软骨细胞与间充质干细胞诱导成软骨肥大分化的调控机制及策略

软骨肥大分化是应用间充质干细胞(bone mesenchymal stem,MSCs)治疗软骨损伤修复的面临的一个难题。软骨肥大分化在骨关节炎中也经常会出现。如何抑制软骨肥大是应用MSCs进行软骨修复以及治疗骨关节炎亟待解决的问题。MSCs是一种具有多向分化潜能的细胞,能够在体内或体外分化成多种细胞,包括骨细胞、软骨细胞、肌细胞和脂肪细胞等多种功能性细胞。

肥大软骨细胞在骨折愈合中的作用

骨折愈合是一个多因素的过程。软骨内成骨是骨折愈合的重要途径,包括软骨骨痂的形成和软骨向骨的转化过程。肥大软骨细胞是软骨细胞的终末成熟状态,位于软骨性骨痂和骨性骨痂之间,以自分泌和旁分泌方式调节细胞基质降解、血管化、破骨细胞募集和成骨细胞分化。此外,肥大软骨细胞可以转分化成为成骨祖细胞和成骨细胞,并直接促进编织骨的形成。阐明肥大软骨细胞在骨折愈合中的作用将有利于认识骨折愈合的生理机制,进而有助于促进骨折愈合治疗模式的研发,加速骨折的愈合。

SMAD3介导TGF-β1刺激软骨细胞增殖和抑制软骨细胞肥大性分化(英文)

为研究TGF β1 SMAD3信号对小鼠软骨细胞增殖和分化的影响 ,分离了野生型与Smad3基因剔除 (Smad3ex8 ex8)突变纯合子小鼠肋骨软骨细胞并进行了体外培养 .通过3 H TdR参入实验检测了体外培养软骨细胞的增殖能力 .TGF β1可以刺激野生型软骨细胞的增殖 ,Smad3基因缺失导致小鼠软骨细胞丧失对TGF β1刺激生长作用的应答 .Northern杂交显示 ,TGF β1促进野生型小鼠软骨细胞表达Ⅱ型胶原 ,而Smad3基因缺失突变纯合子软骨细胞大量表达肥大性软骨细胞的分子标记物X型胶原 .结果表明 ,SMAD3介导转化生长因子TGF

S100A11-RAGE通过P38MAPK信号转导通路调控小鼠骨关节炎软骨细胞肥大和细胞外基质代谢

目的探讨S100A11-RAGE通过P38MAPK信号转导通路对小鼠骨关节炎软骨细胞肥大和细胞外基质代谢的调控。方法不同浓度的外源性S100A11(0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml)与小鼠软骨细胞孵育48 h,检测基质金属蛋白酶13(MMP-13)、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达,以筛选作用最显著的S100A11浓度。加入不同浓度Anti-P38(0、1.25、2.50、5.00及10.00μg/ml)与小鼠软骨细胞预孵育12 h后,再加入作用最强的外源性S100A11孵育(10μg/ml)48 h,检测MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达。结果小鼠软骨细胞MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型胶原蛋白表达随外源性S100A11浓度的增加而增加,且明显高于对照组;而Ⅱ型胶原蛋白表达随外源性S100A11浓度的增加而减少,且明显低于对照组。加入Anti-P38预处理后,MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型胶原蛋白表达均明显低于S100A11单独处理组,而Ⅱ型胶原蛋白表达明显高于S100A11单独处理组。结论外源性S100A11通过与RAGE结合,并经P38MARK信号转导通路诱导软骨细胞肥大和细胞外基质的降解,其机制可能与通过P38MAPK信号转导通路诱导MMP-13、ADAMTS-5以及Ⅹ型胶原蛋白表达,并降低Ⅱ型胶原蛋白表达。

病患关节软骨中肥大软骨细胞的生物学特性的研究

利用原位杂交、Northernblot及免疫组化等方法检测了X型胶原、胰岛素样生长因子 (IGF -Ⅰ )及转换生长因子 (TGF - β1)mRNA在病损关节软骨 (骨关节炎、类风湿性关节炎、大骨节病和关节鼠 )及无血清培养的人的关节软骨细胞和生长板的肥大软骨细胞的表达 ,结果证明各病损的关节软骨中其细胞除簇聚的细胞外 ,单个的椭圆而大的细胞也能表达X型胶原 ,也是肥大软骨细胞 ;无血清培养的肥大软骨细胞有分化及反分化能力 ,不都是终末细胞。对肥大软骨细胞的生物学及病理生物学特性进行了讨论。

