EGFR基因T790M突变COLD-PCR扩增体系的Tc值筛选

目的筛选表皮生长因子受体(EGFR)基因T790M突变PCR扩增体系的Tc值并初步建立具T790M突变富集效果的低变性温度下的复合聚合酶链反应(COLD-PCR)体系,同时探讨Tc值的筛选策略以及注意事项。方法以肺癌MSTO-211H、NCI-H1975细胞为T790M突变野生型和突变型标准样品,通过目标片段关键变性温度筛选实验、COLD-PCR反应模式比较实验以及Tc值的验证实验,确定COLD-PCR体系的Tc值并初步验证其效果。结果本实验体系T790M突变的目的扩增片段关键变性温度低于野生型片段,据此体系反应模式选择为快速COLD-PCR反应模式,同时确定Tc值为89.6℃,验证实验显示本体系可检出1%的T790M突变,较常规PCR提高5倍。至此T790M突变富集COLD-PCR扩增体系已成功建立。结论成功完成体系Tc值的筛选并建立T790M突变富集COLD-PCR扩增体系。

TaqMan探针结合COLD-PCR原理定量检测JAK2 V617F突变率研究

目的建立在外周血基因组DNA中定量检测JAK2V617F突变率的方法。方法应用TaqMan/MGB探针技术,结合较低变性温度下复合扩增聚合酶链反应(COLD-PCR)基因扩增原理,采用Real-Time PCR分析系统,通过JAK2V617F突变率和其循环阈值(Ct值)的标准曲线,建立TaqMan-COLD-PCR测定方法,并对9例骨髓增殖性疾病(MPD)患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率进行检测,探讨其应用价值。结果建立的TaqMan-COLD-PCR方法检测JAK2V617F突变率的检测下限为0.1%,100%-0.1%的JAK2V617F突变率与其测定的Ct值间呈明显的线性关系。对9例MPD患者外周血基因组DNA中JAK2V617F突变率检测显示,其中6例患者的JAK2V617F突变阳性,突变率范围为18.5%-50.9%,经测序确认全部符合。结论 TaqMan-COLD-PCR方法可高灵敏度、定量检测外周血中JAK2V617F突变率。该方法将明显提高MPD疾病的诊断灵敏度,并有助于疾病治疗过程中治疗效果的监测。

中国人结直肠癌454例K-ras基因突变状态分析

目的:分析结直肠癌(colorectal cancer,CRC)患者肿瘤组织或血浆样本中K-ras基因突变状态,以促进针对表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的靶向药物(如西妥昔单抗和帕尼单抗等)应用于CRC个体化治疗。方法:采用低变性温度下复合扩增聚合酶链反应(coamplication at lower denaturation temperature PCR,COLD-PCR)再结合测序的方法,定点分析431例中国CRC患者的肿瘤组织和另外23例CRC患者的血浆中K-ras基因序列结构,计算K-ras基因突变率。对不同CRC样本及不同年龄患者群的K-ras基因突变频率,采用χ2检验进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:在431例CRC患者的肿瘤组织中,K-ras基因发生突变的总体频率为25.29%;其中2种主要形式的突变为G12D(第12密码子由甘氨酸突变为天冬氨酸)和G13D(第13密码子由甘氨酸突变为天冬氨酸),它们发生的频率分别是12.99%和6.26%。而在23例CRC患者血浆中检出K-ras基因突变的发生频率为21.74%,其与肿瘤组织中的总突变率无明显差异(P>0.05)。在60岁及以上的CRC患者中,检测出任一种K-ras基因突变的可能频率为37.94%,显著高于60岁以下CRC患者的检出率(7.30%,P<0.01)。结论:采用COLD-PCR扩增再结合测序的方法检测K-ras基因突变状态时,在缺乏CRC肿瘤组织的情况下可以采用血浆样本来代替。另外,鉴于60岁及以上的CRC患者更易发生K-ras基因突变,建议对这些老年患者在治疗前须先常规检测K-ras基因突变状态。