Pseudomonas mosselii E1铁载体合成相关基因cysI的克隆与功能初步分析

从棉花根际分离的铁载体产生菌E1,其16SrDNA与Pseudomonas mosselii ATCCBAA-99的同源性为100%。采用三亲本杂交方法将携带转座子Tn5-1063的质粒pRL1063a导入E1中进行转座子插入诱变。利用CAS法,从1000个突变株中,筛选到一株铁载体合成缺失突变株E1-185。利用TAIL-PCR方法,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到E1的cysI基因内。该基因与Pseudomonas entomophila L48的cysI同源性为96%,其CysI氨基酸序列相似性为97%。该基因与半胱氨酸的合成密切相关,而在加有半胱氨酸的CAS平板上,突变株恢复了铁载体产生能力,证明cysI在E1铁载体合成过程中具有重要作用。据推测,cysI可能与铁载体合成途径中关键蛋白acyl-S-PCPs的形成有关。

疏水载体辅助液相法与固相法合成芋螺毒素的工艺对比

目的对芋螺毒素μ-CnIIIC的三种二硫键异构体进行合成工艺研究及表征鉴定。方法通过可溶性疏水载体辅助液相合成法(LPPS)和固相多肽合成法(SPPS)人工合成μ-CnIIIC的三种二硫键异构体的线性肽,采用三步氧化法对线性肽进行氧化折叠,获得三种折叠肽异构体(μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ和μ-CnIIIC-Ⅲ),并对两种合成工艺进行物料消耗量、“三废”产生量、收率进行对比。结果成功合成芋螺毒素异构体并进行了质谱表征;采用SPPS法和LPPS法合成μ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ平均收率为15.64%、13.27%、10.56%和18.45%、17.62%、15.37%;采用SPPS法和LPPS法合成1 gμ-CnIIIC-Ⅰ、μ-CnIIIC-Ⅱ、μ-CnIIIC-Ⅲ物料平均消耗量为20.65、21.62、24.78 g和61.19、72.17、90.75 g,平均废液产生量分别为1.49、1.57、1.78 L和12.72、15.00、19.16 L。SPPS法和LPPS法比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论通过对芋螺毒素μ-CnIIIC异构体的合成研究,表明LPPS法的总体收率比SPPS法收率高且物料消耗量及“三废”产生量少,因此LPPS法具有重大的研究意义和商业价值。

Pseudomonas pseudoalcaligenes B50铁载体合成相关基因pyrD的克隆与功能分析

从棉花根际分离的一株细菌B50在低铁条件下可以产生铁载体。通过形态学特征、生理生化特征及其16SrDNA序列分析,将其鉴定为Pseudomonas pseudoalcaligenes。采用三亲本杂交的方法将转座子Tn5-1063a(含luxAB)导入B50中,进行转座子插入诱变,获得突变株。用TAIL-PCR方法得到与铁吸收有关的pyrD基因序列。通过互补实验验证pyrD与铁载体的合成有关。Pseudomonas pseudoalcaligenes能够产生铁载体属于首次报道。

合成有机载体固定化猪胰脂肪酶性质研究

以丙烯酸(AA)为单体,N,N′-亚甲基双丙烯酰胺(MBAA)为交联剂,w(乙醇)=95%为致孔剂反相悬浮聚合得到白色珠状聚合物载体材料,通过N-羟基丁二酰亚胺(NHS)在二环己基碳二亚胺(DCC)作用下脱水得到含酯基活化载体,从而在温和条件下以共价法固定化猪胰脂肪酶.研究得到固定化酶的最佳条件是200 r/min,40℃固定1 h.比较自由酶和固定化酶的最适温度和pH值,自由酶的最适温度为35℃,固定化酶的最适温度为40℃,提高了5℃;自由酶的最适pH值为8.5,固定化酶的最适pH值为9.5,提高了1个pH单位.连续使用5次固定化酶,仍具有75.7%的相对活力,4℃冰箱中贮存2个月活力未见明显下降,具有一定的工业应用价值.

