软骨脱细胞基质/丝素蛋白活性支架的构建及其软骨组织工程研究

目的·利用软骨脱细胞基质(acellular cartilage matrix,ACM)与复合天然丝素蛋白(silk fibroin,SF)生物材料,构建具有双网络交联的生物活性组织工程支架,用于软骨组织再生。方法·用核酸酶消化法消化掉软骨组织中细胞相关的免疫原性成分,并将细胞外基质相关糖蛋白、胶原结构保留,用DNA、组织糖胺多糖、胶原定量试剂盒通过分光光度仪检测软骨组织脱细胞效率。将ACM和SF配置成混合溶液,通过加入乙二醇二缩水甘油醚与两者所含羟基、氨基发生亲核交联反应,冷冻干燥制成多孔仿生支架(n=5),同时以相同方法制备仅含有ACM或SF的多孔支架(n=5)。扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察支架微观孔隙结构,并通过力学测试对不同组支架的力学强度、弹性模量以及回弹性进行评估,以吸水率反映支架的内外物质交换能力。分离并培养兔耳软骨细胞,接种于ACM-SF支架上,SEM观察培养1、4、7 d后细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况,活/死细胞双染色观察细胞活力状况,通过CCK-8检测支架的细胞毒性,并于裸鼠皮下植入细胞支架复合物,体内培养4周、8周后,行组织学检测。各组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。结果·经酶消化后的软骨脱细胞基质几乎无细胞残留,并保留了软骨细胞外基质活性成分。ACM-SF制备的复合支架具有相互连通的微孔结构和良好的弹性,湿态下多次压缩后能恢复原状,ACM-SF的吸水率达到了近20倍,为细胞黏附环境提供了有效的物质交换条件。此外,该支架无生物毒性,具有促进软骨细胞增殖的能力;组织学检测显示,ACM-SF支架可在体内再生均质、典型的软骨组织。结论·ACM-SF复合多孔支架具有良好的仿生微环境,可应用于组织工程软骨再生。

软骨脱细胞基质支架材料的软骨组织工程实验研究

目的应用软骨脱细胞基质作为支架材料,按照组织工程的原理再生软骨,为修复软骨缺损探索新的途径。方法取新西兰大耳白兔1只,体重2.4kg,按改良Courtman法对兔耳软骨行脱细胞处理后用于实验。选用纯种6月龄新西兰大耳白兔18只,雌雄不限,体重2.4～2.6kg。每只耳形成2处1cm×1cm软骨缺损,按修复方式不同随机分为3组,每组24处缺损。A组,软骨脱细胞基质加软骨膜;B组,软骨脱细胞基质;C组软骨膜,作为对照。术后每日观察兔耳修复区的大体变化,并分别于4、12周每组处死3只动物,于修复区切取标本,行HE染色、藏红花红-奥尔新蓝染色、Ⅱ型胶原基因探针原位杂交实验。结果术后4周内A、B组大体形态无明显改变;术后12周可见修复区轻度增厚,触摸时质地较正常软骨稍硬。C组术后2周,2只2处修复区形成痂皮,术后5周痂皮脱落形成穿孔。术后4周,A、B组HE染色可见软骨脱细胞基质周边有轻度的炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主,未形成包囊,藏红花红-奥尔新蓝染色均阴性;C组软骨缺损处的软骨膜塌陷,无细胞增殖现象;各组修复区均未见Ⅱ型胶原基因探针原位杂交显色。术后12周,A组HE染色示部分软骨脱细胞基质内有新生细胞,细胞排列不规律,ECM嗜碱性增强,藏红花红-奥尔新蓝染色呈阳性,Ⅱ型胶原基因原位杂交显色示新生细胞内均有大片棕黄色阳性染色区域;B组HE染色示软骨脱细胞基质无吸收现象,周边无包囊,炎性细胞消失,藏红花红-奥尔新蓝染色呈阴性,未见Ⅱ型胶原基因原位杂交显色;C组HE染色示近软骨断端处可见部分形成新生组织,藏红花红-奥尔新蓝染色呈阳性,Ⅱ型胶原基因原位杂交显色可见棕黄色阳性染色细胞。结论脱细胞软骨可诱导软骨膜细胞向其中生长而重建软骨,软骨膜和脱细胞软骨复合移植是软骨组织工程的另一种选择。

