针刺激活轴抑制蛋白1、腺苷酸活化蛋白激酶、丝/苏氨酸蛋白激酶信号通路对失神经骨骼肌萎缩大鼠的保护作用

目的研究针刺对失神经骨骼肌萎缩大鼠骨骼肌细胞丝/苏氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、轴抑制蛋白1(Axin1)表达水平的影响。方法将48只SD大鼠采用简单随机分组分为空白对照组、假手术组、模型组和针刺组各12只。模型组和针刺组大鼠采用手术切断坐骨神经制备失神经骨骼肌萎缩大鼠模型,假手术组只暴露坐骨神经,空白对照组不做任何处理。针刺组在造模后进行电针治疗(“足三里”和“承山”穴),每次10 min,连续治疗3周。治疗后,检测各组大鼠绯肠肌组织的湿重比、肌纤维横截面积及肌细胞直径比;HE染色检测各组大鼠绯肠肌损伤;TUNEL染色检测各组大鼠绯肠肌细胞凋亡;蛋白质印迹法(Westernblotting)检测p-AKT、AKT、p-AMPK、AMPK、Axin1、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl相关X蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶(cleavedcaspase-3)和增殖细胞核抗原(PCNA)蛋白的表达。结果与空白对照组和假手术组相比,模型组大鼠腓肠肌湿重比(0.38±0.06)、肌纤维截面积比(0.52±0.12)和肌纤维直径比(0.53±0.16)均明显下降(P<0.05),细胞凋亡率(30.85±5.74)%明显升高(P<0.05),Bcl-2(0.40±0.03)、Bax(0.53±0.05)、cleavedcaspase-3(0.58±0.06)、PCNA(0.44±0.05)、p-AKT/AKT(0.54±0.06)、p-AMPK/AMPK(0.73±0.04)和Axin1(0.41±0.05)的表达明显上调(P<0.05);与模型组相比,针刺组大鼠腓肠肌湿重比(0.52±0.07)、肌纤维截面积比(0.64±0.11)和肌纤维直径比(0.66±0.15)均明显增加(P<0.05),细胞凋亡率(21.39±3.87)%明显下降(P<0.05),Bcl-2(0.61±0.05)、PCNA(0.72±0.08)、p-AKT/AKT(0.82±0.09)和Axin1(0.62±0.06)的表达明显上调(P<0.05),Bax(0.33±0.04)、cleavedcaspase-3(0.34±0.04)和p-AMPK/AMPK(0.51±0.03)的表达明显下调(P<0.05)。结论针刺可能通过调控Axin1/AMPK/AKT的表达,延缓失神经大鼠骨骼肌的萎缩。

运用CRISPR/Cas9技术构建敲除体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因的ACT-1人未分化甲状腺癌细胞系

目的构建体轴抑制蛋白1(AXIN1)基因敲除的ACT-1人未分化甲状腺癌单克隆细胞系。方法用分子克隆技术及成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因编辑技术构建AXIN1基因敲除的单克隆细胞系;采用实时荧光定量PCR检测ACT-1细胞的AXIN1 mRNA水平,Western blot法检测AXIN1蛋白水平。结果通过T7检测成功获得有效的两个单链导向RNA(sgRNA)Cr3及Cr5;通过酶切鉴定及测序成功构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的靶向AXIN1的sgRNA病毒载体;成功获得包括阴性对照在内的4个单克隆ACT-1未分化甲状腺癌细胞系;敲除组细胞AXIN1 mRNA及蛋白水平均明显降低。结论采用CRISPR-Cas9技术成功建立了敲除AXIN1基因的ACT-1未分化甲状腺癌细胞系。

环指蛋白128通过稳定轴抑制蛋白1抑制胃癌发生发展的机制

目的:探讨环指蛋白128(RNF128)通过轴抑制蛋白1(Axin1)抑制胃癌发生发展的具体作用机制。方法:查询Kmplot数据库并分析RNF128表达高低与胃癌患者总生存期、首次进展生存期、无进展生存期的关系;选取胃癌SGC7901细胞系,利用小干扰RNA敲低RNF128蛋白表达水平,分为3组:对照组(Control),siRNF128#1组和siRNF128#2组,通过平板克隆实验、细胞计数试剂盒(CCK-8)实验、Transwell实验检测RNF128对胃癌细胞的增殖、迁移能力的作用。蛋白质印迹法(Western blot)和q-PCR检测RNF128对Wnt通路Axin1蛋白及其下游靶基因表达的作用。免疫共沉淀检测RNF128和Axin1是否存在相互作用。泛素化实验检测RNF128对Axin1蛋白泛素化水平高低的影响。两实验组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。结果:RNF128低表达的胃癌患者OS总生存期、首次进展生存期、无进展生存期低于RNF128高表达患者(P<0.01)。siRNF128#1组和siRNF128#2组胃癌细胞的增殖能力高于对照组(siRNF128#1:6.758±0.321比1.000±0.079,t=16.071,P<0.05;siRNF128#2:7.298±0.398比1.000±0.060,t=14.327,P<0.05),siRNF128#1组和siRNF128#2组胃癌细胞的迁移能力高于对照组(siRNF128#1:164.194±19.480比70.251±3.073,t=10.652,P<0.05;siRNF128#2:178.672±11.323比69.755±5.616,t=19.269,P<0.05)。Western blot结果显示,siRNF128#1组和siRNF128#2组胃癌细胞的Axin1表达水平低于对照组(siRNF128#1:0.526±0.058比1.000±0.110,t=8.519,P<0.05;siRNF128#2:0.464±0.087比1.000±0.117,t=8.196,P<0.05)。Co-IP实验证实RNF128与Axin1蛋白存在相互作用,RNF128可抑制Axin1蛋白的泛素化水平。结论:RNF128通过泛素化稳定Axin1蛋白抑制胃癌的发生发展。