肥大软骨细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

肥大软骨细胞是软骨细胞的终末分化形式,在软骨内成骨过程中发挥十分关键的作用。为了研究肥大软骨细胞在骨骼发育过程中的功能,文章构建了在8.2 kb小鼠X型胶原基因(Coll0a1)启动子控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠品系(Coll0a1(8.2)-Cre)。采用显微注射法将11.5 kb的转基因片段导入小鼠基因组,共注射受精卵328枚,获得子代鼠51只,经PCR基因型鉴定有3只在基因组上整合有Cre重组酶基因。PCR检测发现Coll0a1(8.2)-Cre转基因在含有肥大软骨细胞的组织中表达。为了检测Cre重组酶表达的强度和组织特异性,转基因小鼠与ROSA26报告小鼠交配,子代ROSA26;Coll0a1(8.2)-Cre双转基因小鼠LacZ染色检测的结果显示,Cre重组酶在所有的肥大软骨细胞中表达。原位杂交的结果证实Coll0a1(8.2)-Cre转基因表达在肥大区的上端。通过对比发现Coll0a1(8.2)-Cre转基因表达的组织特异性和强度均优于之前我们构建的Coll0a1(1.0)-Cre转基因品系。以上结果表明,建立的肥大软骨细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠品系可以作为一种遗传学工具,介导目的基因在肥大软骨细胞中的敲除。

腺病毒介导RNA干扰抑制核心结合因子α1表达阻断软骨细胞的肥大分化

背景:软骨细胞肥大分化是软骨内骨化启动的标志,也是软骨内骨化必不可少的步骤,它是一种级联反应,一旦启动就很难阻断,最终结果是形成骨骼结构。RNA干扰技术是一种转录后水平的基因沉默,相关研究显示采用RNA干扰技术阻断核心结合因子α1表达能够有效地抑制异位骨化形成。目的:利用RNA干扰技术抑制核心结合因子α1表达,从而阻断大鼠软骨细胞肥大分化。方法:构建沉默SD大鼠核心结合因子基因的腺病毒Ad-Cbfa1-si RNA。利用维甲酸及白细胞介素1α促进软骨细胞肥大分化,观察Ad-Cbfa1-si RNA对核心结合因子α1表达的抑制作用。利用核心结合因子α1免疫组化方法比较各组核心结合因子α1的表达从而分析软骨细胞的肥大分化情况。结果与结论:经维甲酸和白细胞介素1α诱导后,阴性对照病毒组软骨细胞出现肥大分化,核心结合因子α1的表达呈阳性反应;Ad-Cbfa1-si RNA组软骨细胞中未见核心结合因子α1明显表达。提示利用RNA干扰技术能够明显抑制核心结合因子α1的表达,从而阻断软骨细胞的肥大分化。

白细胞介素—1促进肥大软骨细胞PG的分解代谢

本文观察了白细胞介素—1(IL—1β)和硫代腺苷蛋氨酸(SAM)对培养的肥大软骨细胞蛋白多糖(PG)分解代谢及基质金属蛋白水解酶(MMP)活性的影响。IL—1β(0.1—1ng/ml)能够明显促进培养的肥大软骨细胞PG分解,释放到培养液中的PG其分子量明显降低,缺乏透明质酸结合区。IL—1β(0.3ng/ml)添加组软骨细胞其MMP活性显著高于对照组;SAM具有轻微抑制IL—1促进PG分解的作用。这些结果显示了IL—1β是调节肥大软骨细胞生理和病理过程的重要的细胞因子。

肥大软骨细胞的有序凋亡在骨折愈合过程中的潜在作用

目的从细胞水平阐明骨折愈合过程中软骨痂向硬骨痂转变演化过程。方法采用小鼠胫骨不稳定骨折模型,对小鼠的骨痂进行X线摄片,HE染色,B rdu掺入检测,ColⅡ、ColX的原位杂交检测,Tunel法对原位凋亡检测。结果骨折修复愈合中后期软骨细胞大量而有序的凋亡,协同邻近编织骨内大量细胞增生侵入才是其主要的演变过程。结论肥大软骨细胞的有序凋亡是干预骨折愈合过程的潜在环节。