软骨脱细胞基质-Ⅱ型胶原制备组织工程软骨纳米支架的实验研究

目的探索软骨脱细胞基质CAEM-Ⅱ型胶原(COLⅡ)通过静电纺丝法制备组织工程纳米支架的可行性。方法将兔肋软骨脱细胞、脱脂、酶解后干燥获得CAEM,再将CAEM和COLⅡ按质量比1∶2的比例混合,通过静电纺丝技术制备组织工程纳米支架,通过测定其吸水率、降解率等检测支架的理化性能,用CCK8法评价其细胞毒性及粘附性情况。结果 CAEM-COLⅡ纳米支架纤维直径为(627±165.4)nm,吸水率为(623.0±27.4)%,35天降解率为(45.6±5.8)%,CCK8法检测结果显示CAEM-COLⅡ复合支架对软骨细胞具有良好的粘附性,生物学性能良好。结论CAEM-COLⅡ纳米支架能为软骨细胞的生长和增殖提供优良的微环境,在组织工程软骨重建中具有潜在的应用价值。

应用骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质修复兔软骨缺损的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨缺损的效果。方法选取36只3~4个月龄的健康新西兰兔,分离其骨髓间充质干细胞(BMSCs),并在体外进行培养扩增。将BMSCs与关节软骨脱细胞基质在体外培养瓶中进行复合培养约3 d。将实验对象随机分为3组,分别进行3种不同的处理,实验结果用关节软骨组织学评分标准进行评分。结果移植手术后12周,移植培养好的骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质复合物的实验组修复组织和周围组织整合良好,且修复效果显著优于移植单独的关节软骨脱细胞基质组和空白对照组。结论应用骨髓间充质干细胞和关节软骨脱细胞基质的复合物能有效的修复兔关节软骨缺损。

微粒软骨脱细胞基质复合纤维蛋白凝胶构建软骨组织工程支架材料的研究

目的:应用异体微粒软骨脱细胞基质与纤维蛋白凝胶结合作为可注射性支架材料,进行体内构建良好可塑性和生物特性的组织工程化软骨。方法:制备普通家猪耳廓软骨微粒脱细胞基质,与体外扩增的小型实验猪第二代软骨细胞结合,以纤维蛋白凝胶为支架材料,利用其可注射性回植于实验猪自体腹壁外侧皮下,8周后取财进行大体及组织学检测,并与不含微粒脱细胞软骨基质实验组相比较。结果:培养出的组织工程化软骨组织细胞生长良好,具有分泌软骨基质功能,含微粒脱细胞软骨基质实验组表现出更佳的生物学性能。结论:将异体微粒软骨脱细胞基质与纤维蛋白凝胶结合,可以作为良好的可注射性复合支架材料应用于组织工程化软骨的构建。

骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨部分缺损的实验研究

目的研究骨髓间充质干细胞(BMSCs)复合关节软骨脱细胞基质修复兔关节软骨部分缺损。方法选取健康新西兰兔,分离其骨髓间充质干细胞(BMSCs),并在体外进行培养扩增。制备关节软骨脱细胞基质。建立关节软骨部分缺损模型。将实验对象随机分为A、B、C 3组,A组将BMSCs复合关节软骨脱细胞基质修复软骨缺损;B组单纯用脱细胞软骨基质修复缺损;C组为软骨缺损处不做任何处理。术后第4、8、12周处死动物,通过大体、组织切片观察,实验结果用Wakitani评分量表进行评分。结果移植手术后12周,A组形成透明软骨样组织,修复效果显著优于B组、C组。结论骨髓间充质干细胞复合关节软骨脱细胞基质可有效修复兔关节软骨部分缺损。

