基于mTOR/Beclin1/LC3信号轴探讨制萎扶胃丸对胃癌前病变大鼠胃窦组织自噬的影响

目的:探讨制萎扶胃丸(ZWFW)对胃癌前病变(PLGC)大鼠胃窦组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1)/微管相关蛋白1轻链3(LC3)信号轴关键分子表达的影响。方法:SPF级SD大鼠随机分为正常组,模型组,叶酸组,ZWFW低、中、高剂量组,除正常组常规饲养外,模型组、叶酸组、ZWFW低、中、高剂量组,采用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)联合饥饱失常、乙醇灌胃、氨水自由饮用以及雷尼替丁饲料喂养五因素复合造模法建立PLGC大鼠模型后,分别用生理盐水、叶酸片水溶液(0.002 g/kg)、ZWFW低、中、高剂量水溶液(0.42,0.84,1.67 g/kg)予以治疗4周后剖腹取胃。采用苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠胃窦组织病理学变化,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)、蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫组化检测大鼠胃窦组织mTOR、Beclin1、微管相关蛋白1轻链3β(LC3B)的mRNA及蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠胃窦组织胀大,胃壁变薄,胃黏膜色泽苍白,皱襞萎缩浅平,走行紊乱,可见结节及赘生物;HE染色示:与正常组比较,模型组胃黏膜腺体排列拥挤、紊乱,细胞形态不一,可见大量杯状细胞,细胞浆嗜碱性,细胞核大、深染、不规则,黏膜肌层浸润破坏;与模型组比较,ZWFW显著改善了胃黏膜腺体结构排列紊乱和细胞异型性等病理表现。与正常组比较,模型组大鼠胃窦组织m TOR mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05),Beclin1和LC3B mRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05);与模型组比较,ZWFW中、高剂量组胃窦组织mTOR mRNA和蛋白表达降低(P<0.05),ZWFW低剂量组胃窦组织Beclin1、LC3B蛋白表达升高(P<0.05),中、高剂量组胃窦组织Beclin1、LC3B mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。结论:ZWFW可显著改善PLGC模型大鼠胃黏膜异常组织病理学表现,其机制可能与下调mTOR表达,上调Beclin1、LC3B表达进而促进自噬相关。

类风湿性关节炎患者外周血单个核细胞微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达增强且与病情相关

目的检测类风湿性关节炎(RA)患者外周血单个核细胞(PBMC)中自噬标志性分子微管相关蛋白1轻链3(LC3)的mRNA及蛋白表达,探讨其与RA发病的关系。方法募集22例RA患者,同期纳入性别、年龄匹配的16例健康体检者为正常对照组。采用密度梯度离心法分离PBMC;采用实时荧光定量PCR检测PBMC中LC3在mRNA水平,Western blot法检测PBMC中LC3蛋白水平,采用免疫荧光细胞化学染色检测PBMC中LC3蛋白表达;采用Pearson方法分析LC3表达与RA患者临床指标的相关性。结果与正常对照组相比,RA患者组PBMC中LC3 mRNA和蛋白水平明显增加,PBMC中LC3表达明显增强,RA患者PBMC中LC3 mRNA水平与血沉(ESR)、28关节疾病活动度评分(DAS28)、C反应蛋白(CRP)、类风湿因子(RF)均呈明显正相关(r依次为0.7480、0.5016、0.6518、0.7232)。结论RA患者LC3表达上调,且与ESR、DAS28、CRP、RF相关。

