脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

背景:脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果,但其单独应用时的治疗效果有限。氧化苦参碱可缓解白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。目的:观察不同剂量氧化苦参碱与脱细胞软骨细胞外基质联合膝关节腔注射对大鼠骨关节炎的治疗作用。方法:获取SD大鼠股骨软骨,采用物理、化学与酶相结合的方法制备脱细胞软骨细胞外基质。取50只SD大鼠,利用随机数字表法分为假手术组、骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组,每组10只,后4组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型。造模成功后,单纯材料组大鼠膝关节腔注射脱细胞软骨细胞外基质匀浆,低剂量药物组、高剂量药物组膝关节腔分别注射含50,100μg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆。注射4周后取材进行相关检测。结果与结论:①与假手术组比较,骨关节炎组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平升高(P<0.05),超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05);与骨关节炎组比较,低剂量药物组、高剂量药物组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平降低(P<0.05),超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05),其中高剂量药物组变化更显著。②Tunel染色显示,与假手术组相比,骨关节炎组凋亡软骨细胞增多;与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组凋亡软骨细胞减少,其中高剂量药物组减少更显著。③苏木精-伊红与免疫组化染色显示,骨关节炎组大鼠膝关节软骨严重退变,软骨组织中Ⅱ型胶原表达降低(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组大鼠膝关节软骨退变明显改善,软骨组织中Ⅱ型胶原表达升高(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善最显著。④Western blot检测显示,与假手术组相比,骨关节炎组软骨组织中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,低剂量药物组、高剂量药物组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善更显著。⑤结果表明,膝关节腔内联合注射脱细胞软骨细胞外基质与氧化苦参碱可通过促进细胞外基质的合成、抑制炎症与氧化应激反应、抑制软骨细胞凋亡发挥骨关节炎治疗作用,该治疗作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

山奈酚调控ROS/TXNIP通路对膝骨关节炎大鼠软骨细胞氧化及炎性损伤的改善作用

目的探讨山奈酚通过调控活性氧/硫氧还原蛋白相互作用蛋白(ROS/TXNIP)通路对膝骨关节炎(KOA)大鼠软骨细胞氧化及炎性损伤的改善作用。方法采用改良Hulth法构建KOA大鼠模型,分为模型组,山奈酚组(灌胃50 mg/kg山奈酚),氧化三甲胺(TMAO)组(灌胃110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活剂TMAO),山奈酚+TMAO组(灌胃50 mg/kg山奈酚和110 mg/kg ROS/TXNIP通路激活剂TMAO),另取假手术组大鼠作为对照。各组大鼠给药结束后,苏木素-伊红染色观察软骨组织损伤情况并对其进行Mankin评分;ROS比荧光探针DCFH-DA法检测ROS水平;Griess法测定一氧化氮(NO)水平;试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和IL-6水平;Western印迹法检测TXNIP、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(NLRP)3表达水平。结果与假手术组比较,模型组和TMAO组膝关节软骨损伤严重,细胞排列紊乱,Mankin评分、软骨组织中ROS水平、NO、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及TXNIP、NLRP3蛋白表达水平明显升高,SOD、GSH-Px含量明显减少(均P<0.05)。与模型组比较,山奈酚治疗后,上述指标均得到逆转,氧化和炎性损伤均得到改善(均P<0.05)。与山奈酚组比较,山奈酚+TMAO组软骨组织损伤加重,ROS水平、NO、MDA、TNF-α、IL-1β、IL-6含量及TXNIP、NLRP3蛋白表达水平显著升高,SOD、GSH-Px含量显著降低(均P<0.05)。结论山奈酚可改善KOA大鼠软骨细胞氧化和炎性损伤,其机制与抑制ROS/TXNIP通路,进而调控氧化标志物和炎性因子水平有关。

大黄素对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响

背景:既往研究显示,沉默交配型信息调节因子2同源蛋白1(silent mating-type information regulator 2 homolog 1,SIRT1)-雷帕霉素机械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)信号在骨关节炎进展中起重要作用,大黄素对骨关节炎软骨细胞有一定的保护作用。目的:基于SIRT1-mTOR探究大黄素对骨关节炎软骨细胞增殖、凋亡和氧化应激的影响。方法:体外分离培养大鼠软骨细胞,采用10 ng/mL的白细胞介素1β诱导构建体外骨关节炎细胞模型,以CCK-8法测定经0,20,40,80,120,160μmol/L的大黄素处理后的大鼠软骨细胞活力,选出合适大黄素作用浓度。将软骨细胞随机分为对照组、模型组、大黄素低剂量组、大黄素高剂量组、SIRT1抑制剂EX527组、大黄素高剂量+EX527组,除对照组外其余各组以10 ng/mL的白细胞介素1β诱导构建体外骨关节炎模型,同时以大黄素和EX527分组处理细胞后,用CCK-8法、Edu染色法及流式细胞术分别检测各组细胞增殖与凋亡情况;用试剂盒检测各组细胞活性氧相对含量、丙二醛与抗氧化酶超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平;免疫印迹检测各组细胞基质降解、凋亡与SIRT1-mTOR通路相关蛋白表达。结果与结论:①与对照组相比,模型组大鼠软骨细胞活力、Edu阳性率、超氧化物歧化酶与过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平、Bcl-2与SIRT1蛋白表达降低,凋亡率、活性氧相对含量、丙二醛水平、Bax与基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白表达及p-mTOR/mTOR升高(P<0.05)。与模型组相比,大黄素低、高剂量组上述各项指标呈相反变化(P<0.05);EX527组各指标水平与大黄素各组呈相反趋势(P<0.05)。②与大黄素高剂量组相比,大黄素高剂量+EX527组细胞活力、Edu阳性率、超氧化物歧化酶与过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶水平、Bcl-2与SIRT1蛋白表达降低,凋亡率、活性氧相对含量、丙二醛水平、Bax与基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9蛋白表达及p-mTOR/mTOR升高(P<0.05)。③结论:大黄素可通过激活SIRT1-mTOR信号而抑制骨关节炎软骨细胞氧化应激,从而促进软骨细胞增殖并减轻其凋亡。