酿酒酵母表达和纯化功能性的铁载体合成蛋白PchE

【目的】利用酿酒酵母表达系统,通过乙醇脱氢酶启动子异源表达细菌源的铁载体合成蛋白PchE,并与来源于枯草芽孢杆菌的泛酰化酶Sfp同宿主共表达,探索真核表达体系表达具有生化活性的细菌源蛋白。【方法】从大肠杆菌BAP 1染色体上扩增sfp基因,将pchE基因及串联的pchE与sfp基因分别构建到酵母-大肠杆菌穿梭质粒pXW55中,各自转化酿酒酵母BJ5464-npgA表达,经过亲和层析和离子交换层析纯化蛋白,利用HPLC检测细菌源与酵母源表达的PchE在体外重构生化反应中的催化活性。【结果】利用酿酒酵母表达系统可以获得高纯度的原核蛋白PchE。真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰PchE,合成中间产物HPT-Cys。【结论】在酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae BJ5464-npgA表达系统中,首次证明真菌源的泛酰化基因NpgA和细菌源的Sfp,均可泛酰化修饰细菌源的非核糖体肽合酶。比较酵母和细菌宿主的目标蛋白表达,证明酵母表达的巨大蛋白PchE的纯度更高,非特异性条带减少,推测酵母宿主可能更适合表达纯化功能性的巨型蛋白质。

低分子量树枝状聚乙烯亚胺-g-黄秋葵多糖作为基因药物合成载体的构建

通过合成设计,获得1种转染率高、细胞毒性低、生物相容性好的基因药物合成载体。用水煮醇沉法提取黄秋葵多糖,纯化,键合树枝状聚乙烯亚胺(bPEI,分子量为600、1 200 u),获得bPEI-g-黄秋葵多糖复合物,并对复合物进行系列理化生表征。1HNMR结果表明复合物合成成功;凝胶阻滞电泳结果表明,在复合物与质粒DNA重量比在5∶1时,复合物能与质粒DNA牢固结合,且在投射电镜下观察看到,复合物包裹质粒DNA成直径约为200 nm的核状;细胞毒性试验表明,该复合物毒性远低于PEI-25 ku,而细胞转染效率试验结果表明,该复合物转染效率较高,当重量比为70∶1时,与PEI-25 ku接近。说明bPEI-g-黄秋葵多糖复合物是一种高转染、低毒、生物兼容的基因药物合成载体。

玻璃珠表面修饰氨基的新型固相合成载体的制备

以玻璃珠为基质,通过NH3/H2O2/H2O处理,完成表面羟基化修饰;再采用氨丙基三乙氧基硅烷的甲苯溶液处理,完成硅烷氨基化修饰羟基制得表面功能基团为氨基的新型固相合成载体(1),其氨基含量为8.9×10-3mmol·g-1。1与连接分子4-[4-(羟甲基)苯氧基]-甲基苯甲酸经过氨基与羧基缩合反应制得带连接臂的固相载体;再与Fmoc保护的甘氨酸反应和脱保护,成功地键合甘氨酸,充分证明1作为新型载体的可行性。

纳米脂合成载体固定化高原SBR池内微生物试验研究

高原平均温度较低，紫外辐射强度较大，舍氧量较低，高原气温日变化显著都是影响污水处理反应池内微生物的生长因素。从而大大提高了微生物的驯化培养，就针对这一问题我们采用纳米脂合成载体固定化微生物来培养其中微生物。

基于图像翻译的载体选择式图像隐写方案

针对基于载体选择的隐写算法存在的安全问题,提出了一种基于图像翻译的载体选择式图像隐写方案.发送方按载体选择的方法从图像库中选取秘密信息并得到含密图像,然后输入到跨域变换模型中进行跨域变换,生成跨域图像并传递给接收方;接收方将跨域图像输入到发送方,由线下传递的跨域变换模型中得到含密图像,然后依据映射关系库将含密图像逆向转化为秘密信息.实验结果表明,所提出的方案在容量、抗检测性和安全性方面均有明显提升.