自噬相关基因LC3和ATG5在胃癌中的表达及临床意义

目的探讨自噬相关基因微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和自噬相关基因-5(autophagy related gene-5,ATG5)在胃癌细胞发生发展不同阶段的表达情况并分析其临床意义。方法选取胃黏膜正常细胞、胃黏膜不典型增生细胞、胃癌细胞共58例,分别记为正常组(17例)、不典型组(19例)、胃癌组(22例),采用qRT-PCR、Western Blot、免疫组织化学法检测每组中自噬相关基因LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达水平,应用SPSS 23.0软件分析正常组、不典型组、胃癌组3组间LC3和ATG5的mRNA及蛋白表达情况,并分析LC3和ATG5蛋白表达的相关性以及LC3和ATG5蛋白表达与胃癌患者临床病理学参数的关系。结果正常组、不典型组、胃癌组中LC3和ATG5 mRNA及蛋白表达水平逐渐升高,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。LC3蛋白表达情况与性别、年龄、浸润深度、分化程度及淋巴结状态均不存在相关性。ATG5蛋白表达情况与浸润深度、分化程度及淋巴结状态均有相关性。LC3和ATG5蛋白在3组中均呈正相关(P<0.05)。结论细胞自噬可促进胃癌的发生发展,其机制可能与LC3、ATG5过度表达有关。LC3、ATG5在促进胃癌的发生发展中起相互协同的作用。

黄芩素抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路并诱导MGC-803细胞自噬

目的研究黄芩素(BAI)对胃癌细胞系MGC-803细胞自噬的影响。方法使用(0、 5、 15、 25、 50)μmol/L BAI处理胃癌MGC-803细胞24、 48、 72 h,噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性,吖啶橙(AO)染色结合免疫荧光细胞化学染色观察微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62的表达确定MGC-803细胞的自噬情况, Western blot法检测细胞LC3、 P62、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、 p-AKT的蛋白水平。结果与对照组相比, BAI可显著抑制MGC-803细胞的增殖,并呈时间和剂量依赖性;BAI处理的MGC-803细胞内酸性溶酶体显著增加, LC3表达增强;BAI处理后可显著降低PI3K和AKT蛋白的磷酸化, LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加、上调P62蛋白的表达。结论黄芩素抑制PI3K/AKT信号通路诱导MGC-803细胞发生自噬。

芪玉三龙汤调节Beclin1,Atg5,LC3B表达以抑制肺癌肿瘤生长机制

目的:研究芪玉三龙汤对肺癌小鼠皮下移植瘤生长及对自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),自噬相关基因5(autophagy related genes,Atg5)及微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1light chain3,LC3B)表达的影响。方法:采用Lewis肺癌细胞(lewis lung cancer cell,LLC)构建肺癌移植瘤小鼠模型,造模成功后随机分为模型组、芪玉三龙汤组、顺铂组及联合组,每组18只移植瘤小鼠。模型组每日按照生理盐水20 mL·kg^-1灌胃;芪玉三龙汤组每日按照80.48 g·kg^-1灌胃;顺铂组在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液(DDP)0.4 mL;联合组每日按80.48 g·kg^-1灌胃给药,并分别在第1,3,5天腹腔注射顺铂溶液0.4 mL;连续治疗21 d剥离瘤组织,称取瘤重,计算抑瘤率。苏木素-伊红(HE)染色观察肿瘤组织形态学改变。免疫组化检测肿瘤组织中Beclin1,LC3B蛋白表达和定位。蛋白免疫印迹法(Western blot)测定Beclin1,Atg5,微管相关蛋白1轻链3-I(LC3B-Ⅰ)及微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)蛋白表达,并计算LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤组织Beclin1,Atg5 mRNA转录水平。结果:芪玉三龙汤具有温和的移植瘤抑制作用,抑瘤率为31.2%;镜下观察芪玉三龙汤组肿瘤组织可见片状坏死的肿瘤细胞;免疫组化及Western blot实验表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够上调Beclin1,Atg5,LC3B蛋白的表达(P<0.01),并且能促进LC3B-Ⅰ转化为LC3B-Ⅱ;Real-time PCR结果表明,与模型组比较,芪玉三龙汤能够促进Beclin1,Atg5 mRNA的转录(P<0.01)。结论:芪玉三龙汤对肺肿瘤生长具有温和地抑制作用,其作用机制可能与上调自噬关键分子Beclin1,Atg5,LC3B表达,促进LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ转化有关。

