响。方法SD大鼠随机分为实验组(SCI+ChABC),对照组(SCI+NS)及正常组。采用T7-8脊髓完全横断模型,术后2周和10周脊髓标本分别行OBT、GFAP、NSE及NF免疫组化染色,术后1、2、3、4、5、6、8、10周进行行为学评分。结果行为学评分,术后3周实验组评分高于对照组(P<0.05),同时实验组疤痕中OBT和GFAP染色低于对照组(P<0.05),GFAP和NF染色高于对照组(P<0.05)。结论ChABC能有效降低损伤部位硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的活性,从而促进SCI大鼠感觉、运动功能的恢复和轴突的再生。

骨髓间充质干细胞来源外泌体与硫酸软骨素酶ABC联合治疗大鼠脊髓损伤

背景:如何改善损伤局部微环境,减少胶质瘢痕形成,促进神经元和轴突修复与再生,是治疗脊髓损伤的难点。研究发现,硫酸软骨素酶ABC可通过介导硫酸软骨素蛋白聚糖的降解,增强轴突的再生和可塑性;同时骨髓间充质干细胞来源外泌体可通过抗凋亡、调节免疫反应、增强神经元再生能力等途径在脊髓损伤修复中发挥作用。目的:研究骨髓间充质干细胞来源外泌体联合硫酸软骨素酶ABC对大鼠脊髓损伤的修复作用,并探讨其机制。方法:用外泌体提取试剂盒提取骨髓间充质干细胞外泌体,透射电镜观察外泌体形态,Western blot检测CD63、Alix表达。取50只SD大鼠随机分成5组:假手术组、模型组、硫酸软骨素酶ABC组、外泌体组、联合组,每组10只。采用改良Allen’s法构建大鼠脊髓损伤模型,硫酸软骨素酶ABC组、联合组用微量注射器直接向损伤局部注射硫酸软骨素酶ABC,术后2 h,外泌体组、联合组通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞来源外泌体,每隔2 d注射1次,共注射3次。脊髓损伤后第1,3,7,14,28天进行后肢运动功能评分,第14天每组取6只大鼠经灌注取材做成石蜡切片,苏木精-伊红染色观察脊髓损伤区病理变化,免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白表达,免疫组化检测生长相关蛋白43表达。结果与结论:①外泌体呈圆形、椭圆形或"茶托样",大小不均;CD63、Alix呈阳性表达;②与模型组、硫酸软骨素酶ABC组、外泌体组相比,联合组BBB评分高,脊髓损伤区面积小,胶质纤维酸性蛋白表达降低,生长相关蛋白43表达升高(P均<0.05);③结果表明,骨髓间充质干细胞外泌体联合硫酸软骨素酶ABC能抑制损伤区胶质纤维酸性蛋白表达,上调生长相关蛋白43表达,减少胶质瘢痕形成,改善损伤局部微环境,从而促进大鼠脊髓损伤后神经元和轴突的修复与再生。

硫酸软骨素酶ABC联合脊髓康对大鼠脊柱脊髓损伤后的神经功能恢复、TGF-β1、HIF-1α、Nogo-NgR信号通路的影响

目的:探究硫酸软骨素酶ABC(Ch ABC)联合脊髓康对大鼠脊柱脊髓损伤后的神经功能恢复及TGF-β1、HIF-1α、Nogo-NgR信号通路的影响。方法:60只大鼠随机分为4组,分别为对照组、模型组、Ch ABC组和Ch ABC+脊髓康。使用Allen’s法建立大鼠脊柱脊髓损伤模型。Basso Beattie Bresnah-an(评分)和体感诱发电位(sEP)检测评估脊髓神经功能。使用RT-qPCR检测mRNA水平,Westernblot检测蛋白水平。结果:建模后大鼠BBB评分显著降低(P<0.05),干预后3组的BBB评分均有提高,其中Ch ABC+脊髓康组BBB评分显著高于Ch ABC组(P<0.05)。建模后大鼠SEP显著升高(P<0.05),干预后3组的BBB评分均有降低,其中Ch ABC+脊髓康组BBB评分显著低于Ch ABC组(P<0.05)。干预后Ch ABC组和Ch ABC+脊髓康组TGF-β1显著高于模型组,HIF-1α显著低于模型组(P<0.05)。且干预后Ch ABC+脊髓康组TGF-β1的水平显著高于Ch ABC组而HIF-1α显著低于Ch ABC组(P<0.05)。干预后Ch ABC组和Ch ABC+脊髓康组Nog-oNgR通路表达水平显著低于模型组(P<0.05),并且干预后Ch ABC+脊髓康组的Nogo-A、NgR、LINGO-1表达水平显著低于ChABC组(P<0.05)。结论:ChABC联合脊髓康具有更强的促进神经功能恢复的作用,脊髓康的联合使用可进一步抑制HIF-1α水平而提高TGF-β1水平,提高预后促进脊柱愈合。并且联合用药的作用机制可能与其具有抑制Nogo-NgR信号通路促进神经元生长的作用有关。