白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果评价

背景:建立骨性关节炎软骨细胞模型,对进一步解释骨性关节炎的病理过程,评估和筛选骨性关节炎治疗药物具有重要意义。目的:评价白细胞介素1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞模型的效果,为进一步探索药物治疗骨性关节炎提供参考。方法:取3周龄SD大鼠髋关节软骨,机械剪切和酶消化分离软骨细胞并进行鉴定。软骨细胞随机分为3组:对照组、5 ng/mL和10 ng/mL白细胞介素1β组,分别诱导24 h和48 h。MTT法检测软骨细胞的增殖活力;Real-Time PCR检测Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9、基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA表达;Western blot检测Ⅱ型胶原蛋白、性别决定区Y框蛋白9、基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白表达。结果与结论:①成功分离并培养原代大鼠软骨细胞;②10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞24 h可使细胞增殖活力显著下降(P<0.05),5 ng/mL白细胞介素1β组则需诱导48 h;③Real-Time PCR结果显示,同对照组相比,5 ng/mL和10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞24,48 h,Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖、性别决定区Y框蛋白9 mRNA表达水平均显著降低(P<0.05),基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA表达水平均显著增加(P<0.05);相比10 ng/mL组,5 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞48 h可显著增加基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5 mRNA表达(P<0.05);④Western blot结果显示,相比对照组,10 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞24 h,Ⅱ型胶原蛋白、性别决定区Y框蛋白9蛋白水平显著下降(P<0.05),基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白水平显著增加(P<0.05);5 ng/mL白细胞介素1β诱导软骨细胞48 h,Ⅱ型胶原蛋白、性别决定区Y框蛋白9蛋白水平显著下降(P<0.05),基质金属蛋白酶13、解聚蛋白样金属蛋白酶5蛋白水平显著增加(P<0.05);⑤提示干预24 h后10 ng/mL白细胞介素1β对软骨细胞的诱导效果可能更明显;干预48 h后5 ng/mL和10 ng/mL白细胞介素1β的诱导效果相似。

隐丹参酮调节HIF-1α/BNIP3信号通路对兔膝骨关节炎模型软骨细胞自噬和凋亡的影响

目的 探究隐丹参酮调节缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(BNIP3)信号通路对兔膝骨关节炎(KOA)模型软骨细胞自噬和凋亡的影响。方法 取新西兰兔并以改良Videman法构建兔KOA模型,随机分为模型组、空载组、隐丹参酮组、HIF-1α敲低组、隐丹参酮+HIF-1α敲低组,每组9只;另取9只新西兰兔为对照组。分组干预后以Lequesne MG的膝关节级别评估法对兔膝关节临床症状(局部疼痛、步态、关节活动、关节肿胀)进行评分;HE染色检测兔膝关节软骨组织的退变情况并进行改良Mankin's评分;TUNEL染色检测兔膝关节软骨组织细胞凋亡情况;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测兔血清炎性因子白细胞介素(IL)-6、IL-18、IL-10水平;蛋白免疫印迹实验检测兔膝关节软骨组织自噬(LC3、Beclin-1)、凋亡(Bax、Cleaved Caspase-3)和HIF-1α/BNIP3信号通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组兔膝关节软骨组织出现明显退变症状,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平升高,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较,隐丹参酮组兔膝关节软骨组织退变症状减轻,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平降低,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平升高(P<0.05);HIF-1α敲低组兔膝关节软骨组织退变症状加重,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平升高,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平降低(P<0.05);空载组兔各指标无明显变化(P>0.05)。隐丹参酮+HIF-1α敲低组较隐丹参酮组兔膝关节软骨组织退变症状加重,局部疼痛、步态、关节活动及关节肿胀评分、改良Mankin's评分、凋亡率、血清IL-18及IL-6水平、软骨组织LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Bax、Cleaved Caspase-3、BNIP3蛋白表达水平升高,血清IL-10水平、软骨组织HIF-1α蛋白表达水平降低(P<0.05);较HIF-1α敲低组上述指标变化相反。结论 隐丹参酮可通过上调HIF-1α、下调BNIP3表达,抑制炎症及自噬,减轻KOA兔膝关节软骨组织退变,改善其临床症状。