细胞自噬在激素性股骨头缺血坏死大鼠发病中的作用

目的 探索细胞自噬在激素性股骨头缺血坏死(SANFH)大鼠发病机制中的作用。方法 24只无特定病原体(SPF级)SD大鼠(雄鼠各半),随机抽样分为:正常(C)组、模型(T1)组、自噬阻断(T2)组、自噬激动(T3)组,每组雌、雄各3只。C组给予生理盐水,T1、T2、T3组分别给予甲泼尼龙、甲泼尼龙+3-甲基腺嘌呤(MA)、甲泼尼龙+雷帕霉素。8 w后处死,取后肢股骨头并测量坏死面积,采用免疫组化、Western印迹检测坏死股骨头组织中微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、自噬效应蛋白(Beclin)1及p62蛋白的表达情况。结果 T1、T2、T3组经甲泼尼龙干预8 w后,至少一侧股骨头坏死率分别为83.33%、16.67%、100.00%,T1、T2、T3组与C组比较均具有统计学差异(均P<0.05),且T1组、T3组股骨头坏死面积均显著大于C组和T2组(均P<0.05)。免疫组化染色和Western印迹检测LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、p62蛋白结果显示,T1、T3组股骨头组织中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的表达量显著高于C组、T2组(均P<0.05),但p62在C组、T2组中表达量明显较低(均P<0.05)。结论 短期、大剂量激素能诱导股骨头发生坏死,其作用机制可能与激素诱发骨组织细胞自噬活性增强,进而导致细胞出现过度自噬性死亡有关。

芪玉三龙汤调节mTOR/Beclin1/LC3信号轴相关分子的表达诱导肺癌A549细胞自噬

目的:从细胞水平探讨芪玉三龙汤干预肺癌A549细胞对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1)/微管相关蛋白1轻链3(LC3)信号轴关键分子表达的影响。方法:选择肺癌人A549细胞作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)法检测芪玉三龙汤含药血清对A549细胞活性的影响;原位末端标记法(TUNEL),透射电镜(TEM)及实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(WB)分别检测芪玉三龙汤对A549细胞凋亡、自噬体形成及自噬标记分子表达的影响。结果:芪玉三龙汤血清能以浓度依赖性的方式抑制细胞活性;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的凋亡数量显著增多(P<0.01),自噬体形成增加;与空白血清组比较,芪玉三龙汤血清组A549细胞的mTOR mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.01),Beclin1,自噬相关基因5(Atg5),自噬相关基因13(Atg13)mRNA和蛋白表达水平均显著升高(P<0.01)。结论:芪玉三龙汤能够诱导肺癌A549细胞发生自噬,其具体作用机制可能与其下调mTOR的表达,上调Beclin1,Atg5,Atg13,LC3的表达,促进LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ有关。

当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠自噬蛋白LC3,Beclin1,p62表达的影响

目的:研究当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠的防治作用及对自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3),自噬关键分子酵母Atg6同系物(Beclin1),p62表达的影响。方法:将6周龄SD雄性大鼠随机分为正常组,风湿热痹模型组,当归拈痛汤低、中、高剂量组(5.67,11.34,22.68 g·kg^(-1)),甲氨蝶呤(MTX)组(1.35 mg·kg^(-1)),每组10只,通过对大鼠尾根部皮下注射灭活结核分支杆菌佐剂建立佐剂性关节炎大鼠模型,用人工气候箱进行风湿热痹证模型造模16 d,于免疫当天灌胃给药,持续28 d。进行大鼠一般情况观察及足趾肿胀度、关节炎指数(AI)检测,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠膝关节滑膜组织病理形态学改变,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠滑膜组织LC3,Beclin1,p62的mRNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)及免疫组化法分别检测大鼠滑膜组织LC3,Beclin1,p62的蛋白表达。结果:与正常组比较,风湿热痹模型组大鼠给药16,20,24,28 d时足趾肿胀度显著升高(P<0.01),AI显著升高(P<0.01),滑膜细胞增生显著,自噬蛋白LC3,Beclin1蛋白及mRNA表达显著上调(P<0.01),p62蛋白及mRNA表达显著下调(P<0.01);与风湿热痹模型组比较,各给药组大鼠足趾肿胀度减轻,滑膜增生情况有不同程度改善,LC3,Beclin1的mRNA和蛋白表达水平显著降低(P<0.01),p62的mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05,P<0.01),且当归拈痛汤中剂量组防治效果最佳。结论:当归拈痛汤对风湿热痹型佐剂性关节炎大鼠有明显的防治作用,且这种防治作用可能与调控滑膜组织中自噬相关因子LC3,Beclin1,p62的表达,抑制自噬有关。

