利用酵母双杂交系统筛选与辣椒轻斑驳病毒126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子

【目的】辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMoV)是世界范围内危害辣椒的主要病毒之一。126 kDa蛋白是PMMoV编码的重要致病因子,但致病机制目前仍不清楚。本研究旨在筛选与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子,为解析PMMoV的致病机制提供理论依据。【方法】首先,通过同源重组法构建诱饵载体pGBK-126 kDa;并以辣椒叶片为试验材料,利用Trizol法提取辣椒叶片总RNA,制备辣椒酵母cDNA文库;之后,使用pGBK-126 kDa对cDNA文库进行筛选,并通过NCBI和Uniprot等对筛选结果进行序列比对和生物信息学功能分析,根据比对分析结果,选取可能参与到植物抗病通路的寄主因子,克隆其全长CDS构建到pGADT7载体,酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补(LCI)进一步验证126 kDa与寄主因子之间的互作;最后,通过瞬时过表达寄主蛋白分析其在PMMoV侵染过程中的作用。【结果】提取获得高质量辣椒RNA,无降解;获得高质量酵母cDNA文库,成功构建诱饵质粒pGBK-126 kDa,筛选得到与126 kDa蛋白互作的辣椒寄主因子18个;生物信息学分析结果显示,18个寄主因子广泛参与到植物酶系统、物质及能量代谢调节过程、DNA结合转录过程、激素合成过程以及防御响应等多个通路;选取的其中3个寄主因子(LA2、PDHE1、BXL1)在一对一酵母双杂交互作验证中均存在与126 kDa的相互作用,表明初筛的结果可靠;通过BiFC和LCI进一步验证了126 kDa与BXL1之间体内外互作;瞬时过表达BXL1发现PMMoV的侵染受到了显著抑制。【结论】成功构建了pGBK-126 kDa诱饵质粒,基于该质粒对酵母cDNA文库进行筛选得到18个互作的寄主因子,广泛涉及植物生命活动过程中的多个通路,筛选结果验证可靠,其中,BXL1存在与126 kDa的体内外相互作用,并能够抑制PMMoV的侵染。研究结果可为深入探究PMMoV的侵染机制提供良好的理论和材料基础。

辣椒轻斑驳病毒RT-RAA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立

辣椒是重要的园艺作物,辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)严重威胁辣椒等茄科园艺作物的生产安全。为提高PMMoV的防控效率,根据其编码外壳蛋白(Coat protein,CP)的基因保守序列,基于重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase?aided amplification,RAA),设计了特异性RAA引物,实现对PMMoV的快速等温扩增,并基于CRISPR/Cas12a的设计原则,设计了crRNA靶向RT-RAA扩增产物。优化结果显示,总反应体系在报告基因FQ终浓度为400 nmol/L,Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol/L和1000 nmol/L条件下检测信号最强,最终的RT-RAA反应和CRISPR显色体系分别仅需15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测PMMoV,对携带PMMoV的辣椒样品RNA的检测极限可达到1.34 pg/μL,分别是普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测灵敏度的1000倍和10倍。对实际样品中的检测结果显示,建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测技术可以在PMMoV侵染的辣椒和番茄叶片、果实及土壤中检测到PMMoV,可用于辣椒轻斑驳病毒的快速、灵敏、可视化检测。

贵州辣椒轻斑驳病毒分离物的分子鉴定

为了对贵州辣椒轻斑驳病毒分离物进行分子鉴定,采用生物学方法对ELISA检测为阳性的辣椒轻斑驳病毒贵州分离物(PMMoV-GZ)进行纯化,以RT-PCR技术克隆其外壳蛋白(CP)基因并测序,使用DNAstar和MEGA5.0软件对PMMoV-GZ的CP基因进行同源性分析。结果表明:成功克隆了该病毒分离物的CP基因(474bp),该基因编码157个氨基酸残基;同源性分析显示,该分离物的CP基因及相应的氨基酸序列与11种已报道的PMMoV各地分离物的同源性均在95%以上,而其基因序列与6种同属的其它病毒同源性低于60%。证明该病毒分离物为辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)。

种传辣椒轻斑驳病毒病DAS-ELISA的检测

2003～2004年在北京、宁夏等地分批次从田间采集标样,利用辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)抗体,采用双抗体夹心酶联免疫吸附反应(DAS-ELISA)对采集的标样进行检测,结果表明北京地区被检测的24个标样中,有19个样品为阳性,占79.17%,宁夏的23个样品中检出2个样品为阳性,占8.5%.