Ⅱ型胶原-透明质酸-软骨脱细胞基质制备组织工程软骨支架的实验研究

目的探索Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,COLⅡ)-透明质酸(Hyaluronic acid,HA)-软骨脱细胞基质(Cartilageacellular extracellular matrix,CAEM)通过低温冷冻法制备组织工程软骨支架的可行性。方法将COLⅡ和HA及CAEM按15∶3∶45的比例混合,通过低温冷冻干燥的方法制备组织工程软骨支架,测定其孔隙率、吸水率、降解率,检测支架的理化性能,并行HE染色及甲苯胺蓝染色观察支架结构情况。用CCK8法评价其细胞毒性及粘附性情况。结果 COLⅡ-HA-CAEM复合支架孔隙率为87.3%±3.7%,吸水率为1522.0%±29.3%,21天降解率为29.2%±2.4%,CCK8法检测结果显示,COLⅡ-HA-CAEM复合支架对细胞具有良好的粘附性,其生物学性能良好。结论 COLⅡ-HA-CAEM复合支架能为软骨细胞的生长和增殖提供优良的微环境,在组织工程软骨重建中具有潜在的应用价值。

软骨脱细胞基质仿生支架体外构建组织工程软骨

目的探索软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架体外构建组织工程软骨的可行性。方法将软骨组织彻底粉碎后脱细胞处理,复合一定比例的明胶(GT)制备三维多孔支架。分析比较不同ACM/GT比例多孔支架的孔径、孔隙率、生物力学和降解速率,选取最适宜软骨体外再生的一组多孔支架用于体外构建。获取、培养猪关节软骨细胞,接种于ACM多孔支架上,体外培养8周后,行大体观察及组织学检测。结果ACM多孔支架孔隙分布均匀,随ACM含量的增加,孔径和孔隙率逐渐增大,力学强度逐渐降低,其中,ACM:GT=5:5组在孔径和孔隙率方面均适宜体外软骨再生。大体观察和组织学检测显示,ACM支架可体外再生均质、典型的软骨组织。结论ACM可制成适宜软骨再生的三维多孔支架,并可体外构建组织工程软骨。

同种异体软骨脱细胞基质在关节软骨缺损中的应用研究

目的:探索使用同种异体软骨脱细胞基质( DCM)修复关节软骨缺损的效果及可能机制。方法:原代培养新西兰大白兔耳软骨细胞和骨髓间充质干细胞( BMMSCs),软骨细胞扩增后诱导形成软骨细胞膜片,将细胞膜片脱细胞处理后制作为DCM,冷冻干燥备用。将BMMSCs 附和在DCM 表面共培养,SEM 观察材料微观形态以及BMMSCs 与材料的附和情况。qPCR检测DCM 对BMMSCs 软骨向分化的影响。使用同种异体DCM 修复兔膝关节软骨缺损,3个月后使用HE 染色和免疫组织化学染色检测缺损修复效果。结果:成功培养出复层软骨细胞膜片并制作出DCM;在SEM 下观察可见BMMSCs 与DCM结合良好;并发现DCM 可诱导BMMSCs 分泌细胞外基质。qPCR检测发现DCM 促进BMMSCs 表达COL-II 和SOX-9 表达,抑制COL-I 和COL-X 表达,不影响Aggrecan 表达。动物实验显示DCM + BMMSCs 组关节软骨缺损的修复程度优于对照组。结论:同种异体DCM 可能是通过SOX-9 通路诱导BMMSCs 的软骨向分化,促进软骨缺损的修复。

软骨脱细胞基质仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞成软骨分化的影响

目的探讨软骨脱细胞基质(ACM)仿生支架的制备及其对骨髓基质干细胞(BMSCs)成软骨分化的影响。方法将软骨组织粉碎后脱细胞处理,并以不同的比例与明胶(GT)溶液混合并交联,冷冻干燥制成多孔仿生支架。用扫描电镜(SEM)观察不同交联比例制成的ACM/GT支架,并对其孔径、孔隙率、生物力学、降解速率进行评估,从而选取最优组用于体外软骨构建。分离并培养山羊BMSCs,接种于单纯GT和ACM/GT支架上,SEM观察培养1、7、14 d后细胞在支架上的黏附、分布与基质分泌情况,并通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)评估成软骨分化能力。结果制备的ACM无细胞残留。随着ACM占比增加,孔径逐渐增大,降解速率逐渐增快,力学强度逐渐降低。其中G2A2组在孔径、孔隙率、生物力学和降解速率方面均适宜体外构建软骨组织。SEM显示细胞在单纯GT和G2A2支架上均匀分布,增殖显著,基质分泌明显。qRT-PCR显示G2A2显著促进了BMSCs的成软骨分化。结论ACM可以制备成适宜软骨再生的支架材料,并可促进BMSCs的成软骨分化。