脂多糖诱导脓毒症小鼠心肌细胞及线粒体自噬

目的探讨脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平的变化。方法雄性C57BL/J小鼠随机分为空白对照组(NC)、LPS处理6、12、24、36 h组。LPS处理组小鼠腹腔注射10 mg/kg LPS建立脓毒症模型,空白对照组注射等量生理盐水。分别于以上时间点处死小鼠,收集血液及心脏组织,提取心肌组织胞质蛋白、线粒体及线粒体蛋白,另取心肌组织进行冰冻切片;应用ELISA试剂盒测定血清心肌肌钙蛋白I(c Tn I)含量变化;JC-1染色结合荧光酶标仪检测LPS刺激后不同时间点线粒体膜电位变化;Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)、PTEN诱导激酶1(pink1)、E3泛素连接酶帕金森病蛋白(parkin)水平;免疫荧光组织化学染色检测心肌组织LC3、pink1/parkin蛋白的定位及其在不同处理组的表达差异。结果与对照组相比,LPS诱导的脓毒症小鼠血清c Tn I在6 h即开始明显升高;LPS处理组线粒体膜电位下降,在LPS 12 h组最低;细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在腹腔注射LPS 12 h明显升高,然后逐渐下降;pink1/parkin在腹腔注射LPS 6 h明显升高,然后逐渐下降。结论脓毒症心肌损伤时心肌细胞及线粒体自噬水平升高,自噬应激可能更早发于心肌线粒体。

结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)抑制小鼠巨噬细胞自噬

目的研究结核分枝杆菌分泌性酸性磷酸酶(Sap M)对小鼠巨噬细胞自噬的影响。方法分别用Sap M、渥曼青霉素、饥饿处理GFP-LC3-Raw264.7细胞。荧光显微镜下观察自噬体的形成,Western blot法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)Ⅱ水平;再用Sap M处理GFP-LC3-Raw264.7细胞后加氯喹,Western blot法检测LC3Ⅱ水平。结果 Sap M和饥饿均导致GFP-LC3斑点增多和LC3Ⅱ水平增高,在Sap M处理的细胞中加入氯喹并没有引起LC3Ⅱ的进一步升高。结论 Sap M可阻断自噬体与溶酶体的融合,从而抑制小鼠巨噬细胞自噬。

四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎大鼠的实验研究

目的:通过膝骨关节炎大鼠模型研究四妙散调节软骨细胞凋亡与自噬治疗膝骨关节炎(KOA)大鼠的作用机制。方法:8周龄SD大鼠27只,随机分为正常对照组、KOA模型组、四妙散组,KOA模型组和四妙散组采用前交叉韧带切除法制作KOA模型,手术6周后四妙散组以四妙散药液灌胃,正常对照组和KOA模型组以生理盐水灌胃。连续灌胃4周后取膝关节软骨组织,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定凋亡细胞所占比例,采用荧光定量PCR检测关节软骨组织中凋亡和自噬相关基因表达水平。结果:与正常对照组比较,KOA模型组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著升高,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著升高,自噬相关蛋白LC3的表达显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与KOA模型组比较,四妙散组大鼠关节软骨细胞凋亡率显著降低,关节软骨细胞中凋亡相关蛋白Fadd、Casp3的表达显著降低,自噬相关蛋白LC3的表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:软骨细胞凋亡是KOA发病中的重要因素,该凋亡可能通过FADD-CASP3途径发挥作用。软骨细胞自噬作用的激活可抑制细胞凋亡,可能是延缓及控制KOA进展的一个新机制,四妙散可能通过该机制发挥治疗作用。