针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞的稳态

背景:针刀是治疗骨关节炎的有效方法,临床疗效肯定,但具体机制尚未明确。目的:探讨针刀调控软骨细胞自噬维持骨关节炎软骨细胞稳态的作用。方法:采用随机数字表法将28只新西兰兔分为对照组、骨关节炎组、针刀组和透明质酸组,每组7只,后3组保持左后肢过伸位采用石膏绷带固定6周建立膝骨关节炎模型,建模成功后,对照组与骨关节炎组不进行任何治疗,针刀组给予针刀治疗(15 min/次,1次/周),透明质酸组膝关节腔内注射透明质酸钠溶液(1次/周),均连续治疗5周。末次治疗后第2天,采用DR片观察兔膝关节宏观结构,透射电镜观察软骨细胞超微结构,Tunel染色检测软骨细胞凋亡,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR通路及自噬相关蛋白表达。结果与结论:(1)DR片显示,骨关节炎组兔膝关节间隙变窄、周围骨赘形成;相较于骨关节炎组,透明质酸组、针刀组兔膝关节间隙增宽,周围骨赘减少;(2)透射电镜下可见骨关节炎组兔膝关节软骨细胞内自噬体数量减少,细胞核皱缩、核膜破裂,细胞器形态不完整、细胞呈现明显死亡趋向;相较于骨关节炎组,透明质酸组与针刀组自噬体明显增加,细胞核核膜完整,细胞生存状态良好;(3)Tunel染色结果显示,相较于骨关节炎组,透明质酸组、针刀组凋亡软骨细胞明显减少;(4)Western blot检测结果显示,与对照组比较,骨关节炎组Beclin1、Cath D和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达降低(P <0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达升高(P <0.05);与骨关节炎组比较,透明质酸组和针刀组Beclin1、Cath D和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达升高(P <0.05),p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达降低(P <0.05);(5)结果表明,针刀可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路传导来提高软骨细胞自噬水平,维持软骨细胞稳态,最终延缓软骨退变。

基于JNK通路探讨补肾活血方对大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨补肾活血方(Bushen Huoxue Formula,BSHXF)通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路对大鼠骨关节炎(Osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡的影响。方法 采用白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)诱导体外分离培养的大鼠软骨细胞构建体外OA模型,并使用不同浓度的BSHXF干预处理。使用MTT法测定细胞活力;CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术评估细胞凋亡情况;Western bolt检测凋亡相关蛋白裂解的胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)水平和JNK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白水平。试剂盒检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平;ELISA法检测细胞上清液中促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量。结果 (1)与对照组相比,模型组软骨细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.01);模型组Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组相比,BSHXF治疗组软骨细胞活力升高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.01);BSHXF治疗组Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01)。(2)与对照组相比,模型组细胞中ROS和MDA的相对含量显著升高(P<0.01),GSH的相对含量显著降低(P<0.01);模型组细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比,BSHXF治疗组细胞中ROS和MDA的相对含量显著降低(P<0.01),GSH的相对含量显著升高(P<0.01);BSHXF治疗组细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著降低(P<0.01)。(3)与溶剂对照组相比,激活剂对照组的p-JNK、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),细胞增殖能力下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.01);BSHXF治疗组和溶剂对照组两组间细胞增殖、凋亡率和凋亡相关蛋白表达(Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)情况差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)与溶剂对照组相比,激活剂对照组的ROS和MDA水平显著升高(P<0.01),而GSH水平显著降低(P<0.01),TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05);BSHXF治疗组和溶剂对照组两组间ROS相对含量、MDA、GSH水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 BSHXF通过抑制JNK信号通路激活抑制IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡,改善氧化应激和炎症反应。

软骨细胞中生物钟基因Bmal1对细胞周期相关基因表达的影响

目的 探讨生物钟和细胞周期在骨关节炎(OA)软骨细胞中内在的关系,主要是时钟基因Bmal1对细胞周期相关基因的调控。方法 将胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)诱导后的软骨样ATDC5细胞分为normal组、OA组、LV-Bmal1组。采用CCK8法检测各组细胞活力;RT-qPCR法检测Bmal1、Per1、Wee1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13 mRNA在各组中的表达;Western blot检测BMAL1、PER1、WEE1、CDK1、CCNB1和MMP13蛋白在各组中的表达水平;流式细胞测量术分析Bmal1对细胞周期中不同分期及细胞凋亡的影响;分析Bmal1对Per1、Wee1、Cdk1、Ccnb1和Mmp13的调控和它们在OA中发挥的作用。结果 与normal组相比,OA组细胞活力提高,Bmal1、Wee1的mRNA相对表达量下降,Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13的mRNA相对表达量明显增加;LV-Bmal1组细胞活力下降,Bmal1、Wee1的mRNA相对表达量上升,Per1、Cdk1、Ccnb1、Mmp13的mRNA相对表达量下降(P<0.05);相关性分析显示,Bmal1与Wee1呈正相关,二者与Per1、Cdk1、Ccnb1或Mmp13存在负相关;Western blot结果显示,不同组别中蛋白表达水平的结果与PCR趋势一致;细胞周期和细胞凋亡检测结果显示,和normal组相比,OA组S期、G2/M期缩短,细胞比例明显下降,细胞早期和晚期凋亡比例增加,LV-Bmal1组S期、G2/M期延长,细胞比例增加,早期和晚期凋亡比例下降。结论 炎性软骨细胞中生物钟基因Bmal1可能参与调节细胞周期相关基因的表达。