软骨脱细胞基质-Ⅱ型胶原纳米支架复合BMSC修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的观察软骨脱细胞基质(Cartilage acellular extracellular matrix,CAEM)-Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,COLⅡ)纳米支架,复合骨髓基质干细胞(Bone marrow stem cells,BMSCs)修复兔关节软骨缺损的效果。方法 CAEM和COLⅡ按质量比1∶1混合,通过静电纺丝技术制备组织工程纳米支架。将第二代BMSCs种植到该支架上,培养箱内静置2 h。12只日本大耳白兔随机分为实验组和对照组,将细胞支架复合物植入实验组兔膝关节软骨缺损处,对照组仅行膝关节软骨缺损建模。12周后实验动物取材,大体观察修复效果,并行HE染色、Ⅱ型胶原染色观察。结果大体观察见实验组软骨缺损修复良好,对照组软骨缺损处由肉芽样组织充填。HE染色显示,实验组关节软骨缺损处可见软骨陷窝形成,对照组关节软骨缺损处仅有纤维组织充填。实验组修复区Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组为阴性。结论 CAEM-COLⅡ纳米支架复合BMSC,对兔关节软骨缺损具有较好的修复能力,具有潜在的临床应用价值。

软骨脱细胞基质-Ⅱ型胶原纳米支架复合BMSC修复兔关节软骨缺损的实验研究

目的：观察软骨脱细胞基质（Cartilage acellular extracellular matrix,CAEM）-Ⅱ型胶原（CollagenⅡ,COLⅡ）纳米支架,复合骨髓基质干细胞（Bone marrow stem cells,BMSCs）修复兔关节软骨缺损的效果.方法：CAEM和COLⅡ按1：1比例混合,通过静电纺丝技术制备组织工程纳米支架.将第2代BMSCs种植到该支架上,培养箱内静置2小时.12只新西兰大白兔随机分为观察组和对照组,将细胞支架复合物植入观察组兔膝关节软骨缺损处,对照组仅行膝关节软骨缺损建模.12周后实验动物取材,大体观察修复效果,并行HE染色、Ⅱ型胶原染色观察.结果：大体观察见观察组软骨缺损修复良好,对照组软骨缺损处由肉芽样组织充填.HE染色显示,观察组关节软骨缺损处可见软骨陷窝形成,对照组关节软骨缺损处仅有纤维组织充填.观察组修复区Ⅱ型胶原染色为阳性,对照组为阴性.结论：CAEM-COLⅡ纳米支架复合BMSC,对兔关节软骨缺损具有较好的修复能力,具有潜在的临床应用价值.

携带HGF基因的人脐带血干细胞复合软骨脱细胞基质移植对兔膝关节软骨缺损修复的生物力学影响

目的评估携带腺病毒介导的人肝细胞生长因子基因(Ad-HGF)的人脐带血干细胞复合软骨脱细胞基质移植对兔膝关节软骨缺损修复后的生物力学影响。方法利用密度梯度法分离脐血干细胞,培养传代。将构建的Ad-HGF转染脐血干细胞,接种在软骨脱细胞基质,共同培养。建立兔关节软骨缺损模型(32只,共64条膝)。随机分为4组:A.Ad-HGF转染脐血干细胞组(n=18条膝);B.Ad-HGF转染脐血干细胞复合脱细胞基质组(n=18条膝);C.脱细胞基质组(n=18条膝);D.空白对照组(n=10条膝)。将生长旺盛的Ad-HGF修饰的脐血干细胞(3×106细胞,0.5m L)、接种有Ad-HGF修饰的脐血干细胞(3×106)的软骨脱细胞基质//软骨脱细胞基质和0.5m L生理盐水根据不同组别分别移植于关节软骨缺损处。术后4、8、12周,评价关节活动度,测定再生关节软骨面积以及生物力学。结果在各观察时间点,B组兔关节肿胀度较轻,且关节活动度明显优于其他组(P<0.01)。术后随着时间推移,软骨缺损处逐渐被新生组织覆盖。12周,B组兔膝关节再生软骨的表面积已基本覆盖造模缺损区,与其余三组比较差异有统计学意义(P<0.01)。各组实验兔的软骨缺损处的剪切强度,弹性模量随着时间的推移,逐渐升高,剪切应变随着时间推移,逐渐降低,B组与其余三组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论携带HGF基因的人脐带血干细胞复合软骨脱细胞基质移植可以提高兔关节软骨缺损后愈合的质量,缩短愈合时间,为临床软骨损伤的治疗提供新的思路。