自噬相关蛋白在2型糖尿病大鼠胰腺组织中的变化

目的通过动物实验探讨细胞自噬与糖尿病的可能相关性。方法将6只SPF级雄性SD大鼠适应性喂养3 d,随机分成正常组和模型组;正常组喂以常规饲料,模型组给予高糖高脂饲料,喂养4周;4周后隔夜空腹给予模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30 mg/kg,1周后再次腹腔注射30 mg/kg,正常组注射相应体积的生理盐水。模型组STZ注射4周后大鼠禁食,剪尾取血,测量空腹血糖(FBG),FBG>7.8 mmol/L为糖尿病诊断标准。模型构建成功后处死正常组和模型组,取胰腺组织采用蛋白免疫印迹法检测自噬基因微管相关蛋白1轻链3(LC3)、自噬相关蛋白7(Atg7)和自噬相关蛋白Beclin-1和P62蛋白(sequestosome-1蛋白)表达水平,采用免疫组织化学法检测LC3和Beclin-1蛋白表达量。结果与正常组相比,WB法检测提示模型组大鼠胰腺组织LC3、Atg7和Beclin-1表达量增加(t=-39.984,-39.049,-59.157,P均<0.01),P62蛋白表达水平较正常组明显降低(t=90.466,P<0.01),免疫组织化学法检测提示LC3和Beclin-1蛋白表达量均增加(t=14.561,7.342,P均<0.01)。结论细胞自噬功能的紊乱可能导致糖尿病的发生。

成纤维细胞的自噬性溶解死亡在增生性瘢痕消退过程中的作用

目的·探索增生性瘢痕消退成熟过程中,成纤维细胞是否发生自噬性溶解死亡。方法·收集上海交通大学医学院附属瑞金医院烧伤科2018年6月—2019年6月烧伤患者16例的瘢痕组织,分为增生组(对照组,8例)和消退组(试验组,8例) 2组。采用透射电镜观察细胞组织内的自噬情况。体外分别培养2组患者的成纤维细胞。建立缺氧模型,分别于12、24、48 h时点收集细胞,采用透射电镜观察成纤维细胞的自噬情况。Calcein/PI荧光染料试剂盒检测活/死细胞的数量。免疫荧光显微镜下观察细胞的自噬和凋亡。流式细胞仪检测细胞凋亡和自噬性溶解死亡的数量。Western blotting观察低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor 1,HIF-1)、自噬蛋白区域衍生肽beclin-1、微管相关蛋白轻链-3 (microtuble-associated protein light chain 3,LC3)、半胱氨酸蛋白酶-3 (caspase-3)、半胱氨酸蛋白酶-9的表达变化。2组间定量资料采用Student’s t检验,多组间定量资料的分析使用One-way ANOVA检验。结果·电镜显示增生性瘢痕中存在自噬小体,退行性瘢痕中存在自噬性溶解死亡。体外培养细胞电镜观察结果与体内细胞的结果一致。死亡细胞在24 h显著增加,在48 h进一步增加。其中,细胞死亡类型主要为自噬性溶解死亡,少量凋亡。这与LC3的高表达有关。结论·增生性瘢痕演变过程中,除了细胞凋亡以外,自噬性溶解死亡可能是引起瘢痕消退成熟的主要方式,其中LC3作用明显。

5-氟尿嘧啶在体外对卵巢癌细胞SKOV3自噬过程的诱导作用

目的:探讨化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)对卵巢癌细胞SKOV3自噬的诱导作用及其机制。方法:应用吖啶橙染色、间接免疫荧光技术观察50μmol/L5-FU处理48 h对卵巢癌细胞SKOV3自噬过程的影响;并通过Western blotting检测5-FU对SKOV3细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)和自噬相关蛋白Beclin1表达水平的影响。结果:5-FU作用后SKOV3细胞产生明显的酸性区域,LC3定位的荧光亮点增多,细胞内Beclin1和LC3蛋白表达量也显著增加。结论:5-FU可能通过增加SKOV3细胞酸性区域的数量、促进细胞内Beclin1、LC3蛋白表达而诱导SKOV3细胞自噬。