温经通络汤含药血清对小鼠软骨细胞损伤及IκB-ζ/HIF-1α/LDHA轴的影响研究

目的研究温经通络汤含药血清对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的小鼠原代软骨细胞损伤的影响及机制。方法采用IL-1β诱导小鼠原代软骨细胞损伤模型,检测细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α,软骨降解相关蛋白酶基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9、MMP13、ADAM金属肽酶含血小板反应蛋白1基元4(ADAMTS4)以及糖酵解相关酶乳酸脱氢酶A(LDHA)、M2型丙酮酸激酶(PKM2)、还原型辅酶Ⅱ氧化酶2(NOX2)、还原型辅酶Ⅱ氧化酶4(NOX4)的mRNA表达;测定细胞内MMP3、MMP13、P65、IκB-ζ、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)以及LDHA蛋白表达水平;进一步检测细胞上清液中一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)和乳酸的浓度,测定细胞内辅酶Ⅰ(NAD)的还原态(NADH)和氧化态(NAD+)的比率,以及细胞内活性氧(ROS)水平。结果温经通络汤含药血清可显著抑制IL-1β软骨细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达(P<0.01),降低细胞上清液中NO浓度(P<0.05,P<0.01),下调IκB-ζ(P<0.05)和P65蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。温经通络汤含药血清可显著下调MMP3、MMP9、MMP13以及ADAMTS4 mRNA表达(P<0.01),抑制MMP13(P<0.05,P<0.01)和MMP3(P<0.05)的蛋白表达。氧化应激方面,它可显著抑制软骨细胞内ROS的产生,提高NADH/NAD+比率,降低上清液中MDA浓度,下调HIF-1α蛋白表达(P<0.01)。温经通络汤含药血清可显著降低乳酸浓度,下调LDHA、PKM2、NOX2、NOX4的表达,降低细胞内糖酵解水平(P<0.05,P<0.01)。结论温经通络汤含药血清可通过抑制炎症、软骨降解、氧化应激和糖酵解,缓解IL-1β诱导的小鼠原代软骨细胞损伤,其机制可能与调控IκB-ζ/HIF-1α/LDHA轴有关。

蠲痹汤含药血清调控线粒体自噬抑制白细胞介素1β诱导的关节软骨细胞损伤

背景:软骨细胞线粒体自噬的缺陷会引起细胞凋亡和基质消失等软骨细胞退行性病变的变化。目的:探讨蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β诱导的大鼠膝关节软骨细胞炎症反应和凋亡的影响及可能作用机制。方法:50只雄性SD大鼠随机给予生理盐水、蠲痹汤低、中、高剂量(1.24,2.48,4.96 g/kg)、塞来昔布(阳性药物),连续灌胃2周后获得含药血清。①分离软骨细胞,将其随机分为对照组、白细胞介素1β组、蠲痹汤低、中、高剂量含药血清组及阳性药物血清组。CCK-8法检测细胞存活率、免疫荧光双染检测线粒体自噬水平、免疫荧光检测磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶水平、Western blot检测PTEN诱导激酶1/Parkin通路相关蛋白和裂解的半胱氨酸蛋白酶蛋白3表达、ELISA检测炎症因子水平;②分别采用PTEN诱导激酶1 siRNA和Compound C进行干预,探究AMPK/PTEN诱导激酶1/Parkin通路在蠲痹汤含药血清调控线粒体自噬中的作用。结果与结论:①与对照组比较,白细胞介素1β组软骨细胞存活率、Ⅱ型胶原蛋白表达、磷酸化腺苷酸激活蛋白激酶、PTEN诱导激酶1、Parkin和微管相关蛋白1轻链3蛋白水平以及线粒体自噬水平明显降低(P<0.05),而裂解的半胱氨酸蛋白酶蛋白3蛋白水平、白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α水平显著升高(P<0.05);与白细胞介素1β组比较,蠲痹汤各剂量含药血清组和阳性药物血清组上述各项指标呈现相反的变化(P<0.05);②PTEN诱导激酶1 siRNA可显著抑制蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β处理软骨细胞线粒体自噬的影响,降低蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β诱导的软骨细胞炎症与凋亡的保护作用;Compound C逆转了蠲痹汤含药血清对白细胞介素1β处理软骨细胞中PTEN诱导激酶1/Parkin信号通路的影响。结论:蠲痹汤含药血清通过影响线粒体自噬水平来抑制软骨细胞炎症和凋亡,从而减轻白细胞介素1β诱导的软骨细胞退化,其机制可能与调控AMPK/PTEN诱导激酶1/Parkin通路有关。