脱细胞软骨细胞外基质匀浆联合氧化苦参碱治疗大鼠骨关节炎

背景:脱细胞软骨细胞外基质治疗骨关节炎具有一定的效果,但其单独应用时的治疗效果有限。氧化苦参碱可缓解白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡和细胞外基质降解。目的:观察不同剂量氧化苦参碱与脱细胞软骨细胞外基质联合膝关节腔注射对大鼠骨关节炎的治疗作用。方法:获取SD大鼠股骨软骨,采用物理、化学与酶相结合的方法制备脱细胞软骨细胞外基质。取50只SD大鼠,利用随机数字表法分为假手术组、骨关节炎组、单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组,每组10只,后4组采用改良Hulth法建立大鼠骨关节炎模型。造模成功后,单纯材料组大鼠膝关节腔注射脱细胞软骨细胞外基质匀浆,低剂量药物组、高剂量药物组膝关节腔分别注射含50,100μg氧化苦参碱的脱细胞软骨细胞外基质匀浆。注射4周后取材进行相关检测。结果与结论:①与假手术组比较,骨关节炎组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平升高(P<0.05),超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05);与骨关节炎组比较,低剂量药物组、高剂量药物组关节腔积液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子ɑ、丙二醛水平降低(P<0.05),超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05),其中高剂量药物组变化更显著。②Tunel染色显示,与假手术组相比,骨关节炎组凋亡软骨细胞增多;与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组凋亡软骨细胞减少,其中高剂量药物组减少更显著。③苏木精-伊红与免疫组化染色显示,骨关节炎组大鼠膝关节软骨严重退变,软骨组织中Ⅱ型胶原表达降低(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,单纯材料组、低剂量药物组、高剂量药物组大鼠膝关节软骨退变明显改善,软骨组织中Ⅱ型胶原表达升高(P<0.05)、基质金属蛋白酶9表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善最显著。④Western blot检测显示,与假手术组相比,骨关节炎组软骨组织中Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达升高(P<0.05);与骨关节炎组相比,低剂量药物组、高剂量药物组Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.05),Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Bax蛋白表达降低(P<0.05),其中高剂量药物组改善更显著。⑤结果表明,膝关节腔内联合注射脱细胞软骨细胞外基质与氧化苦参碱可通过促进细胞外基质的合成、抑制炎症与氧化应激反应、抑制软骨细胞凋亡发挥骨关节炎治疗作用,该治疗作用可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。

软骨脱细胞基质对软骨细胞生物学功能的影响

目的 检测软骨脱细胞基质（ACM）对软骨细胞的生物学作用,探讨其作为软骨组织工程支架的可行性.方法 切取健康的雄性日本大耳白兔膝关节的软骨,经低温粉碎成软骨颗粒,通过多步骤酶方法将软骨颗粒行脱细胞处理,并用含20%胎牛血清的DMEM研磨制成ACM液.再切取兔膝关节的软骨,制成碎屑后分离培养软骨细胞.取培养第2、3代的软骨细胞,分成对照A组和B、C、D3个实验组（分别加入0.5、1.0、5.0ms/ml的ACM液）.采用MTT法检测软骨细胞的活力,测定糖胺多糖的含量,以及H-胸腺嘧啶（3H-TdR）和3H-脯氨酸（3H-Pro）掺人法测定软骨细胞的增殖情况和胶原的合成能力.结果 ACM扫描电镜观察软骨巢内软骨细胞消失.软骨细胞在ACM液中生长良好,形态正常.B、C、D与A组相比,软骨细胞的生长活力分别增加了7.73%、13.50%、16.5%（P〈0.05或P〈0.01）.糖胺多糖的含量在B组与A组相比其差异无统计学意义（P〉0.05）;而C、D组比A组增加了51.15%、62.68%（P〈0.05或P〈0.01）.软骨细胞3H-TdR和3H-Pro掺入后,在B、C、D组中细胞的增殖及合成的胶原与A组相比,其差异均有统计学意义（P〈0.01）.结论 ACM能够提高软骨细胞的生长活力,增加糖胺多精的含量,刺激软骨细胞的增殖和胶原的合成,是可供选择的组织工程支架材料之一.