腺病毒介导的RNAi抑制Cbfa1表达阻断软骨细胞肥大分化的实验研究

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术来抑制核心结合因子(core binding factor α1,Cbfa1)表达,从而阻断软骨细胞肥大分化目的。方法:构建沉默SD大鼠核心结合因子基因的腺病毒(Ad-Cbfa1-siRNA)。利用维甲酸及IL-1α促进软骨细胞肥大分化,研究Ad-Cbfa1-siRNA对Cbfa1表达的抑制作用。利用Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原免疫组化的方法以及RT-PCR比较各组之间Cbfa1的表达情况来分析软骨细胞的肥大分化情况。结果:结果显示,软骨细胞经维甲酸和IL-1α诱导后,Cbfa1的表达量明显增加,经统计学分析,P<0.05,具有统计学意义。阴性对照病毒组Cbfa1的表达量明显高于Ad-Cbfa1-siRNA组,经统计学分析,P<0.05,具有统计学意义。结论:利用RNAi技术能够明显的抑制Cbfa1的表达,从而阻断软骨细胞的肥大分化。

外周血源性间充质干细胞修复骨关节炎软骨损伤的应用前景与问题

背景:随着近年组织工程技术应用到软骨修复研究领域,间充质干细胞作为一种具有自我更新、增殖能力强、产生克隆细胞群、多向分化等特点的成体干细胞,是软骨修复理想的种子细胞,而外周血源性间充质干细胞具有取材方便、创伤小等优点,已成为目前该领域的研究热点。目的:综述外周血源性间充质干细胞的研究现状及其在骨关节炎软骨修复中的应用,分析了目前临床应用受限的主要问题以及可能的解决方案,以期合理利用外周血源性间充质干细胞,为软骨损伤的治疗找到适宜的种子细胞。方法:检索PubMed数据库、万方数据库、CNKI中国期刊全文数据库收录的相关文献。英文检索词为“peripheral blood derived mesenchymal stem cells,circulating mesenchymal stem cells,cartilage repair,osteoarthritis treatment”,中文检索词为“外周血源性间充质干细胞,循环间充质干细胞,软骨修复,骨关节炎”,最终纳入57篇文献进行归纳总结。结果与结论:近年关于软骨组织工程的研究有显著和持续的增长,而外周血来源间充质干细胞有其成软骨优势,能作为更加理想的种子细胞应用于软骨组织工程,具有良好的临床应用前景。

大骨节病患者血清对培养软骨细胞蛋白多糖代谢的影响

观察了大骨节病（ＫＢＤ）患者血清对培养软骨细胞蛋白多糖（ＰＧ）合成代谢和分解代谢的影响。实验结果表明：（１）在１０％ＫＢＤ血清存在下培养的静止软骨细胞其ＰＧ合成明显低于非病区健康对照组（Ｐ＜０．０１）；（２）培养液中添加ＫＢＤ血清（５％）培养的肥大软骨细胞其释放到培养液中的ＰＧ含量显著高于非病区健康对照组（Ｐ＜０．０１），其中低分子量ＰＣ的含量增加，缺乏透明质酸结合区，不能与透明质酸结合形成ＰＧ聚合体，以上结果指出ＫＢＤ患者血清中存在干扰ＰＧ代谢的物质。

兔髂骨骺板软骨细胞体外构建骺板样软骨组织

目的 利用组织工程学技术体外构建骺板样软骨组织。方法 从 4～ 5周龄兔髂骨骺板软骨处获取软骨细胞 ,在离心管内轻微离心后 ,体外培养。行组织学观察。结果 培养至第 7天时 ,细胞呈现定向分化 ,形态与体内骺板软骨细胞相类似 :肥大软骨细胞体积较大、呈圆形或椭圆形 ;增殖、成熟软骨细胞体积小 ,呈圆形或扁圆形 ;细胞周围充满大量的细胞外基质。这些不同分化阶段的细胞形成了分化区带 ,肥大软骨细胞位于上侧 ,增殖、成熟细胞位于中间 ,其次是散在静止软骨细胞。培养第 14天 ,分化区带更加明显 ,增殖、成熟细胞和肥大软骨细胞呈现纵向定向排列。培养第 2 1天 ,组织表面出现膜样的结构。结论 体外构建的骺板样软骨组织与天然骺板的组织学形态极为相似。从髂骨处骺板处获取肥大软骨细胞进行体外构建骺板软骨材料 。

FA促进培养软骨细胞及基质发生异常矿化

采用视黄酸（Retinoicacid，RA）、抗坏血酸（VitaminC，Vc）比较研究大骨节病病区黄腐酸（Fulvicacid，FA）对体外培养肥大软骨细胞及基质的作用，发现病区FA可促进贴壁单层培养的软骨细胞形成异常的胞外基质，促进异常矿化。病区FA刺激软骨细胞产生的活性氧[1]使近细胞膜的软骨囊内蛋白颗粒减少，细蛋白纤维消失；粗长的胶原蛋白变细，胶原蛋白连接方式由正常的束状排列变为杂乱的网状；造成蛋白多糖结构散乱，使矿化位点混乱，而在伤损基质上发生片状不均匀较大量的钙化区。这种异常矿化过程与大骨节病人软骨损伤及修复性的病理矿化有相似之处，支持了大骨节病的自由基致病机理。