青海海东设施辣椒轻斑驳病毒的分子检测

辣(甜)椒分布在全世界60多个国家和地区,是重要的经济作物[1]。由于辣椒栽培面积大且品种多,所以辣椒上病毒的种类多。有报道指出,至少有45种病毒侵染辣椒,其中中国有15种[2],常见的有烟草花叶病毒(TMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、辣椒轻斑驳病毒(PMMo V)等。PMMo V是烟草花叶病毒属(Tobamovirus)的重要成员,受其侵染的辣椒叶片皱缩、斑驳,果实变小、畸形,辣椒的光合作用。

甜椒L3应对辣椒轻斑驳病毒及中椒系列新品种的选育

辣(甜)椒是我国栽培面积最大的蔬菜作物,年播种面积约2.2×106 hm2,其中甜椒约5×105 hm2。生产上传统病害如疫病、病毒病等依然严峻,近年来辣椒轻斑驳病毒(PMMoV,烟草花叶病毒属)等新型流行病害爆发,严重制约甜椒生产;同时,消费者对品种的品质、多样性提出更高要求。笔者课题组先后从国内外引进甜(辣)椒种质资源1400余份,通过鉴定、评价,筛选出具有抗病毒病、白粉病和果大、皮薄、光泽度好、品质优等优良性状的种质资源120余份。构建了与抗TMV(L3、L4)、抗番茄斑点萎蔫病毒TSWV(Tsw)等重要性状紧密连锁的分子标记,辅助育种准确率达90%以上。通过常规育种技术和分子标记相结合,创制出含有抗PMMoV(P0,1,2)L3,且兼具抗TMV、ToMV、PMMoV(P0,1,2)、CMV和疫病,果大、果实均一度高、光泽度好等综合性状优良、配合力高的甜椒骨干亲本‘0516’,以其为骨干亲本,培育出4个新一代优质、多抗、适应不同生态区的新品种‘中椒105号’‘中椒106号’‘中椒107号’‘中椒108号’。上述系列新品种含有L3,抗TMV、PMMoV(P0,1,2),兼抗CMV和疫病;果实形状大小、色泽、整齐度等商品品质,Vc等营养品质显著提高。

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明:该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。

新疆喀什辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒复合侵染的分子鉴定

2018-2019年,在新疆喀什地区调查时发现部分种植的辣椒植株上心叶发黄皱缩、卷曲,个别植株叶片呈现斑驳花叶状。为了明确引起新疆喀什辣椒病毒病的病毒种类,提取典型症状样品的总RNA,反转录得到cDNA,分别用辣椒轻斑驳病毒和黄瓜花叶病毒特异性引物进行RT-PCR检测,CMV和PMMoV特异引物分别扩增得到约735,472 bp的特异条带,阴性对照未扩增目的条带,核苷酸序列比对发现,分别与韩国西葫芦CMV分离物(GU327368.1)和日本辣椒PMMoV分离物(AB276030.1)序列同源性最高为95%,99%,结果表明,喀什地区辣椒疑似病毒病样本被CMV与PMMoV复合侵染。

辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)新疆加工型辣椒分离物的鉴定和致病型分析

为明确侵染新疆南疆巴州加工型辣椒主产区的辣椒轻斑驳病毒（PMMoV）的致病型,利用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和基因克隆、序列分析对南疆巴州加工型辣椒主产区的辣椒病样进行PMMoV的检测及其致病型鉴定。结果表明,从辣椒植株、椒果及种子样品中均检测到PMMoV。通过对预期576 bp大小的3个PMMoV扩增产物进行克隆、测序和序列分析表明,PMMoV新疆加工型辣椒分离物CP基因的核苷酸和氨基酸序列与已报道的PMMoV分离物具有较高同源性,分别为89.0%-99.2%和95.5%-100.0%;其中,与PMMoV以色列分离物EF434393同源性最高,PMMoV新疆各分离物之间CP基因高度同源。依据CP基因序列及系统发育分析将PMMoV新疆加工型辣椒分离物划分为P1,2致病型。

台湾甜椒种子中辣椒轻斑驳病毒检测及其致病型鉴定

利用双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和基因序列分析法对一批台湾进境的辣椒种子进行病毒检测及致病型鉴定,同时使用特征序列扩增区域(SCAR)标记引物利用PCR方法对该辣椒品种进行L抗性基因检测。DAS-ELISA及RT-PCR结果表明,从该批种子中检测到辣椒轻斑驳病毒(Peppe rmild mottle virus,PM MoV)。PCR产物测序分析表明,该序列为PM MoV的外壳蛋白(CP)基因,与已报道的PM MoV序列同源性为92.4%～99.8%。CP蛋白氨基酸序列分析表明,该分离物(命名为TW分离物)属于PM MoV的P1,2,3致病型。抗性基因检测表明,该辣椒品种携带有L3抗性基因。TW分离物能够系统侵染该辣椒品种,意味着该分离物已经克服L3基因介导的抗性。本研究报道的PM MoV的P1,2,3致病型在中国大陆尚属首次,这对于抗病辣椒品种的选育具有重要的指导意义。