新型软骨脱细胞基质海绵的制备及生物相容性评价

目的探讨利用猪耳软骨脱细胞基质制备海绵状多孔支架材料的方法,及其用作组织工程关节软骨支架材料的可行性。方法取新鲜猪耳软骨低温粉碎后,筛取粒径90μm以下软骨微粒经低温脱细胞处理,冻干,用1.5%乙酸分散制备质量体积比为2%的胶状悬液,低温冻干成型。行理化性能检测测定其孔径、孔隙率及吸水率,并行组织学及扫描电镜观察。24只SD大鼠脊柱两侧皮下分别植入制备的软骨脱细胞基质海绵(实验组)和ColⅠ海绵(对照组);于术后1、2、4、8周取材行组织学观察,分析软骨脱细胞基质海绵在体内的吸收降解情况。取1周龄新西兰大白兔股骨骨髓,培养获取第3代BMSCs,分别采用浓度为50%(A组)及100%(B组)的软骨脱细胞基质海绵浸提液及DMEM培养液(C组)进行培养,于培养后2、4、6dMTT法测定细胞增殖。结果制备的软骨脱细胞基质海绵呈白色多孔状,组织学观察示材料中无软骨细胞碎片残留,主要由胶原构成。扫描电镜显示材料呈多孔蜂巢状,孔洞相互连接,孔径均匀。吸水率为2029%±253%,孔径为(90.66±21.26)μm,孔隙率为90.10%±2.42%。支架材料植入SD大鼠皮下后可见组织长入材料,血管生成,炎性反应较对照组轻,材料可按一定速率降解吸收。MTT法检测结果示,浸提液培养2、4d,3组间吸光度(A)值差异无统计学意义(P>0.05);6d,3组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论将软骨脱细胞基质进行改性处理制备的海绵支架材料脱细胞彻底,保留了软骨ECM主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,孔隙分布均匀,生物相容性好,可作为软骨组织工程的支架材料。

人脂肪干细胞与软骨脱细胞基质3D打印构建三维细胞生物支架的研究

目的人脂肪干细胞(hASCs)与软骨脱细胞基质(CAM)3D打印构建适合细胞生长的三维细胞生物支架。方法从郑州大学第二附属医院10例抽脂患者的脂肪组织中提取脂肪干细胞进行体外培养,取第3代hASCs进行软骨诱导,用阿利新蓝染色检测hASCs的软骨分化。通过脱细胞方法对猪耳软骨进行脱细胞,后对脱细胞效果进行检测。利用制备的CAM和海藻酸钠(SA)按(CAM∶SA 7∶3、6∶4、5∶5、4∶6)进行混合,用3D打印机打印成个性化三维生物支架,通过细胞计数试剂盒(CCK-8)进行支架细胞毒性检测,对不同比例支架的生物学特性如孔隙率、力学性能、降解率进行比较,找出最优的支架混合比例。用上述最优比例接种hASCs(1×10^(6)个)行3D打印,三维细胞生物支架体外培养1周后在倒置显微镜下观察细胞存活情况。组间采用t检验。结果hASCs传代后在显微镜下观察呈梭形、多角形,胞质丰富,胞核清楚。hASCs经软骨诱导剂诱导后,hASCs可向软骨分化。猪耳软骨经脱细胞后效果良好,内部无细胞残留,DNA残留量和未脱细胞软骨比较,差异有统计学意义(t=65.420,P<0.05)。支架浸提液和完全培养液分别培养hASCs比较,培养后第2、4、6天时间点,细胞增殖数量比较,差异无统计学意义(t=1.750、2.365、2.106、P>0.05)。3D打印不同比例的支架,CAM含量越多,降解速率越快,力学强度和孔隙率越小。其中5∶5和4∶6混合比例形成的支架生物学性能更优。hASCs(1×10^(6)个)混合这两种比例支架经3D打印形成个性化三维支架,活死细胞染色显示,第3天和第7天时间点,5∶5支架混合的hASCs活细胞更多。细胞增殖比较,第3天和第7天时间点,5∶5支架混合的hASCs增殖数量多余4∶6比例组,差异有统计学意义(t=4.350、4.922,P<0.05)。结论比例为5∶5的CAM-SA经3D构建的三维生物支架最适合细胞生长。