TAP63γ基因调节Col10a1基因表达及软骨细胞分化成熟

目的拟应用两种软骨细胞模型MCT和ATDC5细胞阐明TAP63γ基因如何调节十型胶原蛋白基因(Col10a1)基因表达及软骨细胞分化、成熟。方法应用荧光定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TAP63γ基因和Col10a1基因分别在增殖/肥大状态下小鼠MCT细胞和ATDC5细胞中的表达。应用基因转染,在MCT细胞和ATDC5细胞中过表达或抑制TAP63γ基因的表达,以研究其对Col10a1基因表达的调控作用。在细胞诱导培养的第4、7、14、21天,用阿尔新蓝染色、碱性磷酸酶染色和茜素红染色分别对稳定转染TAP63γ表达质粒的目的组和转染空载体pCMV的对照组及未转染的空白组进行染色,统计分析阳性染色面积,从而确定过表达TAP63γ基因在软骨细胞骨化期间给软骨内成骨所带来的影响。结果与增殖型软骨细胞比较,TAP63γ基因与Col10a1基因在MCT和ATDC5两种肥大型软骨细胞的相对表达量都明显升高(P<0.05)。在MCT细胞和ATDC5细胞中抑制TAP63γ基因的表达,结果导致Col10a1基因的相对表达量明显降低,而过表达TAP63γ基因则明显升高Col10a1基因的相对表达量。阿尔新蓝染色在诱导培养的第7天显示出最强的染色强度,但目的组与对照组没有明显差异;在诱导培养的第21天,碱性磷酸酶染色目的组比对照组显示出更强的染色强度,茜素红染色未见差异。结论TAP63γ基因与两种软骨细胞模型MCT和ATDC5细胞中Col10a1基因的表达一致,TAP63γ基因促进软骨细胞的成熟分化。TAP63γ基因可能与多种转录因子一起构成调节Col10a1基因表达的新型机制进而影响骨骼发育与疾病中软骨细胞成熟的进程。

骨关节炎的关节软骨细胞外基质的变化

骨关节炎是一种慢性关节疾病。其主要病变是关节软骨的退变及继发骨质增生。软骨是由软骨细胞和软骨基质组成。软骨细胞合成并分泌基质成分,而基质构成软骨细胞生活的微环境,所以细胞外基质既可敏感地反映细胞生命运动的变化,亦能对其产生重要影响。

活化素Ⅰ型受体对小鼠下颌骨髁突软骨生长发育的影响及其机制

目的:观察Ⅰ型骨形态发生蛋白(BMP)受体活化素Ⅰ型受体(ACVR1)对出生后小鼠下颌骨髁突软骨(MCC)细胞形态、增殖和分化的影响,为研究MCC相关性疾病的病因及治疗提供参考。方法:采用Cre-LoxP系统构建在C57BL/6J小鼠MCC细胞中条件性敲除ACVR1基因的动物模型。将基因型为Acvr1fx/fx;RS/RS和Acvr1+/-;Osterix(+)/(-)的雌性和雄性小鼠配对合笼,以子代Osterix-Cre(+);Acvr1fx/-;RS/+基因型小鼠为实验组,Osterix-Cre(+);Acvr1fx/+;RS/+小鼠为对照组。分别取新出生(n=3)、出生后21天(PN21)(n=4)和出生后42天(PN42)(n=5)雄性小鼠,X-gal染色检测MCC组织中Osterix-Cre表达,micro-CT法检测2组小鼠下颌骨髁突宽度和髁头长度,HE染色和甲苯胺蓝染色分析2组小鼠MCC细胞形态及各层软骨厚度,免疫组织化学(IHC)染色检测2组小鼠MCC组织中增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞数和Ⅹ型胶原水平。结果:X-gal染色和IHC染色,ACVR1条件性基因缺失小鼠模型构建成功。在PN21时,与对照组比较,实验组小鼠下颌骨髁突宽度和髁头长度明显变短(P<0.05);2组小鼠MCC细胞形态表现和结构无明显差异。与对照组比较,实验组小鼠肥大软骨细胞层(Hy)和成软骨细胞层(Ch)这2层及Hy单层MCC组织中PCNA阳性细胞数明显增多(P<0.05或P<0.01)。在PN42时,与对照组比较,实验组小鼠部分下颌骨髁突软骨细胞形态异常,部分髁突肥大软骨细胞的排列紊乱,实验组小鼠髁突软骨前1/3区的Hy和中1/3区除Hy以外的其他层细胞厚度明显增大(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,实验组小鼠MCC组织各层PCNA阳性细胞数和Ch中Ⅹ型胶原水平明显升高。结论:ACVR1通过抑制MCC细胞增殖和成软骨细胞向肥大软骨细胞的分化,从而影响MCC细胞形态及MCC组织结构。