新型非病毒载体聚乙烯亚胺介导基因转染参数的研究

聚乙烯亚胺是一种新型阳离子多聚物基因释放载体,可结合浓缩DNA,通过粘附内吞,进入细胞,使携带的质粒表达。本研究目的通过对聚乙烯亚胺各种转染参数的测定,为合成以聚乙烯亚胺为骨架的人工载体积累数据。方法:本研究利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的pSVβ表达质粒、含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP质粒转染Cos-7细胞,通过组织化学法测定细胞抽提产物中β半乳糖甙酶的表达量、流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例,来测定影响转基因效率的各种参数。结果:在培养液中,6μg/ml聚乙烯亚胺作用24h,NIH 3T3细胞生存率为64.2%,7μg/ml聚乙烯亚胺细胞生存率为54.4%。电泳阻滞试验,聚乙烯亚胺在N/P比在3.0以上方可完全结合DNA。溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率。培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率。作为配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒,HEPES缓冲液优于生理盐水,生理盐水优于5%葡萄糖。配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒中加入Mg2+降低转染效率。聚乙烯亚胺转染效率优于SuperFectTM(断裂型树突状多聚物),而毒性低于SuperFectTM。结论:本研究首次报道了聚乙烯亚胺与DNA结合配伍的N/P比计算公式,N/P=7.75×b/c,这里b是PEI的质量(μg),c是质粒的质量(μg);PEI的工作终浓度应≤6μg/ml。通过体外细胞试验证明,聚乙烯亚胺是一种有效的真核细胞转染剂和人工合成基因载体的骨架。

聚乙烯亚胺载体介导的基因转移

目的 :探讨以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒载体在基因转染中的影响因素。方法 :利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的 p SVβ表达质粒 ,含绿色荧光蛋白报告基因的 p EGFP质粒转染 Cos- 7细胞 ,通过组织化学法测定细胞抽提产物中βgal的表达量和流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例 ,来测定影响转基因效率的各种参数。结果 :在培养液中 ,6 mg/ L聚乙烯亚胺作用 NIH 3T3细胞 2 4 h,细胞生存率为 6 4.2 % ,7mg/ L时细胞生存率为 5 4.4 %。聚乙烯亚胺在 N/ P比 3.0以上方可完全结合 DNA。溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率 ;培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率。作为配制聚乙烯亚胺 / DNA复合物的溶媒 ,HEPES缓冲液和生理盐水优于 2 78mmol/ L葡萄糖。在配制聚乙烯亚胺 / DNA复合物的溶媒中加入 Mg2 +可降低转染效率。结论 :通过体外细胞试验证明 。

液相组合合成研究进展

综述了近年来液相组合合成的研究进展,主要包括液相组合合成法(LPCS),氟合成,树状载体组合合成及高分子辅助试剂在液相组合合成中的应用等。

低分子量聚乙烯亚胺作为转基因载体在肿瘤基因治疗中的应用

目的构建一种以4臂聚乙二醇(4arm PEG)为核心的串联小分子聚乙烯亚胺(PE I)的聚合物,并考察其在肿瘤基因治疗中的应用。方法应用N,N’-羰基二咪唑(N,N-’C arbony ld iim idazo le,CD I)和3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(N-Succ in im idy l-3-(2-pyridy ld ith io)]prop ionate,SPDP)作为化学连接试剂,合成4arm PEG-PE I2000以及4arm PEG-PE I2000-M C 11,1H-NM R进行化学表征,凝胶电泳阻滞实验观察聚合物对质粒DNA的浓缩,M TT法检测聚合物的毒性,H epG 2细胞体外转基因实验确定4arm PEG-PE I2000和4arm PEG-PE I2000-M C 11的转基因能力以及M C 11的作用。结果成功合成4arm PEG-PE I2000和4arm PEG-PE I2000-M C 11,4arm PEG-PE I2000在N/P比为3时能够成功浓缩质粒DNA,毒性低,N/P比为30的时候,在H epG 2细胞中的转基因效率是PE I2000的5倍,连接上配体M C 11后,其转基因效率可以增加1倍,游离M C 11可以有效抑制4armPEG-PE I2000-M C 11的转基因效率。结论4arm PEG-PE I2000具有低毒、高转基因效率,连接配体M C 11后,可成为一个实用的转基因载体。