颅脑创伤后自噬表达的变化及bFGF保护作用的研究

目的探索颅脑创伤后神经细胞自噬表达的变化及碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)的保护作用,为临床治疗脑外伤提供实验依据。方法用雷帕霉素制作体外神经细胞自噬模型,观察在体外培养神经细胞中b FGF对自噬表达的影响。将150只健康成年雄性SD大鼠随机分为3组(假手术组、颅脑创伤组、b FGF治疗组),每组50只。精密颅脑损伤撞击器制作大鼠创伤性脑损伤模型,假手术组暴露硬脑膜而不撞击,b FGF治疗组于建模后10分钟由右侧侧脑室注入b FGF,而假手术组和创伤组在建模后10分钟由右侧侧脑室注入等量的生理盐水。应用大鼠行为学评分观察大鼠脑损伤后神经功能的变化;用干湿法测脑组织含水量;用免疫荧光显微镜观察神经细胞自噬表达的变化。结果在体外培养细胞中,b FGF组能明显抑制雷帕霉素引起的LC3-Ⅱ表达增高(P<0.05)。与假手术组相比,颅脑创伤组大鼠和b FGF治疗组的行为学评分明显降低(P<0.05),但b FGF治疗组的评分恢复快于颅脑创伤组(P<0.05)。b FGF治疗组脑组织的含水量明显小于颅脑创伤组(P<0.05)。与假手术组相比相比,颅脑创伤组和b FGF治疗组伤后LC3-Ⅱ蛋白表达均明显提高(P<0.05);与颅脑创伤组相比,b FGF治疗组LC3-Ⅱ的上调被明显抑制(P<0.05)。结论 b FGF能明显抑制颅脑创伤后过度的自噬反应,减轻脑水肿,并改善大鼠神经功能。

巴弗洛霉素A1抑制卵巢癌细胞SKOV3自噬并增强化疗敏感性的作用机制

目的:研究巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1)对5-氟尿嘧啶(5-FU)作用下的卵巢癌细胞SKOV3自噬的抑制作用及其增强化疗敏感性的可能机制。方法:将SKOV3细胞随机分为3组,A组:50μmol/L5-氟尿嘧啶(5-FU)处理48h;B组:100nmol/L巴弗洛霉素A1给药1h后加入50μmol/L5-FU处理48 h;C组(阴性对照):不作任何处理。3组细胞均应用吖啶橙染色、间接免疫荧光技术检测卵巢癌细胞SKOV3自噬形态学变化;并通过Western blotting检测巴弗洛霉素A1对SKOV3细胞中微管相关蛋白轻链3(LC3)及自噬相关蛋白Beclin1表达的影响。结果:B组产生的红色酸性区域明显减少,LC3定位的荧光亮度减弱,细胞内LC3、Beclin1蛋白表达量显著降低。结论:巴弗洛霉素A1可能通过减少SKOV3细胞酸性区域的数量,抑制LC3产生从而抑制SKOV3细胞的自噬。

黄芪多糖抑制黄嘌呤氧化酶诱导的肺癌A549细胞自噬并调节自噬相关蛋白的表达

目的探讨黄芪多糖(APS)对黄嘌呤氧化酶(XOD)诱导的肺癌A549细胞的自噬作用及微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、beclin1蛋白表达的影响。方法 A549细胞分为对照组、模型组、100μg/mL APS处理组、200μg/mL APS处理组及400μg/mL APS处理组,除对照组,其余4组均需XOD诱导24 h建立自噬模型。采用透射电镜观察自噬体的形态、单丹磺酰尸胺(MDC)染色荧光显微镜观察自噬体数量的变化, Western blot法检测LC3B、mTOR、beclin1蛋白水平。结果与空白组比较,模型组细胞自噬体数量增多,且LC3B、beclin1蛋白水平升高, mTOR蛋白水平降低;与模型组比较,(200、400)μg/mL APS处理组细胞自噬体数量显著减少, LC3B、beclin1蛋白水平降低, mTOR蛋白水平升高。结论 APS可降低XOD诱导的A549肺癌细胞自噬水平,并降低LC3B、beclin1蛋白表达、增加mTOR蛋白表达。