硫酸软骨素酶ABC和环磷酸腺苷缓释组织工程支架的构建

目的:制备一种可生物降解有效安全的硫酸软骨素酶ABC(ChABC)和环磷酸腺苷(cAMP)缓释组织工程支架,使药物缓慢稳定释放,降低局部应用时对神经的刺激,促进中枢神经系统损伤后神经的修复和轴突的再生。方法:应用电纺丝技术制作的含ChABC及cAMP的聚碳酸亚丙酯及壳聚糖缓释组织工程支架,分析支架直径、载药量、包封率等参数,然后以磷酸盐缓冲液为体外释药介质观察组织工程支架的药物释放速度、药物的失活率及支架的降解速度。结果:ChABC和cAMP缓释组织工程支架在聚碳酸亚内酯质量浓度为8%、电压为10～15 kV、距离为15～20 cm时可以纺出纤维直径约3μm的平滑支架,单纯聚碳酸盐内酯纤维光滑,直径均一,壳聚糖微球光滑,聚碳酸亚内酯与壳聚糖混合后电纺丝形成的支架呈串珠样结构,其能缓慢持续释放有活性ChABC和cAMP,12 d后支架降解失重率约7%。结论:应用电纺丝方法成功制备含ChABC及cAMP的聚碳酸盐内酯及壳聚糖组织工程支架,其药物稳定释放,局部应用无神经刺激,可生物降解。

硫酸软骨素酶ABC(ch ABC)对大鼠坐骨神经损伤后神经再生功能的实验研究

目的观察硫酸软骨素酶ABC(chABC)对坐骨神经再生功能的影响。方法将72只SD大白鼠双侧坐骨神经切断造成0.8 cm缺损,用甲壳素导管桥接神经缺损后随机分为3组,每组24只。A组(实验组):管内注入聚乳酸-聚乙醇酸—chABC缓释微球(chABC-PLGA);B组(赋形剂组):管内注入聚乳酸-聚乙醇酸微球;C组(空白对照组):管内注入等渗盐水。术后4周、8周取材作神经电生理、神经组织学观察。结果术后4周、8周组织学观察见有再生神经通过再生室,其间有新生血管;神经电生理检查A组再生神经传导速度优于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05),B、C组再生神经传导速度差别无统计学意义,组间比较(P>0.0167)组间多重比较行Bonferroni法检验,取校正α=0.0167)。S-100免疫组织化学及Loyez氏神经染色法显示:A组神经纤维数多于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05),B、C组再生神经纤维数差别无统计学意义,组间比较(P>0.0167)。结论硫酸软骨素酶ABC(chABC)具有促进周围神经再生的作用。