人工病毒载体

基因传递十分复杂 ,使用简单的载体分子难以完成。模拟病毒的重要性质 ,设计合成多组分载体。有些解决方法 ,如递送细胞锚定分子或正常功能的内源性核输入机制是直接拷贝自细菌和病毒的作用过程 ;另一些方法具有原创性 ,如由去污剂二聚体化进行单分子基因组浓缩 ,或由质子吸附作用引发核内体的破裂 ,这些效应是天然的细胞侵袭者所不具备的。所有这些功能组分有待装配成一种独特的超分子系统 ,即“人工病毒”。

纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展

利用纳米材料构建的纳米基因载体在植物遗传转化领域具有特殊的优越性,已成功应用于多种植物的遗传转化。主要阐述了纳米基因载体的特征、分类,综述了无机纳米基因载体、天然高分子纳米基因载体、人工合成高分子纳米基因载体在植物遗传转化中的应用进展,并对纳米基因载体在植物遗传转化领域的应用前景进行了展望。

简谈氨合成催化剂的研究进展

90多年来,国内外学者对氨合成催化剂的研究投入了大量的精力。氨合成工业是大吨位、高能耗、低效益的产业。衡量氨合成工业优劣的标准不是产品氨的质量,而是其能耗的高低,而催化剂的使用在降低能耗方面起着至关重要的作用。

抗侵袭性真菌感染药物递送系统研究进展

目前用于治疗侵袭性真菌感染(IFI)的一线药物如两性霉素B、氟康唑和伊曲康唑等存在水溶性差、生物利用度低、毒副作用强等缺点,将药物与递送系统相结合,使其能够更有效地到达感染部位,是提高传统抗真菌药物治疗效果和安全性的良好策略。合成及仿生载体极大地促进了抗真菌药物靶向递送系统的发展。合成载体递药系统如脂质体、纳米粒、聚合物胶束、微球等,能改善抗真菌药物的理化性质、延长其血液循环时间、提高靶向性和降低毒副作用;细胞膜仿生载体递药系统如巨噬细胞膜、红细胞膜包裹递药系统等,保留了体细胞的膜结构,用来包载抗真菌药物能赋予其各种生物功能和特异靶向性,表现出更好的生物相容性和更低的毒性。本文就不同类型的抗真菌药物递送系统在治疗IFI方面的应用进行综述,同时展望了新型仿生载体在抗真菌药物递送方面的广阔前景。

水稻种子相关细菌的系统发育分析与促生能力评价

对15株分离自水稻冀粳14号(90-3)的种子表面及其内生细菌进行了多功能筛选评价和16S rRNA系统发育分析。结果表明,供试菌株都能够溶解无机磷,不能分解有机磷;筛选获得6株具有明显分泌植物生长素吲哚-3-乙酸(IAA)能力的菌株;12株菌株明显产生铁载体,占所测菌株总数的80%,其中7株铁载体产量达到中等水平,通过16S rRNA基因系统发育及聚类分析,供试菌株聚为8个类群,分别属于Rhizobium、Citrobacter、Xanthomonas、Psedomonas、Bacillus、Pantoea、Microbacterium和Moraxella属。

小鼠SFRP-2基因的克隆及重组腺病毒制备

目的构建小鼠secretedfrizzled-related protein-2(SFRP-2)全基因的重组腺病毒表达系统。方法采用基因工程技术,将SFRP-2基因片段克隆入穿梭质粒pAdTrack-CMV,然后在细菌内与pAdEasy-1进行同源重组,经脂质体转染293细胞包装并扩增腺病毒颗粒。体外原代培养小鼠子宫内膜基质细胞,转染制备的腺病毒颗粒,并用Western blot法检测SFRP-2蛋白的表达。结果构建的小鼠SFRP-2重组腺病毒载体的效价达到5.6×1012pfu/mL,转染原代培养的小鼠子宫内膜基质细胞48h后,有SFRP-2蛋白的明显表达。结论成功构建含小鼠SFRP-2全基因的重组腺病毒载体。