基于Akt/mTOR信号通路探讨补肾活血方对去卵巢大鼠软骨细胞自噬的影响

目的:研究补肾活血方是否可以通过调控Akt/mTOR信号通路促进去卵巢大鼠软骨细胞自噬反应来保护关节软骨。方法:选取30只SPF级12周龄雌性SD大鼠,体重(247.0±7.0)g,先随机选择6只为空白对照组,剩余大鼠采用卵巢切除术结合右膝关节腔注射碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)建立绝经后膝骨关节炎模型,随机分为模型组、BSHXR-L组、BSHXR-M组、BSHXR-H组,每组6只。运用肉眼观察评分、番红O-固绿染色、免疫组化等方法明确补肾活血方对大鼠关节软骨损伤的保护作用,Western-blot检测自噬相关蛋白的表达,qPCR检测Akt、mTOR及下游自噬基因的相对表达。结果:造模后BSHXR(L、M、H)各组均可减轻软骨组织形态学损伤,免疫组化示Collagen-Ⅱ、Aggrecan表达逐渐升高,基质金属蛋白酶-13(matrix metallopriteinase-13,MMP-13)表达逐渐降低,其中BSHXR-M组和BSHXR-H组与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果示BSHXR(L、M、H)各组自噬通路蛋白p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR受到抑制,下游蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达逐渐升高,而p62逐渐降低,呈剂量效应。qPCR结果示BSHXR(L、M、H)各组均可促进Beclin-1、LC3ⅡmRNA的相对表达,抑制p62、Akt、mTOR mRNA的相对表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾活血方可以通过抑制Akt/mTOR信号通路增强软骨细胞自噬反应,进而发挥保护软骨的作用。

补肾活血方对脂多糖诱导的软骨细胞炎症损伤的影响

目的观察补肾活血方(BSHXF)含药血清对脂多糖(LPS)诱导的软骨细胞炎症及凋亡的影响,探讨BSHXF治疗骨关节炎的作用机制。方法制备空白血清及BSHXF含药血清。采用LPS诱导C28/I2人正常软骨细胞,构建软骨细胞炎症模型。将细胞分为空白组、LPS模型组、LPS+BSHXF组,空白组以含10%空白血清的培养基培养,LPS模型组以含10μmol·L^(-1 )LPS和10%空白血清培养基培养,LPS+BSHXF组以含10μmol·L^(-1 )LPS和10%含药血清培养基培养。各组均干预48 h后,CCK-8法检测细胞活力,LDH法检测细胞毒性,ELISA法检测细胞培养基上清液中IL-6、iNOS和COX2的水平,TUNEL染色法检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-9、Bcl-2、Bax的表达及核转录因子-κB(NF-κB)信号通路关键蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65的表达。结果与空白组相比,LPS模型组软骨细胞活力降低,细胞上清液中LDH水平升高,IL-6、iNOS和COX2的水平升高,细胞凋亡率增加,Cleaved-Caspase-9及Bax蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达降低,p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值升高。与LPS模型组相比,LPS+BSHXF组软骨细胞活力增加,细胞上清液中LDH水平降低,IL-6、iNOS和COX2的水平降低,细胞凋亡率降低,Cleaved-Caspase-9、Bax蛋白表达降低,Bcl-2蛋白表达升高,p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值降低。结论BSHXF可提升LPS诱导的损伤软骨细胞的活性,减轻LPS对软骨细胞的毒性,减少炎症因子释放、抑制软骨细胞凋亡,其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路,进而发挥软骨保护作用。

下调长链非编码RNA XIST靶向miR-124/NF-κB轴缓解IL-1β诱导的软骨细胞凋亡

目的探究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)X染色体失活特异性转录本基因(X inactive specific transcript,XIST)对白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)诱导的软骨细胞凋亡的影响及其作用机制。方法生物信息学预测XIST和miR-124靶向关系并通过双荧光素酶法进行验证;实验设置正常组、IL-1β组、si-NC组、si-XIST组、miR-124-NC组、miR-124 mimics组、si-NC+inhibitor-NC组、si-XIST+inhibitor-NC组、si-NC+miR-124 inhibitor组、si-XIST+miR-124 inhibitor组。qRT-PCR检测细胞中XIST和miR-124表达;蛋白质印迹检测核因子κB P65(nuclear factor kappa B P65,NF-κB P65)蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果lncRNA XIST和miR-124间存在靶向关系;相较于正常组,IL-1β诱导的软骨细胞中lncRNA XIST表达水平、NF-κB P65蛋白表达和细胞凋亡率显著升高,miR-124表达水平显著降低(P<0.05);相较于IL-1β组,si-XIST组和miR-124 mimics组NF-κB P65蛋白表达和细胞凋亡率显著降低(P<0.05);相较于si-NC+inhibitor-NC组,si-XIST+inhibitor-NC组NF-κB P65蛋白表达和细胞凋亡率显著降低,与si-NC+miR-124 inhibitor组比较,si-XIST+miR-124 inhibitor组NF-κB P65蛋白表达和细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论下调lncRNA XIST可靶向调节miR-124/NF-κB轴,从而缓解IL-1β诱导的软骨细胞凋亡。