硫酸软骨素酶ABC及Nogo-66受体拮抗剂联合鼠胚神经干细胞移植对大鼠脊髓损伤的影响

目的:研究硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,Ch ABC)、Nogo-66受体拮抗剂[Nogo-66(1-40)antagonist peptide,NEP1-40]及鼠胚神经干细胞(neural stem cells,NSCs)联合移植对大鼠损伤脊髓功能恢复的影响。方法:体外应用全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)(浓度1.0μmol/L)诱导NSCs(前期实验分离、培养并冻存的鼠胚NSCs),诱导后鉴定NSCs特异性标志物,移植前通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brdu)标记NSCs。将60只SD大鼠随机分为假手术组(A组,n=10)、损伤对照组(B组,n=10)、NSCs治疗组(C组,n=10)、NSCs联合Ch ABC治疗组(D组,n=10)、NSCs联合NEP1-40治疗组(E组,n=10)、NSCs联合Ch ABC和NEP1-40治疗组(F组,n=10)。移植前分别对B、C、D、E及F组的大鼠制作胸段脊髓全横断损伤模型。术后3d,E和F组经留置的导管注入NEP1-40 20μl/d,连续28d;术后8d,C、D、E及F组经留置导管注入经ATRA干预和Brd U标记的NSCs 10μl;术后8d,D组和F组经留置导管注入Ch ABC 10μl/d,连续7d;各时间点通过留置导管注入生理盐水保持各组移植液等量。术前及术后不同时间点,用BBB评分和体感诱发电位(somatosensory evoked potentials,SEP)潜伏期对大鼠后肢神经功能进行评价。移植后8周通过HE染色观察损伤脊髓组织情况,免疫荧光染色观察移植NSCs存活、神经元分化及轴突生长情况。结果:体外应用1.0μmol/L的ATRA诱导NSCs培养,可提高NSCs向神经元分化的比例。移植后2周开始各组大鼠BBB评分、SEP潜伏期开始观察到改善,移植治疗各组均优于损伤对照组,组间BBB评分和SEP潜伏期有差异(P<0.05);移植后2周、5周、8周各时间点,B组与C、D、E及F组比较,BBB评分和SEP潜伏期较差(P<0.05);在移植治疗各组中,F组神经功能的恢复最明显,F组与C、D及E组比较具有较高的BBB评分和较短SEP潜伏期(P<0.05)。移植后8周,HE染色显示:A组细胞结构完整、排列规则;B组组织结构严重破坏,细胞排列紊乱,见大量较大的囊腔及胶质瘢痕形成;C、D、E及F组细胞增生明显,囊腔较少。免疫荧光染色显示:C、D、E及F组内可见橘红色Brdu标记阳性细胞,F组阳性细胞数多于C、D和E组,差异具有统计学意义(P<0.05)。C、D、E、F组微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein 2,MAP-2)标记阳性细胞数多于B组,F组多于C、D、E组,差异有统计学意义(P<0.05);C、D、E、F组MAP-2标记阳性细胞面积大于B组,F组大于C、D、E组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:ATRA诱导后NSCs移植可促进大鼠脊髓损伤功能的恢复,且联合Ch ABC和NEP1-40移植对损伤脊髓功能的恢复具有协同促进作用。

在磁场作用下载硫酸软骨素酶ABC纳米微粒可影响许旺细胞的迁移

背景:由于缺乏轴突再生微环境以及神经胶质瘢痕的形成,使脊髓损伤修复的临床效果通常不尽如人意。许旺细胞作为神经再生的支持细胞,因其在星形胶质细胞丰富的中枢神经系统的迁移能力差而限制了其对轴突再生的作用。目的:将载有硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)的超顺磁性纳米微粒导入许旺细胞,探讨在外部磁场的作用下对许旺细胞在星形胶质细胞区域迁移的影响。方法:从出生1-3d的SD大鼠坐骨、臂丛神经和大脑皮质分别提取许旺细胞和星形胶质细胞并纯化,通过免疫荧光染色鉴定其纯度。以超顺磁性纳米微粒(PEI-SPIONs)最佳转染质量浓度2 mg/L且与ChABC最佳质量比为1∶4对许旺细胞进行转染,同时给予外部磁场强度1.4 T作用2 d,用细胞迁移实验评估单纯许旺细胞、PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞以及外部磁场作用下PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞在星形胶质细胞区域的迁移能力。结果与结论:①许旺细胞和星形胶质细胞的纯度分别达到(91.7±1.2)%和(93.3±2.2)%;②与许旺细胞组相比,PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞进入星形胶质细胞区域的数量明显增加(P<0.05);③与许旺细胞组相比,在外部磁场的作用下PEI-SPIONs/ChABC转染的许旺细胞进入星形胶质细胞区域的数量和迁移距离显著增加(P<0.005);④结果表明,PEI-SPIONs/ChABC转染可以增强许旺细胞突破胶质瘢痕的能力,且增加了与星形胶质细胞的融合;同时在外部磁场的引导下显著增强了许旺细胞的迁移能力,该方法可能成为治疗脊髓损伤后轴突再生的一种新策略。