乌司他丁对大鼠肢体缺血再灌注急性肺损伤细胞自噬的影响

目的探讨乌司他丁对大鼠双下肢缺血再灌注导致急性肺损伤肺组织细胞自噬的保护效应。方法采用LIR模型，72只雄性sD大鼠随机数字表法随机分为假手术＋生理盐水组（s0＋Ns组），肢体缺m再灌注＋生理盐水组（I／R＋NS组），肢体缺咀再灌注＋乌司他丁组（I／R＋UTI组），每组再分4亚组，即肢体缺血3h再分别灌注0、2、4、8h，每亚组各6只。夹闭股动脉前10rain于大鼠左侧颈内静脉分别注射NS或UTI5×10^4U／kg各1mL，于再灌注各时点末采用免疫荧光法检测肺组织病理变化，利用反转录聚合酶链式反应法（RT—PCR）检测各组肺组织Beclinl和Atg5mRNA表达及蛋白印迹分析（Westernblot）技术检测微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达。结果免疫荧光染色I／R＋NS组不同时点镜下可见肺组织结构紊乱，肺泡间隔增厚甚至实变，而sO＋Ns及I／R＋UTI两组上述病理现象减轻；采用2^-△△CT。法分析肺组织Beclinl和Atg5mRNA相对表达量I／R＋NS组4、8h时点明显增高（P〈0．01或P〈0．05），与SO＋NS组各相同时点比较均明显增高（P〈0．01或P〈0．05），I／R＋UTI组与I／R＋NS组比较4h时点降低最明显（P〈0．01）；Westernblot法检测LC3-Ⅱ蛋白含量及LC3-Ⅱ／GAPDH比值，I／R＋NS组4、8h时点明显增高（P〈0．01），与SO＋NS组各相同时点比较均明显增高（P〈0．01），I／R＋UTI组与I／R＋NS组各相同时点比较明显降低（P〈0．01）。结论乌司他丁可下调大鼠LIR—ALI肺组织细胞自噬的过表达，具有良好的保护作用。

山羊睾丸支持细胞的培养与双荧光自噬报告载体的建立

[目的]本试验旨在建立一个实时追踪山羊细胞自噬发生状况的工具,以探讨细胞自噬对睾丸支持细胞(SC)和生殖细胞的影响。[方法]通过PCR法扩增mCherry-EGFP-LC3基因序列1 884 bp,将其导入真核表达载体pEX-3中,得到重组质粒pmCherry-EGFP-LC3;将pmCherry-EGFP-LC3及对照质粒p EX-3分别转染体外分离培养的山羊SC,饥饿处理12 h后用荧光显微镜观察融合蛋白在细胞中的表达,用RT-qPCR和Western blot检测细胞中自噬相关基因和蛋白表达变化,用透射电镜观察细胞自噬体的形成。[结果]成功构建了双荧光自噬报告载体,该载体能在山羊SC中表达,荧光显微镜下可见绿色荧光和红色荧光表达;饥饿处理后,该载体可以指示细胞中自噬泡的形成过程,且细胞自噬相关标记Beclin1 mRNA以及LC3Ⅱ/LC3ⅠmRNA比值和蛋白水平均显著上调,并能观察到初始自噬体的形成。[结论]获得的山羊SC可以作为后续试验的细胞模型;构建的双荧光pmCherry-EGFP-LC3自噬报告载体可为进一步研究山羊SC的自噬发生提供有效的工具。

细胞自噬的研究方法进展

自噬是真核生物细胞内普遍存在的一种生物学现象,它主要通过将细胞自身的部分物质包裹并与溶酶体融合降解来为其生存提供物质和能量,以维持细胞稳态。细胞自噬的研究方法较多,如采用免疫荧光染色、流式细胞术和免疫印迹等免疫学方法检测微管相关蛋白1轻链3(LC3)和P62等蛋白含量变化和LC3-I到LC3-Ⅱ的蛋白转变,但最经典的方法还是采用透射电子显微镜分析各级自噬结构。任何单一的方法均难以准确有效地反映细胞的真实自噬状态,结合多种方法才能阐明细胞自噬的过程及机制。因此,我们将现有的自噬研究方法进行总结,以期为自噬研究提供参考。