辣椒轻斑驳病毒湖南分离物的全基因序列测定及结构分析

采自湖南地区的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)样品经单斑分离后,根据已经报道的PMMoV序列基因保守区设计6对简并引物,采用片段重叠法和RACE方法扩增、克隆获得一个全长为6 356bp的湖南分离物(PMMoV-HN1,登录号:KP345899)全基因组序列,编码4个蛋白,分别为126kD蛋白(70~3 423nt)、183kD蛋白(70~4 908nt)、28kD蛋白(4 909~5 682nt)和17.5kD蛋白(5 685~6 158nt),5′-非编码区(5′-UTR)和3′-非编码区(3′-UTR)分别含有69和198个碱基,其中5′-UTR存在一个序列为m7G5′pppG的甲基化核苷酸帽子结构。一致性分析发现PMMoV-HN1与PMMoV其他分离物的核酸一致性为94%~99%,编码的氨基酸一致性为94%~99%。全基因组序列系统进化分析表明PMMoV-HN1分离物与中国首次报道的PMMoV-CN分离物亲缘关系最近。本研究是国内报道的第二例PMMoV全基因组序列。

一种辣椒轻斑驳病毒和辣椒斑驳病毒复合侵染的线椒病毒病害分子鉴定

上海奉贤区发生的线椒病害其症状表现为斑驳、花叶,且果实扭曲畸形,严重影响了辣椒的产量和品质.通过电镜病毒粒子观察和RT-PCR检测,确定其毒源为辣椒斑驳病毒（pepper mottle virus,PepMoV）和辣椒轻斑驳病毒（pepper mild mottle virus,PMMoV）复合侵染.根据它们的外壳蛋白（coatprotein,CP）核苷酸序列,在GenBank 上进行BLAST 比对,其同源性PepMoV 为85%-99%,PMMoV 为94%-99%.系统进化分析表明,PepMoV和PMMoV上海分离物变异均存在一定的地域相关性.这是首次在我国辣椒田间病毒病样中检测到这两种病毒的复合侵染.

辣椒轻斑驳病毒的分子杂交检测

为探索辣椒轻斑驳病毒(pepper mild mottle virus,PMMo V)的分子杂交技术检测方法,以感病辣椒叶片为试材,用改良CTAB法从辣椒叶片中提取总核酸,运用RT–PCR技术扩增出PMMo V特异片段。以带有PMMo V特异片段的质粒DNA为模板,以用PCR技术制备的地高辛标记PMMo V c DNA探针检测PMMo V。结果表明:1)干燥叶片、新鲜叶片中提取的总核酸稀释80、640倍(相当于12.5、1.60μg叶片)后仍可检测到其中的PMMo V;干燥叶片利于保存及长距离转运,利于对大批量样品进行集中检测;2)采用快速提取法提取叶片总核酸,可从稀释80倍(约12.5μg叶片)的总核酸样品中检测到PMMo V。该技术体系可基本满足常规检测试验的需要。

辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的检测

采用三抗体夹心酶联(TAS-ELISA)法和反转录PCR(RT-RCR)扩增法分别对3份进口的包被种衣剂的辣椒种子进行了辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV)的检测。结果表明,两种方法均表明被检样品携带PMMoV,检测结果比较理想。在此基础上建立了一种快速、灵敏的从辣椒种子中直接检测PMMoV的检测体系,缩短了检测时间,提高了检测效率。

辣椒轻斑驳病毒研究现状

阐述了国内外对辣椒轻斑驳病毒(PMMoV)的研究现状,包括病毒的发生情况、基因组结构、致病相关基因研究进展及病毒检测方法的应用现状。

辣椒种子中辣椒轻斑驳病毒的检测

天津局从来自韩国的辣椒种子中检测到辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,简称PMMoV),并建立了直接从辣椒种子中检测PMMoV的方法,缩短了商品辣椒种子的检验时间,使得检验步骤大幅简化。