流体静压力通过Ca^(2+)/CaMKⅡ/MAPK信号通路调控髁突软骨细胞增殖与凋亡

目的:考察30 kPa流体静压力调控髁突软骨细胞增殖及凋亡的分子机制。方法:体外培养大鼠髁突软骨细胞,分为4组:正常压力组、30 kPa压力组、KN93对照组、30 kPa压力+KN93组。5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,EdU)标记法测定细胞增殖。流式细胞术法检测细胞凋亡比例。荧光探针法检测细胞内Ca^(2+)水平。Western blot法检测细胞钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)、p-c-Jun、c-Jun、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)、p-p38、p38蛋白表达。结果:与正常压力组相比,30 kPa压力组细胞增殖率均降低;凋亡率均提高;细胞内Ca^(2+)水平升高;CaMKⅡ蛋白表达上调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均增加,差异具有统计学意义(P<0.01)。与30 kPa压力组相比,30 kPa压力+KN93组细胞增殖率均提高;凋亡率均降低;细胞内Ca^(2+)水平降低;CaMKⅡ蛋白表达下调,(p-c-Jun)/(c-Jun)、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)、(p-p38)/(p38)的比值均降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:30 kPa静压力持续作用髁突软骨细胞,可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,提高细胞内Ca^(2+)水平,其作用机制为Ca^(2+)通过CaMKⅡ激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)信号通路。

桃仁膝康丸对骨性关节炎相关细胞因子和软骨细胞凋亡的影响

目的:用细胞学方法探讨桃仁膝康丸治疗骨性关节炎的作用和机制。方法:人滑膜成纤维细胞采用肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)-α诱导建立急性炎症模型,采用脂多糖诱导建立巨噬细胞M1极化模型,人软骨细胞采用CoCl_(2)诱导建立缺氧凋亡模型,通过CCK-8法检测桃仁膝康丸对细胞的毒性,Western Blot检测全长基质金属蛋白酶9(Full-length Matrix Metalloproteinase-9,Full MMP9)、裂解基质金属蛋白酶9(Cleaved Matrix Metalloproteinase-9,Cleaved MMP9)、TNF-α、白细胞介素(Interleukin,IL)-6、全长半胱氨酸蛋白酶3(Full Caspase-3)和裂解半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)的表达。结果:1μL/mL及以下浓度的桃仁膝康丸不影响细胞活力;Western Blot结果显示,桃仁膝康丸显著抑制滑膜成纤维细胞MMP9生成、活化,以及M1巨噬细胞炎症因子生成和软骨细胞Caspase-3活化。结论:桃仁膝康丸可通过抑制基质降解酶的生成与活化、炎症因子的生成及软骨细胞凋亡发挥治疗骨性关节炎功能,其机制涉及软骨基质降解、炎症生物学过程和细胞凋亡通路,验证了网络药理学分析结果。

地黄梓醇调控ATDC5软骨细胞的衰老

背景:课题组前期体内、体外研究结果表明地黄梓醇能够显著降低膝骨关节炎大鼠滑膜组织中炎症指标水平,同时能够延缓膝骨关节炎进展,但是否通过影响软骨细胞衰老进而延缓膝骨关节炎的进展尚未明确。目的:探讨地黄梓醇能否调控ATDC5软骨细胞衰老及可能的机制。方法:将ATDC5软骨细胞分为空白组(0.1%牛血清白蛋白)、模型组(0.1%牛血清白蛋白+1μmol/L阿霉素)、地黄梓醇低剂量组(0.1%牛血清白蛋白+1μmol/L阿霉素+20μmol/L地黄梓醇)及地黄梓醇高剂量组(0.1%牛血清白蛋白+1μmol/L阿霉素+80μmol/L地黄梓醇)。应用阿霉素诱导构建ATDC5软骨细胞衰老模型,按上述分组予以对应的处理。CCK-8法检测地黄梓醇对ATDC5软骨细胞活力的影响,筛选地黄梓醇最佳给药浓度。相应处理后应用β-半乳糖苷酶染色法检测各组ATDC5软骨细胞衰老情况;实时荧光定量PCR法检测相关基因表达(P21、P53、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13、白细胞介素6);Western blot检测P21、P53、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶13、白细胞介素6的表达水平;免疫荧光法检测P21、P53和Ⅱ型胶原表达情况;流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果与结论:(1)经鉴定成功诱导ATDC5软骨细胞并诱导衰老模型;(2)地黄梓醇浓度在0,20,40,80μmol/L时对细胞活力均无明显影响,提示地黄梓醇对细胞无毒性,可安全使用(P> 0.05);当浓度≥100μmol/L时,细胞活力降低,提示可能存在毒性,故选择80μmol/L作为高剂量进行后续实验;(3)与空白组β-半乳糖苷酶阳性细胞百分率(17.32±0.72)%比较,模型组(86.93±2.18)%显著升高(P <0.05);与模型组比较,地黄梓醇低、高剂量组(57.28±1.73)%、(27.18±0.97)%均显著降低(P <0.05);(4)与模型组比较,地黄梓醇低、高剂量组的P21、P53、基质金属蛋白酶13、白细胞介素6 mRNA和蛋白相对表达量均显著下调,而Ⅱ型胶原的mRNA和蛋白相对表达量显著上调(P <0.05),高剂量组更为明显(P <0.05);(5)与模型组比较,地黄梓醇低、高剂量组的P21、P53荧光信号均显著减弱,而Ⅱ型胶原的荧光信号显著增强(P <0.05),高剂量组更为明显(P <0.05);(6)经Annexin V/PI法检测各组细胞凋亡情况,与空白组比较,模型组的凋亡情况无明显变化(P> 0.05);与模型组比较,地黄梓醇低、高剂量组的凋亡指标均显著升高,且以高剂量组更为明显(P <0.05);(7)提示地黄梓醇能够通过促进衰老的ATDC5软骨细胞凋亡,进一步清除衰老的ATDC5软骨细胞,降低衰老相关表型进而延缓骨关节炎的进展。