可塑形脱细胞软骨基质材料的制备及性状研究

目的利用牛膝关节透明软骨进行脱细胞处理,制备新型可塑形生物材料,探讨脱细胞软骨基质作为组织工程载体材料的可行性。方法采集新鲜牛膝关节,切取关节表面透明软骨,冻干后低温粉碎为软骨微粒,胰酶、TritonX-100及低张Tris-HCl溶液联合作用进行脱细胞处理,冷冻干燥塑形,紫外线交联后制备脱细胞软骨基质材料。采用组织学、免疫组织化学、扫描电镜、孔隙率测定及生物力学检测等对材料的理化性状进行观察分析。取4只成年新西兰白兔骨髓制备BMSCs,传至第3代进行实验。观察浓度分别为100%、10%及1%的材料浸提液培养BMSCs0、24、48及72h后相对乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放率,以含5%FBS的DMEM培养基作为阴性对照,观察细胞毒性作用;并将浓度为1×107个/mL的BMSCs单细胞悬液与材料复合培养,观察细胞黏附情况。结果制备的脱细胞软骨基质材料呈白色多孔状结构。HE染色示材料由纤维状的软骨微粒形成网状结构,基质内无细胞成分残留;阿尔新蓝染色示微颗粒呈蓝色。材料Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。扫描电镜材料为多孔状海绵结构,孔径30～150μm。压汞法测定材料平均孔隙率为89.37%,平均孔径为90.8μm。力学分析示脱细胞软骨基质材料的压缩模量为(17.91±0.98)MPa,未经脱细胞处理的软骨微粒材料压缩模量为(15.12±0.77)MPa,差异无统计学意义(P>0.05);与正常牛关节软骨的(26.30±1.98)MPa比较差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞毒性实验显示,培养0、24、48及72h,100%、10%、1%浓度材料浸提液条件培养基和阴性对照DMEM培养基相对LDH释放率差异无统计学意义(P>0.05)。细胞黏附实验显示细胞可黏附于材料上,生长状态良好。结论牛关节软骨经脱细胞处理后,制成的多孔状脱细胞软骨基质材料,既保持了软骨基质中的主要成分,又具有良好的理化性质和生物相容性,可作为组织工程研究的一种新型载体材料。

羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性

背景:羟基丁酸-羟基辛酸共聚体[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyoctanoate),PHBHOx]是一种新型的多聚羟基烷酸类材料,具有优良的可塑性、生物相容性、生物可降解性等性能,但同其他酯类材料相似,PHBHOx亲水性能较差,单纯PHBHOx材料支架细胞黏附性能明显不足。目的:观察羟基丁酸-羟基辛酸共聚体/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附性。方法:取新鲜猪膝关节表面透明软骨,采用非离子型去污剂TritonX-100、低渗Tris-HCl以及Dna酶和Rna酶等进行脱细胞处理。低温粉碎后与PHBHOx以不同比例复合,采用溶剂浇铸-颗粒沥滤技术制备支架。分离培养猪关节软骨细胞,进行细胞-支架黏附实验并通过MTT比色法和扫描电镜观察软骨细胞在支架上的黏附存活情况。结果与结论:PHBHOx/脱细胞软骨基质支架的细胞黏附率较对照组显著提高,软骨细胞在支架上黏附紧密,生长良好。提示复合脱细胞软骨基质可以明显提高单纯PHBHOx支架的细胞黏附性能。

同种脱细胞软骨基质与软骨细胞体外培养的实验研究

目的研究脱细胞软骨基质能否作为一种软骨细胞培养支架及其对软骨细胞的影响。方法将脱细胞软骨基质与软骨细胞体外复合培养,通过相差显微镜和组织学分析,观察脱细胞软骨基质变化及软骨细胞的生长情况。结果软骨细胞能在脱细胞软骨基质表面生长,脱细胞软骨基质经过培养无降解变形,结构与培养前基本相同。结论脱细胞软骨基质对软骨细胞无毒性作用,作为一种天然软骨细胞培养支架,脱细胞软骨基质在细胞空穴之间的贯通方面需要改进。