Swell1基因在小鼠髁突软骨发育中的时空表达

目的:探讨Swell1(LRRC8A)基因在小鼠髁突软骨中的时空表达模式。方法:通过获取胚胎15.5、16.5、18.5天以及新生小鼠的髁突样本,利用H-E染色、免疫荧光染色和qRT-PCR探讨小鼠髁突显微结构及软骨发育相关基因和Swell1基因的时空表达变化。采用SPSS 25.0软件包对数据进行统计学分析。结果:Swell1基因表达于髁突发育过程中,从胚胎16.5天开始,在肥大软骨细胞层表达,之后表达逐渐增强,并在小鼠胚胎发育过程中持续表达,直至小鼠出生仍有明显表达。结论:Swell1在小鼠髁发育过程中主要在肥大软骨细胞中表达,可能参与软骨细胞肥大的调控。

Indian Hedgehog信号通路在软骨细胞成熟及转分化过程中的调控作用

目的探究Indian Hedgehog(IHH)信号通路对软骨内成骨过程中软骨细胞成熟以及转分化的影响。方法取10日龄野生型小鼠的胫骨组织,采用原位杂交和免疫组织化学染色检测生长板区域IHH信号通路相关分子Ihh、Ptch1和Gli1的表达水平。构建肥大软骨细胞特异性Ihh基因敲除小鼠(Col10a1^(Cre/+);Ihh^(null/C)),并采用影像学检查和阿利新蓝染色评估该小鼠的骨骼发育状况。构建肥大软骨细胞IHH信号通路持续激活小鼠(Col10a1^(Cre/+);R26Smo^(M2/M2)和Col10a1^(Cre/+);Ptch1^(LacZ/C)),采用HE染色、原位杂交和TUNEL染色分别对受精15.5天胎鼠胫骨组织形态结构、Ihh(肥大软骨细胞分子标志物)和Col1a1(成骨细胞分子标志物)以及肥大软骨细胞凋亡水平进行检测;另外应用HE染色对10日龄小鼠的胫骨组织进行组织学分析。结果肥大软骨细胞合成分泌IHH,但不表达Ptch1和Gli1。抑制肥大软骨细胞合成IHH蛋白会导致出生后小鼠出现侏儒症;X线检查结果显示小鼠出现严重的骨骼发育不良,包括胸廓狭小、球形头骨以及椎骨发育异常等表现。持续启动IHH信号通路时,胚胎早期软骨细胞成熟分化过程虽未见异常,但是出生后小鼠的骨小梁、骨内膜以及皮质骨等结构均出现一定的异常表现。结论IHH信号通路虽然不参与肥大软骨细胞的终末分化过程,但在软骨细胞转分化的过程中起到了重要的调控作用。

龟鹿二仙胶对膝骨关节炎大鼠软骨细胞IHH-GLI信号通路的影响

目的:观察龟鹿二仙胶含药血清对白介素-1β(IL-1β)诱导大鼠肥大软骨细胞印度刺猬蛋白-胶质细胞瘤转录因子(IHH-GLI)信号通路的作用,探讨龟鹿二仙胶对膝骨关节炎(KOA)的影响。方法:制备含药血清,提取大鼠软骨细胞,分为空白组、模型组、龟鹿组、抑制剂组,构建大鼠KOA软骨细胞肥大模型,免疫荧光观察GLI入核情况。CCK-8检测含药血清干预最佳时效及量效关系。含药血清干预24 h后,Real-time PCR、Western Blot检测软骨细胞IHH、平滑蛋白(Smo)、Runt相关转录因子2(Runx2)、X型胶原(COL10A1)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)的mRNA及蛋白表达情况。结果:荧光显微镜下,模型组GLI信号进入细胞核。与模型组比较,龟鹿组及抑制剂组IHH、Smo、Runx2、COL10A1、MMP-13 mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.05),IHH、Smo、Runx2蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01)。结论:龟鹿二仙胶调控肥大软骨细胞的分解合成代谢平衡,减少细胞外基质的降解和钙化,改善失稳态环境,可能与其抑制IHH-GLI信号通路有关。