橙皮素抑制氧化应激影响软骨细胞的炎性退变

背景:研究表明,橙皮素可以通过多种机制或者信号通路对软骨细胞产生保护作用,但其保护机制尚未完全阐明。目的:探讨橙皮素对脂多糖诱导的软骨细胞炎性退变的影响。方法:体外提取、培养SD乳鼠关节软骨细胞,采用番红O染色鉴定。通过MTT法检测细胞毒性确定最佳橙皮素干预浓度。将软骨细胞随机分为3组:对照组、模型组和实验组,后2组采用脂多糖诱导软骨细胞建立骨关节炎细胞模型,实验组造模后给予橙皮素干预24 h。采用Calcein-AM/EthD-Ⅰ染色检测细胞活性,免疫组化染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原的表达,活性氧检测试剂盒检测软骨细胞内活性氧水平,ELISA检测软骨细胞内抗氧化剂总谷胱甘肽水平,qRT-PCR检测炎症基因白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和软骨特异性基因Ⅱ型胶原基因的表达。结果与结论:①番红O染色结果表明,提取的细胞为软骨细胞;②细胞毒性实验表明0.5μmol/L橙皮素干预软骨细胞活力最明显;③与对照组比较,模型组软骨细胞增殖能力降低,活性氧水平升高,总谷胱甘肽水平下降,Ⅱ型胶原降解增加,白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达水平升高,软骨特异性Ⅱ型胶原基因表达水平下降,差异均有显著性意义(P<0.05);④与模型组比较,实验组软骨细胞增殖能力上升,活性氧水平下降,总谷胱甘肽水平上升,Ⅱ型胶原降解减少,白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α基因表达水平下降,软骨特异性Ⅱ型胶原基因表达水平升高(P<0.05)。结果表明:橙皮素对脂多糖诱导的骨关节炎软骨细胞炎性退变具有保护作用,其机制可能与橙皮素抑制活性氧介导的氧化应激有关。

银耳多糖对人软骨细胞的增殖效应和抗炎作用

目的:骨关节炎(Osteoarthritis,OA)是一种常见的慢性关节性疾病,本研究旨在探究银耳多糖对骨关节炎细胞模型人软骨细胞T/C-28a2的增殖效应和抗炎作用。方法:通过MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide)和结晶紫染色实验检测银耳多糖对T/C-28a2细胞增殖活力和细胞毒性的影响;用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)处理T/C-28a2细胞建立骨炎症模型,酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测药物处理后细胞白介素-6(Interleukin-6,IL-6)的表达;利用蛋白免疫印迹(Western blot)检测药物处理后相关骨保护因子和炎症因子的表达;通过ROS活性氧释放实验检测药物对细胞的氧化应激水平和抗炎症反应。结果:银耳多糖能够促进人软骨细胞T/C-28a2的增殖活力,且没有明显的细胞毒性;使用LPS刺激软骨细胞模拟骨炎症的环境,药物处理后发现银耳多糖和硫酸软骨素处理能减少IL-6分泌从而抑制炎症发生;进一步Western blot检测发现银耳多糖刺激后,相关骨保护因子(Osteoprotegerin,OPG)的表达上调,而促凋亡相关蛋白Bax、细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal-regulated kinases,ERK-MAPK)和核内转录因子κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)的表达下调。活性氧(Reactive oxygen species,ROS)释放实验结果显示,银耳多糖和硫酸软骨素能够抑制细胞内ROS水平,抑制炎症反应的发生。结论:银耳多糖具有抑制骨关节炎的效用,可以在一定程度上保护软骨组织,抵抗细胞凋亡。本研究初步探讨了银耳多糖的抗炎作用及机制,为开发银耳多糖作为抗炎药物提供初步的实验依据。