辣椒轻斑驳病毒辽宁分离物的鉴定及序列分析

采用鉴别寄主、血清学及RT-PCR检测的方法对采自辽宁省葫芦岛地区的辣椒病毒进行了分离与鉴定,并将克隆得到的病毒CP基因进行测序及同源性比较.结果表明：该病毒分离物可侵染辣椒（Capsicum frutescens）产生局部枯斑、系统斑驳或花叶;局部侵染普通烟（Nicotiana tabacum）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、三生烟（Nicotiana tabacum. var. samsun）、矮牵牛（Petuniahybrida）产生坏死枯斑,在曼陀罗（Datura stramonium）、洋酸浆（Physalis pubescens）和苋色藜（Chenopodium amaranticolor）上引起褪绿斑;不能侵染番茄（Lycopersicon esculentum）、葫芦（Lagenaria siceraria）、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）、千日红（Gomphrena globosa）、白菜（Brassica pekinensis）、百日草（Zinnia elegans）、蚕豆（Vicia faba）和玉米（Zea mays）.辣椒病叶、病果和种子及表现症状的鉴别寄主叶片经DAS-ELISA检测均证实存在辣椒轻斑驳病毒（Pepper mild mottle virus, PMMoV）.通过RTPCR技术成功克隆获得该病毒CP基因,测序并分析其同源性表明,该分离物与GenBank 上已报道的13 个国内外PMMoV分离物同源性很高,核苷酸和氨基酸同源性均为94%-100%.将该分离物与其他13 个PMMoV分离物的CP基因序列一起构建系统发育进化树分析表明,该分离物与各亚洲分离物亲缘关系密切,并与国内各分离物可能具有相同的进化祖先.综上所述,辽宁辣椒上发现的病毒可鉴定为辣椒轻斑驳病毒辽宁分离物（PMMoV-LN）,此为辽宁辣椒生产区首次报道.由于PMMoV 具有典型的种传特性,而我国目前尚未将其列为检疫对象,这将促进病毒的快速扩展蔓延,因此应重视该病毒的危害性及对我国辣椒生产的潜在威胁,并加强其抗病育种和检验检疫工作以达到对PMMoV防控的目的.

辣椒轻斑驳病毒凤城分离物的鉴定、全基因测序及系统进化分析

辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)属于烟草花叶病毒属,是辣椒上重要的病原病毒之一,近年来PMMoV对辽宁部分辣椒产区造成严重危害。本文采用DAS-ELISA检测以及RT-PCR的方法首次从辽宁省凤城市蔬菜产区辣椒病叶中检测出PMMoV,暂命名为PMMoV-FC。设计3对特异性引物对其进行扩增并测序后得到该病毒分离物全基因序列。将PMMoV-FC的全基因序列与已报道的国内外9个PMMoV分离物进行同源性分析,结果表明,其同源性介于94.3%~99.7%之间。基于全基因序列的系统发育进化分析表明,PMMoV-FC与国内分离物、日本分离物以及美洲分离物亲缘关系密切,而与韩国和西班牙分离物亲缘关系稍远。鉴于该病毒在辣椒上造成的严重危害,对于PMMoV-FC在辽宁地区的发生以及防治仍需进行更为详细的研究。

我国部分地区鲜食辣椒及其加工品中辣椒轻斑驳病毒的调查

本研究利用RT-PCR技术对我国部分地区鲜食辣椒和辣椒加工品中的辣椒轻斑驳病毒Pepper mild mottle virus(PMMoV)进行了调查。其中,鲜食辣椒样品(249份)中PMMoV检出率为75.5%;147份辣椒加工品中有97份检测到PMMoV,且所采集的每一类别的辣椒制品中都有阳性样品。调查结果表明:PMMoV不仅广泛分布于我国辣椒种植区,而且在多种辣椒加工品中的检出率也较高。该研究进一步明确了PMMoV的来源及可能的传播途径,为该病毒的防控提供了理论依据。

江苏大豆上分离的豇豆轻斑驳病毒基因组序列克隆及特征分析

为明确豇豆轻斑驳病毒江苏分离物的基因组结构特征,阐明其分类地位及进化特点,选择采自江苏的CpMMV大豆分离物作为研究对象,针对病毒基因组序列设计了4对特异性引物,以病样总RNA反转录后获得的cDNA为模板,通过分段法对其基因组序列片段进行了PCR扩增,扩增产物克隆至T载体经验证后进行序列测定,获得的序列片段经拼接组装得到病毒全基因组序列。序列分析结果显示,CpMMV江苏分离物基因组核苷酸序列全长8194 bp,编码6个蛋白,5′端和3′端各含有一个非编码区(UTR),长度分别为72,117 nt;在编码的6个蛋白中,CP与其他分离物之间的同源性较高(96.5%~100.0%),相对保守;而RdRp(81.1%~98.2%)、TGB1(81.0%~97.0%)、TGB3(80.9%~95.6%)同源性相对较低,在不同分离物中表现较好的多样性;基于全基因组序列的系统进化分析结果显示,江苏分离物与已公开的其他CpMMV分离物同源性较高,共同聚类到一个大分支上,其中与中国安徽分离物同源性最高(98.2%),与海南分离物次之(96.0%),而与美国、巴西、印度、墨西哥、肯尼亚等国外分离物同源性相对较低(<82.7%)。这些研究结果表明,CpMMV江苏分离物与其他CpMMV分离物具有类似的基因组结构特征,在系统进化上,江苏分离物与国内分离物近缘而与国外分离物远缘。