重组人载脂蛋白AⅠ米兰突变体在酵母中的分泌表达

将重组质粒pPIC9K-apoAⅠ-milano用BglⅡ酶切后转化Pichia pastorisGS115菌株,筛选得到G418高抗性转化子,经甲醇诱导和摇瓶发酵,用SDS-PAGE与Western blot检测上清液,发现有明显的重组人载脂蛋白AⅠ米兰突变体(rAIM)表达,但其分子量比正常蛋白小.对酵母工程菌的摇瓶发酵条件进行优化后,rAIM表达水平得到提高,约为70 mg/L发酵液,其中正常大小的rAIM所占的比例约为80%.采用冷丙酮沉淀法初步纯化了酵母工程菌发酵液中的rAIM,并验证其有磷脂结合能力.

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的高表达

用RT-PCR法从人肝总RNA库中克隆出人载脂蛋白AI的cDNA序列,再通过重叠PCR将载脂蛋白AI的第179位精氨酸密码子突变成半胱氨酸密码子,即载脂蛋白AI米兰突变体基因。将此目的基因克隆至表达载体pQE30,重组质粒转化JM109宿主菌,经表达试验筛选出高表达克隆;工程菌经诱导后表达出含6个氨基酸前肽的载脂蛋白AI米兰突变体。表达产物主要以可溶形式存在,但也有部分为包涵体。

人载脂蛋白A-Ⅰ半胱氨酸突变体的二级结构和脂质结合能力的比较

为探讨人载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ,apolipoproteinA-Ⅰ)α螺旋不同位点的半胱氨酸突变后,对蛋白二级结构和脂质结合能力的影响,利用定点诱变技术构建apoA-Ⅰ的天然半胱氨酸突变体apoA-ⅠMilano(R173C),及其它α螺旋片段上的半胱氨酸突变体,分别为apoA-Ⅰ(S52C),apoA-Ⅰ(N74C),apoA-Ⅰ(L107C),apoA-Ⅰ(K129C),和apoA-Ⅰ(L195C).观察比较各种野生型及突变apoA-Ⅰ单体蛋白的α螺旋含量和二级结构稳定性及其脂质结合能力.结果显示,野生型apoA-Ⅰ,apoA-Ⅰ(S52C),apoA-Ⅰ(N74C),apoA-Ⅰ(L107C),apoA-Ⅰ(K129C),apoA-ⅠMilano和apoA-Ⅰ(L195C)的α螺旋含量分别为54±4%,49±4%,50±2%,51±6%,56±4%,52±3%,和54±1%,各种蛋白的α螺旋含量无显著性差异(P>0.05).野生型apoA-Ⅰ的变性标准自由能(ΔG0D)为10.5kJ/mol;apoA-Ⅰ(S52C)和apoA-ⅠMilano的ΔG0D比野生型低2.1kJ/mol;而apoA-Ⅰ(K129C)的ΔG0D比野生型apoA-Ⅰ高1.6kJ/mol.与野生型apoA-Ⅰ相比,apoA-Ⅰ(K129C)和apoA-Ⅰ(L195C)两个突变体与脂质结合能力明显下降(P<0.05),而其它半胱氨酸突变体(包括apoA-ⅠMilano)在脂质结合动力学方面与野生型apoA-Ⅰ无明显差异.以上结果提示,不同位点发生的半胱氨酸突变对apoA-Ⅰ单体蛋白的α螺旋含量无明显影响,但对蛋白的二级结构稳定性和脂质结合能力影响不尽相同.

重组人载脂蛋白AI米兰突变体在大肠杆菌中的可溶性表达

载脂蛋白AI米兰突变体(apoliproteinA_I_Milano ,AIM)是载脂蛋白AI的天然突变体,具有比载脂蛋白AI更强的抗动脉粥样硬化症的作用。将AIM基因N_末端的氨基酸密码子优化后,克隆至表达载体pET2 2b ,重组质粒转化BL2 1(DE3)宿主菌,用IPTG诱导表达。AIM以可溶形式表达,约占菌体总蛋白的38%。表达产物经ButylSepharose 4F .F疏水层析和QSepharoseH .P .阴离子交换层析后,再用Vivaspin2 0 (30 0 0 0MW)进行超滤,AIM单体的纯度达95 %以上。AIM单体与脂结合活性表明,AIM单体结合脂的速度比apoA_I慢,但结合脂的量比apoA_I高。这项研究为AIM的结构和功能,特别是临床应用研究奠定了基础。

高效表达AIM工程菌的发酵培养基及发酵条件优化

为了进一步提高工程菌的载脂蛋白AI米兰突变体(AIM)的表达量,降低发酵成本,通过碳氮源优化实验并结合正交实验筛选出该工程菌产AIM的最适培养基为(g/L):蔗糖10,酵母粉10,硫酸铵6和NaCl 10;最适发酵条件为:装液量30 mL,接种量8%,诱导时机A600 1.0,诱导剂浓度0.8 mmol/L,诱导时间6 h.在此优化的条件下,AIM的表达量为2.26 g/L,是未优化条件下的1.58倍.