狗脊多糖调控lncRNA NEAT1延缓椎间盘终板软骨细胞衰老的作用研究

目的:探讨狗脊多糖通过调节lncRNA NEAT1延缓椎间盘终板软骨细胞衰老的作用机制。方法:将15只C57BL/6小鼠的椎间盘终板软骨细胞进行体外培养;经10 ng·mL-1白细胞介素-1β(IL-1β)干预24 h诱导软骨细胞;将软骨细胞随机分为空白对照组、模型对照组(10 ng·mL-1IL-1β)和狗脊多糖各剂量组(100,200,400μg·mL-1);Real-time PCR及Western blot分别检测狗脊多糖对IL-1β诱导软骨细胞lncRNA NEAT1、衰老相关通路p53-p21中p53、p21水平及衰老相关分泌表型的基质金属蛋白酶-13(MMP-13)、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表达情况;流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡率情况。结果:Real-time PCR结果显示,经IL-1β诱导的椎间盘终板软骨细胞中lncRNA NEAT1、p21、p53水平显著增高;与模型对照组比较,狗脊多糖各剂量组lncRNA NEAT1、p21、p53水平显著降低;与空白对照组比较,经IL-1β诱导的椎间盘终板软骨细胞中MMP-13、Caspase-3蛋白表达含量显著增高,CollagenⅡ蛋白表达降低;经狗脊多糖干预后,可显著改善MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3蛋白表达;此外,与模型对照组比较,狗脊多糖各剂量组椎间盘终板软骨细胞凋亡率呈现下降趋势。结论:狗脊多糖通过调控lncRNA NEAT1影响p53、p21、MMP-13、CollagenⅡ、Caspase-3表达,降低软骨细胞凋亡率,进而延缓椎间盘终板软骨细胞衰老。

长基因间非蛋白编码RNA 00707对骨关节炎软骨细胞损伤及炎症因子分泌的影响

背景:长基因间非蛋白编码RNA(long intergenic non-protein coding RNA,LINC RNA)00707和miR-423-5p均参与了骨关节炎的发生发展过程,Starbase预测LINC00707和miR-423-5p存在互补序列,但二者是否存在相互作用仍需要进一步研究。目的:考察LINC0070是否通过靶向miR-423-5p影响骨关节炎的软骨细胞损伤及炎症因子分泌。方法:将关节软骨细胞分8组培养:①空白对照组不进行任何处理;②IL-1β组用含10 ng/mL白细胞介素1β的培养基处理48 h;③IL-1β+si-NC组将si-NC转染至细胞中,然后用白细胞介素1β处理48 h;④IL-1β+si-LINC00707组将si-LINC00707染至细胞中,然后用白细胞介素1β处理48 h;⑤IL-1β+miR-NC组将miR-NC转染至细胞中,然后用白细胞介素1β处理48 h;⑥IL-1β+miR-423-5p组将miR-423-5p模拟物转染至细胞中,然后用白细胞介素1β处理48 h;⑦IL-1β+si-LINC00707+anti-miR-NC组将si-LINC00707与anti-miR-NC共转染至细胞中,然后用白细胞介素1β处理48 h;⑧IL-1β+si-LINC00707+anti-miR-423-5p组将si-LINC00707与anti-miR-423-5p共转染至细胞中,然后用白细胞介素1β处理48 h。干预结束后进行相关检测。结果与结论:①与空白对照组相比,IL-1β组软骨细胞中LINC00707基因表达量增加、miR-423-5p基因表达量减少,细胞凋亡率及裂解caspase3、裂解caspase9蛋白表达量增加,培养液内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平升高,白细胞介素10水平降低(P均<0.05);与IL-1β组相比,IL-1β+si-LINC00707组软骨细胞中LINC00707基因表达量减少、miR-423-5p基因表达量增加,细胞凋亡率及裂解caspase3、裂解caspase9蛋白表达量减少,培养液内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平降低,白细胞介素10水平升高(P均<0.05)。②与IL-1β+miR-NC组相比,IL-1β+miR-423-5p组软骨细胞中miR-423-5p基因表达量增加,细胞凋亡率及裂解caspase3、裂解caspase9蛋白表达量减少,培养液内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平降低,白细胞介素10水平升高(P均<0.05)。③与IL-1β+si-LINC00707+anti-miR-NC组相比,IL-1β+si-LINC00707+anti-miR-423-5p组软骨细胞中miR-423-5p基因表达量减少,细胞凋亡率及裂解caspase3、裂解caspase9蛋白表达量增加,培养液内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6水平升高,白细胞介素10水平降低(P均<0.05)。④结果表明,抑制LINC00707可靶向miR-423-5p减轻白细胞介素1β诱导的关节软骨细胞凋亡和炎症反应。